Lgr5、β-catenin在卵巢上皮性癌組織中的表達及對SKOV3細胞增殖遷移的影響*

張 展，朱 海，宋 華，王金銘

鄭州大學第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052

Lgr5、β-catenin在卵巢上皮性癌組織中的表達及對SKOV3細胞增殖遷移的影響*

張 展△，朱 海，宋 華，王金銘

鄭州大學第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052

△女，1959年9月生，博士，教授，研究方向：生殖免疫，E-mail：zhangzhanzdsfy@126.com

Lgr5；Wnt/β-catenin信號通路；卵巢上皮性癌；細胞增殖；細胞遷移；SKOV3細胞

目的：探討G蛋白偶聯(lián)受體家族Lgr5和β-catenin在卵巢上皮性癌中的表達及對SKOV3細胞增殖和遷移能力的影響。方法：收集卵巢正常、良性腫瘤及上皮性癌組織標本各30例，采用免疫組化法檢測Lgr5和β-catenin蛋白的表達情況。用Lgr5 shRNA、NC shRNA轉染卵巢癌 SKOV3細胞，同時以未轉染細胞作空白對照，分別采用Western blot和實時熒光定量PCR法檢測3組細胞中l(wèi)gr5、β-catenin蛋白和mRNA的表達水平，分別采用CCK-8和劃痕實驗檢測3組細胞的增殖和遷移能力。結果：卵巢上皮性癌組織中Lgr5、β-catenin陽性表達率分別為63.3%(19/30)、83.3%(25/30)，二者表達水平均較良性腫瘤、正常卵巢組織升高(P<0.05),且兩者表達呈正關聯(lián)(rp=0.373,P=0.028)。與空白對照組、NC shRNA轉染組比較， Lgr5 shRNA轉染組SKOV3細胞中Lgr5、β-catenin蛋白和mRNA的表達均顯著降低(P<0.05)，細胞的增殖能力和遷移能力顯著降低(P<0.05)。結論：Lgr5可能通過增強Wnt/β-catenin信號通路參與卵巢癌細胞增殖、遷移能力的調(diào)控。

卵巢上皮性癌是常見的婦科惡性腫瘤，致死率居婦科惡性腫瘤首位，嚴重威脅婦女的生命健康，其發(fā)病機制尚不清楚;解決早期診斷，控制復發(fā)、轉移和化療耐藥等問題成為卵巢上皮性癌研究的熱點[1-2]。Lgr5(leucine-rich repeat-containing g-protein coupled receptor 5)，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，在胚胎發(fā)育和成體干細胞的自我更新及維持中起重要作用，是多種組織和成體干細胞的標志物[3-5]。研究[6-9]表明，Lgr5可以加速細胞周期，促進細胞增殖，在許多惡性腫瘤組織中(如胃腸道腫瘤、肝癌、基底細胞癌、宮頸癌等)高表達，而正常組織中表達量較低。Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，其核心分子β-catenin的異常高表達可能參與了腫瘤干細胞的形成[10]，從而影響化療耐受、腫瘤的復發(fā)、轉移及預后[11]。近年來研究[12]發(fā)現(xiàn)，Lgr5在甲狀腺癌、宮頸癌中可能通過上調(diào)β-catenin的表達，促進腫瘤細胞的增殖和遷移能力。因此，作者對卵巢上皮性癌組織中Lgr5、β-catenin的表達以及沉默Lgr5基因?qū)β殉舶┘毎鸖KOV3增殖遷移能力的影響進行了觀察。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 通用型兩步法免疫組化試劑盒PV9000購于北京中杉金橋生物技術服務公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購于?？寺∩镏破饭?， 攜帶Lgr5 shRNA的綠色熒光標記質(zhì)粒購于蘇州吉瑪生物公司，轉染試劑Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司，Lgr5抗體購于美國Abcam公司，兔抗β-catenin抗體購于美國Cell Signaling公司，實時熒光定量PCR試劑購于日本東洋紡公司，CCK-8試劑盒購于日本同仁化學研究所。

1.2 卵巢上皮性癌組織中Lgr5和β-catenin蛋白表達的檢測 選取2014年至2015年鄭州大學第三附屬醫(yī)院病理確診的卵巢組織石蠟切片，其中正常卵巢組織30例，卵巢良性腫瘤組織30例，卵巢上皮性癌組織30例；患者術前均未接受任何放療、化療等輔助治療，臨床病例資料完整。采用SP兩步法免疫組化檢測Lgr5和β-catenin的表達，按PV9000試劑盒說明書進行脫蠟、水化、抗原修復、封閉等操作，滴加一抗在4 ℃環(huán)境下過夜，滴加二抗37 ℃孵育1 h，DAB顯色。結果判定：陽性細胞表現(xiàn)為胞漿棕褐色著色；20倍鏡下，每張切片隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，計算陽性細胞百分比。

1.3 沉默Lgr5對SKOV3細胞增殖遷移能力影響的觀察

1.3.1 實驗分組 SKOV3細胞由該課題組保存，在體積分數(shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中使用RPMI 1640培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10%胎牛血清)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。取對數(shù)生長期細胞，用2.5 g/L胰酶消化后以合適的細胞密度分3組接種于6孔板中，每組2孔，細胞長滿約50%時，采用脂質(zhì)體瞬時轉染法進行Lgr5 shRNA質(zhì)粒轉染，按轉染試劑說明書進行操作。同時設未轉染對照組和NC shRNA轉染組。轉染24 h后用倒置熒光顯微鏡觀察，高倍鏡(40×)下每孔隨機選取5個視野觀察。實驗重復3次。

1.3.2 Lgr5和β-catenin mRNA的檢測 轉染48 h后，采用實時熒光定量PCR法檢測3組細胞中Lgr5和β-catenin mRNA。Trizol法提取細胞總RNA，按照反轉錄及相關試劑說明進行操作，引物由金唯智生物有限公司合成，表達量采用2-ΔΔCT方法計算。Lgr5上游引物序列：5’-GACAAGGGAGACCTG GAGAA-3’，下游：5’-GAGAAGGACAAGAAAGCCA CA-3’；β-catenin上游引物序列：5’-GAGTGCTGAAG GTGCTATCTGTC-3’，下游：5’-CTGAACAAGAGTC CCAAGGAGA-3’；內(nèi)參β-actin上游引物序列：5’-AT GGTGGGAATGGGTCAGAAG-3’，下游：5’-TCTCCATG TCGTCCCAGTTG-3’。

1.3.3 Lgr5和β-catenin蛋白的檢測 轉染48 h后，采用Western blot法檢測3組細胞中Lgr5和β-catenin蛋白。用RIPA提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。蛋白上樣量40 μg，80 V恒壓30 min后轉120 V恒壓電泳約120 min，轉膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(稀釋度11 000)4 ℃過夜，TBS洗滌后室溫孵育二抗(稀釋度14 000)1.5 h，洗滌后用Odyssey CLx成像系統(tǒng)檢測各條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.3.4 增殖能力檢測 將SKOV3細胞接種于96孔板中，每孔4 000～6 000個細胞、100 μL培養(yǎng)液，過夜貼壁后按1.3.1分組處理，每組6個復孔，48 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃避光孵育，2 h內(nèi)每30 min在波長450 nm處檢測吸光度(A)，計算細胞增殖抑制率。以不做任何處理的孔為增殖對照，以不含細胞而含100 μL培養(yǎng)液和10 μL CCK-8試劑的孔為試劑對照。增殖抑制率=(A增殖對照-A實驗組)/(A增殖對照-A試劑對照)×100%。

1.3.5 遷移能力檢測 采用劃痕實驗。將SKOV3細胞接種于6孔板，按1.3.1分組處理，每組2孔。24 h后用10 μL移液槍槍頭在單層細胞上呈“一”字劃痕，0、24、48 h后在倒置顯微鏡下每孔隨機選擇3個視野觀察并拍照，用Image J軟件測量圖片中細胞劃痕的長度。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學處理。3組卵巢組織中Lgr5和β-catenin陽性表達率的比較采用χ2檢驗，卵巢上皮性癌組織中Lgr5和β-catenin表達的關聯(lián)性分析采用列聯(lián)系數(shù)，3組細胞Lgr5、β-catenin蛋白和mRNA表達水平、增殖抑制率及劃痕間距的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 卵巢上皮性癌組織中Lgr5和β-catenin蛋白的表達 Lgr5、β-catenin蛋白在卵巢上皮性癌組織中的陽性表達率高于正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織，見圖1和表1。卵巢上皮性癌組織中Lgr5和β-catenin蛋白的表達呈正關聯(lián)，見表2。

1：卵巢上皮性癌組織；2：卵巢良性腫瘤組織；3：正常卵巢組織。圖1 3種卵巢組織中Lgr5(A)和β-catenin(B)蛋白的表達(×40)

表1 卵巢上皮性癌組織中Lgr5和β-catenin蛋白的表達 例(%)

*:與正常卵巢、卵巢良性腫瘤組織比較，P<0.016。

表2 卵巢上皮性癌組織中Lgr5和β-catenin表達的關聯(lián)性 例

rp=0.373，P=0.028。

2.2 沉默Lgr5基因后SKOV3細胞的表現(xiàn)

2.2.1 3組細胞中Lgr5、β-catenin蛋白和mRNA的表達 見圖2和表3。Lgr5 shRNA轉染組細胞中Lgr5、β-catenin蛋白和mRNA的表達均較空白對照組和NC shRNA轉染組降低。

1、2：NC shRNA轉染組；3、4：Lgr5 shRNA轉染組；5、6：未轉染對照組。圖2 3組SKOV3細胞中Lgr5和β-catenin蛋白的表達

表3 3組SKOV3細胞中Lgr5和β-catenin的表達

*:與未轉染對照組比較，P<0.05；#：與NC shRNA轉染組比較，P<0.05。

2.2.2 3組細胞的增殖、遷移能力 見圖3、表4。

上排：Lgr5 shRNA轉染組；中排：NC shRNA轉染組；下排：未轉染對照組。圖3 3組細胞劃痕實驗表現(xiàn)

表4 3組細胞增殖抑制率和劃痕間距的比較

*:與未轉染對照組比較，P<0.05；#：與NC shRNA轉染組比較，P<0.05。

3 討論

卵巢上皮性癌是女性常見的惡性腫瘤之一，由于缺少有效的早期診斷方法，其5 a生存率較低，因此探討其發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制一直是研究的熱點。Lgr5在胚胎干細胞、多種腫瘤細胞中高表達，可能參與調(diào)控細胞周期，在細胞的增殖過程中發(fā)揮重要作用[13-15]。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育中具有重要作用，亦與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關。近年來有報道，在甲狀腺癌及宮頸癌組織中，Lgr5可能通過Wnt/β-catenin信號通路影響癌細胞的增殖和遷移能力[16]。因此作者對卵巢上皮性癌組織中Lgr5和β-catenin蛋白的表達情況，以及沉默Lgr5對卵巢癌SKOV3細胞中β-catenin蛋白表達及細胞增殖遷移能力的影響進行了觀察。

結果顯示，在組織水平上，Lgr5與β-catenin在卵巢上皮性癌中的表達均較正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織有顯著升高，且Lgr5與β-catenin表達呈正關聯(lián)，提示Lgr5和β-catenin可能協(xié)同在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，并有潛力作為生物標志物應用于卵巢上皮性癌的診斷。

結果還顯示，在細胞水平上，轉染Lgr5 shRNA后，SKOV3細胞中Lgr5 mRNA及蛋白表達明顯降低，提示成功地靶向抑制了Lgr5基因的表達。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，隨著Lgr5基因被靶向抑制，SKOV3細胞中β-catenin mRNA及蛋白表達亦顯著降低，提示Lgr5可能作為上游基因調(diào)控β-catenin的表達。β-catenin是經(jīng)典Wnt致癌通路中的核心物質(zhì)，推測Lgr5可能通過Wnt/β-catenin信號通路參與SKOV3細胞的功能調(diào)控。

在細胞功能方面，CCK-8檢測結果顯示，靶向抑制Lgr5表達后SKOV3細胞的增殖抑制率顯著升高，劃痕實驗中劃痕間距增加，說明靶向抑制Lgr5表達后SKOV3細胞增殖能力和遷移能力均顯著下降，提示Lgr5可能參與了SKOV3細胞增殖和遷移能力的調(diào)控。有文獻[6]報道Lgr5高表達可能是腫瘤細胞異常增殖、細胞周期縮短的原因之一。該實驗結果與上述文獻報道相符。

總之，該研究結果表明Lgr5和β-catenin均在卵巢上皮性癌組織中特異性高表達，且呈正關聯(lián)；Lgr5可能通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)卵巢癌SKOV3細胞中β-catenin的表達，從而影響細胞的增殖和遷移能力，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。該研究結果為闡明卵巢上皮性癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制提供了實驗依據(jù)，為卵巢癌的防治提供了新思路。

[1]薛景戈,任琛琛,楊立,等.卵巢上皮性癌組織中IGF-1,E-cad蛋白的表達以及IGF-1對卵巢癌SKOV3細胞E-cad表達和侵襲力的影響[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2016,51(3):396

[2]劉星爍,李紅雨,趙書君,等.上皮性卵巢癌組織中 miR-126、EGFL7的表達與微血管密度的檢測[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2015，50(2):244

[3]NAKATA S,PHILLIPS E,GOIDTS V.Emerging role for leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptors Lgr5 and LGR4 in cancer stem cells[J].Cancer Manag Res,2014,6:171

[4]PAIK DY,JANZEN DM,SCHAFENACKER AM,et al.Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube: a site for injury and serous cancer initiation[J].Stem Cells,2012,30(11):2487

[5]PLAKS V,BRENOT A,LAWSON DA,et al.Lgr5-expressing cells are sufficient and necessary for postnatal mammary gland organogenesis[J].Cell Rep,2013,3(1):70

[6]SNYDER JC,ROCHELLE LK,MARION S,et al.Lgr4 and Lgr5 drive the formation of long actin-rich cytoneme-like membrane protrusions[J].J Cell Sci,2015,128(6):1230

[7]FLESKEN-NIKITIN A,HWANG CI,CHENG C,et al.Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche[J].Nature,2013,495(7440):241

[8]HE S,ZHOU H,ZHU X,et al.Expression of Lgr5, a marker of intestinal stem cells, in colorectal cancer and its clinicopathological significance[J].Biomed Pharmacother,2014,68(5):507

[9]LIU SL,GONG ZY,CHEN MR,et al.Lgr5-positive cells are cancer stem cells in skin squamous cell carcinoma[J].Tumor Biol,2014,35(11):11605

[10]HASEBE T,FUJIMOTO K,KAJITA M,et al.Thyroid hormone activates Wnt/β-catenin signaling involved in adult epithelial development during intestinal remodeling inXenopuslaevis[J].Cell Tissue Res,2016,365(2):309

[11]LI B,CAI S,ZHAO Y,et al.Nerve growth factor modulates the tumor cells migration in ovarian cancer through the WNT/β-catenin pathway[J].Oncotarget,2016,7(49):81026

[12]MICHELOTTI G,JIANG X,SOSA JA,et al.Lgr5 is associated with tumor aggressiveness in papillary thyroid cancer[J].Oncotarget,2015,6(33):34549

[13]zAK M,VAN OORT T,HENDRIKSEN FG,et al.LGR4 and Lgr5 regulate hair cell differentiation in the sensory epithelium of the developing mouse cochlea[J].Front Cell Neurosci,2016,10(10):186

[14]CAPEL B.Ovarian epithelium regeneration by Lgr5(+) cells[J].Nat Cell Biol,2014,16(8):743

[15]SUN Y,JIA X,WU X.High expressions of Lgr5 and ALDH1 in primary epithelial ovarian cancer correlate with advanced tumor stage and grade as well as poor prognosis of the patients[J].Gynecol Obstet Invest,2015,8(1):162

[16]AMSTERDAM A,RAANAN C,SCHREIBER L,et al.Localization of the stem cell markers Lgr5 and Nanog in the normal and the cancerous human ovary and their inter-relationship[J].Acta Histochem,2013,115(4):330

(2016-12-28收稿 責任編輯王 曼)

Expressions of Lgr5 and β-catenin in epithelial ovarian cancer tissue and the effect on cell proliferation and migration of SKOV3 cells

ZHANGZhan,ZHUHai,SONGHua,WANGJinming

DepartmentofGynaecology,theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Lgr5;Wnt/β-catenin signaling pathway;epithelial ovarian cancer;cell proliferation;cell migration;SKOV3 cells

Aim: To investigate the expressions of G protein coupled receptor Lgr5 and β-catenin in ovarian epithelial cancer tissue and the effect on the cell proliferation and migration of SKOV3 cells.Methods: The expressions of Lgr5 and β-catenin protein in tissue from 30 cases of ovarian cancer and 30 cases of ovarian benign tumor, as well as 30 normal ovarian tissue samples were detected by immunohistochemistry. The SKOV3 cells were transfected with Lgr5 shRNA, and those transfected with NC shRNA and without transfection were the control. The protein and mRNA expressions of Lgr5 and β-catenin in SKOV3 cells were detected by Western blot and qRT-PCR,respectively; cell proliferation was detected by CCK-8 assay and the cell migration was detected by scratch assay. Results: The positive rates of Lgr5 and β-catenin in epithelial ovarian cancer tissue were 63.3%(19/30) and 83.3%(25/30), which were higher when compared with the normal ovarian tissue and ovarian benign tumor tissue(P<0.05).There was positive correlation between the expressions of Lgr5 and β-catenin in epithelial ovarian cancer tissue(rp=0.373,P=0.028). Compared with the two control groups, the protein and mRNA expressions of Lgr5 and β-catenin in SKOV3 cells transfected with Lgr5 shRNA were significantly lower(P<0.05), and proliferation and migration capacity were significantly lower(P<0.05).Conclusion: Lgr5 may regulate the proliferation and migration of SKOV3 cells by enhancing the signal pathway of Wnt/β-catenin.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.008

*河南省科技廳基礎與前沿項目 152300410190

R737.31