SPK1基因轉(zhuǎn)染的UCMSC移植對EAE小鼠的治療作用*

許春陽，薛 鵬，花琳琳，李金鳳，劉新珊，張達(dá)矜，徐志秀，王姍姍，尹紅蕾，張 輝，

張玉鎮(zhèn)2)，王運(yùn)良1)#，段海峰5)#

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014 2)中國人民解放軍第148醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 山東淄博 255300 3)首都醫(yī)科大學(xué)三博腦科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 北京 100093 4)海軍總醫(yī)院海戰(zhàn)傷研究所 北京 100037 5)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所 北京 100850

SPK1基因轉(zhuǎn)染的UCMSC移植對EAE小鼠的治療作用*

許春陽1)，薛 鵬1)，花琳琳1)，李金鳳2)，劉新珊3)，張達(dá)矜4)，徐志秀1)，王姍姍2)，尹紅蕾2)，張 輝2)，

張玉鎮(zhèn)2)，王運(yùn)良1)#，段海峰5)#

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014 2)中國人民解放軍第148醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 山東淄博 255300 3)首都醫(yī)科大學(xué)三博腦科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 北京 100093 4)海軍總醫(yī)院海戰(zhàn)傷研究所 北京 100037 5)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所 北京 100850

#通信作者：王運(yùn)良，男，1964年11月生，博士，教授，研究方向：神經(jīng)病學(xué)，E-mail：wangyunliang81@163.com；段海峰，男，1973年6月生，博士，教授，研究方向：白血病的干細(xì)胞治療，E-mail：duanhf0720@163.com

多發(fā)性硬化;臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞;鞘氨醇激酶1;實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；小鼠

目的：觀察鞘氨醇激酶1(SPK1)基因轉(zhuǎn)染的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSC)移植對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠的療效。方法：將C57BL/6小鼠分為對照組(12只)、EAE組、UCMSC組和UCMSC-SPK1組；后3組進(jìn)行免疫誘導(dǎo)以制備EAE模型，每組11只。以第一次注射抗原當(dāng)日為第0天，UCMSC組和UCMSC-SPK1組小鼠分別在免疫后第14、21、28天通過尾靜脈注射UCMSC和UCMSC-SPK1，對照組和EAE組注射同等體積的生理鹽水。每日采用雙盲法進(jìn)行小鼠神經(jīng)功能缺損評分；第33天，ELISA法檢測外周血IFN-γ、TNF-α、IL-17和L-4水平，分別采用HE和Fast-blue(LFB)染色觀察并進(jìn)行脊髓炎性細(xì)胞浸潤評分、脫髓鞘評分，免疫組化法檢測脊髓GFAP和MBP的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和NK細(xì)胞比例。結(jié)果：與EAE組比較，UCMSC-SPK1組和UCMSC組小鼠神經(jīng)功能缺損評分、脊髓炎性細(xì)胞浸潤評分和脫髓鞘評分降低，脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例升高、NK細(xì)胞比例降低；UCMSC-SPK1組變化更為顯著(P<0.05)；UCMSC-SPK1組脊髓GFAP表達(dá)較EAE組下降，MBP表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，外周血IFN-γ、TNF-α、IL-17水平降低，IL-4水平升高(P<0.05)。結(jié)論：UCMSC-SPK1移植能較UCMSC更為顯著地修復(fù)EAE小鼠神經(jīng)功能損傷。

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性、炎性脫髓鞘性疾病。MS的病理特征主要表現(xiàn)為慢性髓鞘脫失，伴隨著軸突的損害和神經(jīng)元的丟失[1-2]。目前，MS的病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確，常見的治療方法有短期、大劑量的糖皮質(zhì)激素脈沖療法，免疫調(diào)節(jié)治療(如干擾素β、醋酸格拉默和米托蒽醌)等。這些方法雖然可以減緩MS的進(jìn)展，降低該病的復(fù)發(fā)率，但長期應(yīng)用往往會導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)，例如抑郁、感染、心臟毒性、惡心和貧血等[3]。因此，尋找療效好、副作用低的藥物迫在眉睫。

臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cell,UCMSC)具有倫理一致性、易獲得性、低免疫原性、強(qiáng)大的體外擴(kuò)增和多譜系分化能力等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)開始用于治療一些自身免疫性疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病和腦脊髓炎等，并取得了一定的療效[4-5]。 鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phospate,S1P)作為一種鞘氨醇磷酸化后的產(chǎn)物，主要由鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SPK1)催化產(chǎn)生。研究表明，S1P信號途徑在體內(nèi)許多生理和病理生理過程中發(fā)揮重要作用。S1P受體調(diào)節(jié)劑芬戈莫德(FTY720)已在臨床上廣泛應(yīng)用于復(fù)發(fā)-緩解型MS的治療[6-7]。作者選用實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠作為模型，將攜帶SPK1基因的腺病毒感染UCMSC，觀察UCMSC-SPK1對EAE模型小鼠的療效，探討UCMSC-SPK1對MS的治療前景。

1 材料與方法

1.1 試劑、抗體和細(xì)胞 兔抗多克隆抗體膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)均購自Sigma公司，SPK1多克隆抗體購自美國Abcam公司，熒光單克隆抗體抗鼠PE-NK-1.1、APC-CD3、FITC-CD4、PE-CD25購自美國Biolegend公司。ELISA檢測試劑盒、流式細(xì)胞儀購自Biosciences公司。UCMSC和攜帶SPK1基因的腺病毒(Ad-SPK1)均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所三室饋贈，參考文獻(xiàn)[8-9]制備UCMSC-SPK1，Ad-SPK1最佳感染復(fù)數(shù)為200，Western blot法檢測證實(shí)UCMSC-SPK1高表達(dá)SPK1。

1.2 EAE模型構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組 SPF級健康雌性C57BL/6小鼠48只，體重16～20 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。根據(jù)體重隨機(jī)選取12只作為對照；余36只小鼠按照文獻(xiàn)[10-11]進(jìn)行免疫誘導(dǎo)以制備EAE模型，至發(fā)病高峰期(即誘導(dǎo)后第13天)，3只小鼠死亡，剩余33只隨機(jī)分為EAE組(11只)、UCMSC組(11只)和UCMSC-SPK1組(11只)。以第一次注射抗原當(dāng)日為第0天，UCMSC組和UCMSC-SPK1組小鼠分別在免疫后第14、21、28天通過尾靜脈注射5.5×106mL-1的UCMSC和UCMSC-SPK1 0.1 mL，對照組和EAE組注射同等體積的生理鹽水。

1.3 小鼠神經(jīng)功能缺損評分 每日監(jiān)測EAE臨床癥狀，并采用雙盲法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分(持續(xù)評分33 d)：不發(fā)病為0分，尾巴張力降低或輕度步態(tài)笨拙為1分，輕度后肢力量減弱為2分，后肢明顯力量減弱為3分，后肢癱瘓為4分，后肢癱瘓合并前肢力量減弱或?yàn)l死狀態(tài)為5分。

1.4 小鼠外周血中IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-17的檢測 第33天，每組11只小鼠眼球取血并收集于1.5 mL EP管中室溫靜置30 min，4 ℃12 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照ELISA試劑盒說明書檢測外周血中IFN-γ、TNF-α、IL-17及IL-4的含量。

1.5 小鼠脊髓組織學(xué)觀察 第33天，隨機(jī)從每組中抽取5只小鼠進(jìn)行脊髓組織學(xué)觀察。小鼠腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉麻醉，無菌條件下剖開胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室灌注生理鹽水至肝臟變白，然后改用40 g/L多聚甲醛灌注，立即取出脊髓浸入40 g/L多聚甲醛中后固定，石蠟包埋，5 μm厚切片，常規(guī)HE染色觀察脊髓炎性細(xì)胞浸潤、Fast-blue(LFB)染色觀察脫髓鞘改變。炎性細(xì)胞浸潤評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，沒有炎性細(xì)胞；1分，少數(shù)散在的炎性細(xì)胞；2分，炎性細(xì)胞聚集浸潤在血管的周圍；3分，廣泛的血管套形成并延伸入鄰近實(shí)質(zhì)區(qū)域，或?qū)嵸|(zhì)區(qū)域浸潤而無明顯的血管套形成。脫髓鞘評分標(biāo)準(zhǔn):0分：無髓鞘脫失；1分，1個小的脫髓鞘病灶；2分，2～3個脫髓鞘小病灶；3分，1～2個大的脫髓鞘病灶；4分，廣泛髓鞘脫失且脫髓鞘面積大于白質(zhì)總面積的20%。

1.6 小鼠脊髓GFAP和MBP的表達(dá) 第33天，取1.5制備的脊髓標(biāo)本切片檢測脊髓中GFAP和MBP的表達(dá)。石蠟切片脫蠟至水，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2孵育10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，置枸櫞酸鹽緩沖液中于微波爐里進(jìn)行抗原修復(fù)；切片自然冷卻后滴加GFAP(1500稀釋)和MBP(1100稀釋)兔多克隆抗體4 ℃過夜，PBS洗5 min×3次，滴加50 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min×3次；DAB顯色，鏡檢控制顯色，自來水終止；充分沖洗后蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。應(yīng)用BIO-RAD公司的Quantity One軟件進(jìn)行圖像分析。

1.7 小鼠脾臟NK-1.1、CD3、CD4、CD25的表達(dá) 第33天，取上述5只小鼠的脾臟研磨后制成單細(xì)胞懸液，加入PE-NK-1.1、APC-CD3、FITC-CD4、PE-CD25，4 ℃避光孵育30 min，然后用含體積分?jǐn)?shù)1%胎牛血清的PBS洗滌，收集1×106個細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀(Biosciences公司)進(jìn)行檢測，并用FlowJo

軟件(三星)分析數(shù)據(jù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。4組間各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠神經(jīng)功能評價 小鼠神經(jīng)功能缺損評分變化情況見圖1。對照組小鼠神經(jīng)功能正常。從第13天開始，余3組小鼠陸續(xù)顯現(xiàn)出EAE發(fā)病的跡象，主要表現(xiàn)為尾部運(yùn)動遲緩和后肢癱瘓，這些癥狀往往在第16～27天逐漸加重，出現(xiàn)一側(cè)肢體癱瘓或完全癱瘓，甚至瀕臨死亡；然而，第19～24天，UCMSC-SPK1和UCMSC組小鼠的神經(jīng)功能缺損評分較EAE組小鼠降低， UCMSC-SPK1組降低的更明顯。

圖1 小鼠神經(jīng)功能缺損評分

2.2 4組小鼠外周血中IFN-γ、TNF-α、IL-4及IL-17水平的比較 與對照組小鼠比較，EAE組小鼠血清IFN-γ、TNF-α和IL-17水平增加，IL-4水平降低；與EAE組和UCMSC組小鼠比較，UCMSC-SPK1組小鼠IFN-γ、TNF-α和IL-17水平降低，IL-4水平增加，且達(dá)對照組水平，見表1。

表1 4組小鼠外周血中IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-4水平的比較 ng/L

*：與對照組比較，P<0.05；#：與EAE組比較，P<0.05；△：與UCMSC組比較，P<0.05。

2.3 4組小鼠脊髓組織學(xué)變化 對照組小鼠脊髓組織學(xué)表現(xiàn)正常，未有炎性細(xì)胞浸潤，未發(fā)生脫髓鞘改變。與EAE組小鼠比較，UCMSC組和UCMSC-SPK1組小鼠炎性細(xì)胞浸潤、脫髓鞘程度明顯改善，并且UCMSC-SPK1組變化更明顯，見圖2、表2。

1～4：分別為對照組、EAE組、UCMSC組、UCMSC-SPK1組；A：HE染色；B：LFB染色。圖2 4組小鼠脊髓組織學(xué)表現(xiàn)(×100)

表2 3組小鼠脊髓炎性細(xì)胞浸潤和脫髓鞘評分的比較

*：與EAE組比較，P<0.05；#：與UCMSC組比較，P<0.05。

2.4 4組小鼠脊髓GFAP和MBP的表達(dá) 見圖3、表3。與對照組比較，EAE組小鼠脊髓中GFAP表達(dá)增加，MBP表達(dá)降低；與EAE組和UCMSC組比較，UCMSC-SPK1組GFAP表達(dá)明顯降低，MBP表達(dá)明顯升高，并達(dá)對照組水平。

2.5 4組小鼠脾臟NK細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例的比較 見表4。UCMSC和UCMSC-SPK1組小鼠脾臟NK細(xì)胞比例較EAE組降低，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例上升。

1～4：分別為對照組、EAE組、UCMSC組、UCMSC-SPK1組；A：GFAP；B：MBP。圖3 4組小鼠GFAP和MBP在脊髓中的表達(dá)(×100)

表3 免疫組化檢測EAE小鼠脊髓中GFAP和MBP表達(dá)的比較

*：與對照組比較，P<0.05；#：與EAE組比較，P<0.05；△：與UCMSC組比較，P<0.05。

表4 4組小鼠NK細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例 %

*：與對照組比較，P<0.05；#：與EAE組比較，P<0.05。

3 討論

近年來，MSCs移植作為一種新興的治療手段被廣泛用于MS的治療[12]。以往的研究[13]表明，經(jīng)UCMSC治療的MS患者復(fù)發(fā)率和EDSS得分顯著降低，且未發(fā)現(xiàn)有明顯的不良反應(yīng)。用攜帶IL-4基因的慢病毒轉(zhuǎn)染脂肪源MSC，其高水平表達(dá)IL-4，并有助于抑制MS發(fā)病過程中的炎性反應(yīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)，提示適當(dāng)?shù)幕蛐揎椏墒筂SC具有更多的生物活性，從而帶來更好的治療效果[14]。SPK1是體內(nèi)代謝產(chǎn)生S1P的關(guān)鍵酶，而S1P作為一種鞘脂類的代謝產(chǎn)物，在血管再生、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長和免疫細(xì)胞運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要作用。芬戈莫德(FTY720)作為一種S1P類似物，其治療性或預(yù)防性應(yīng)用能顯著減少EAE模型動物脊髓中淋巴細(xì)胞的浸潤，其作用機(jī)制主要是通過抑制初級和次級淋巴器官中淋巴細(xì)胞的溢出，降低外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)量，從而減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴細(xì)胞的浸潤[15]。因此，將二者結(jié)合起來治療MS有望取得較好的療效。

作者用攜帶SPK1基因的腺病毒轉(zhuǎn)染UCMSC，觀察了UCMSC-SPK1對EAE模型小鼠的干預(yù)效果。結(jié)果顯示， UCMSC-SPK1和UCMSC組小鼠神經(jīng)功能缺損評分較EAE組小鼠明顯降低，脊髓炎性細(xì)胞浸潤和脫髓鞘評分亦顯著降低，并且UCMSC-SPK1組變化更顯著；UCMSC-SPK1組小鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP表達(dá)較EAE組和UCMSC組降低，MBP表達(dá)升高。在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞作為一種主要的細(xì)胞類型影響著與EAE相關(guān)的行為學(xué)、組織學(xué)和生物化學(xué)的終端事件[16]。上述結(jié)果說明，UCMSC-SPK1對EAE小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的損傷有較UCMSC更為顯著的修復(fù)作用。

在MS/EAE發(fā)病過程中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在維持免疫耐受和調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[17-19]。該研究中，作者觀察到，EAE組小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例顯著降低，NK細(xì)胞比例明顯升高，外周血中炎性因子IFN-γ、 TNF-α和IL-17水平顯著增加，而IL-4水平下降。而UCMSC-SPK1和UCMSC組上述指標(biāo)均明顯改善，并且UCMSC-SPK1組尤為明顯。近年來的研究[20]顯示，典型的炎性細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α和IL-17等主要由Th1和Th17細(xì)胞產(chǎn)生，這些因子攻擊髓鞘和軸突，使髓鞘脫失和軸突受損，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。UCMSC-SPK1可能通過抑制NK細(xì)胞增生，減輕了炎性因子IFN-γ、 TNF-α和IL-17等的釋放，從而減輕了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

綜上所述，UCMSC-SPK1移植可以明顯改善EAE小鼠神經(jīng)功能缺損癥狀及縮短、延緩MS病程，這為MS的治療提供了一種新的思路和方法，其具體機(jī)制也將會是一個有價值的研究方向。

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(2016-08-03收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Efficacy of SPK1-transfected UCMSC transplantation on mouse with experimental autoimmune encephalomyelitis

XUChunyang1),XUEPeng1),HUALinlin1),LIJinfeng2),LIUXinshan3),ZHANGDajin4),XUZhixiu1),WANGShanshan2),YINHonglei2),ZHANGHui2),ZHANGYuzhen2),WANGYunliang1)，DUANHaifeng5)

1)DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 2)DepartmentofNeurology,the148thHospitalofPLA,Zibo,Shandong255300 3)DepartmentofNeurology,SanboBrainHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100093 4)NavalWarfareInstitute,NavalGeneralHospital,Beijing100037 5)InstituteofRadiationMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850

multiple sclerosis;umbilical cord mesenchymal stem cells;sphingosine kinase 1;experimental autoimmune encephalomyelitis;mouse

Aim: To investigate the efficacy of transplantation of umbilical cord mesenchymal stem cell(UCMSC) transfected by sphingosine kinase 1(SPK1) gene on experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE) mouse.Methods: C57BL/6 mice were allocated into 4 groups: control group(n=12), EAE group(n=11), UCMSC group(n=11) and UCMSC-SPK1 group(n=11);the mice in the latter 3 groups were immunized to induce EAE model. Regarding the day for the first injection of antigen as day 0, the mice in UCMSC group and UCMSC-SPK1 group were given UCMSC or UCMSC-SPK1 by tail vein injection on 14th, 21st, 28th day, while the control group and EAE group were given the same volume of physiological saline injections. Neural function defect scale was performed daily using double blind method; on 33rd day, the peripheral blood levels of IFN-γ,TNF-α,IL-17 and IL-4 were determined by ELISA, spinal inflammatory cell infiltration and demyelination were scored by HE and LFB staining, MBP and GFAP expressions in spinal cord were detected by immunohistochemistry, and the proportion of regulatory T cells and NK cells in the spleen were obtained by flow cytometry. Results: Compared with those of EAE group, neural function defect scale in UCMSC-SPK1 group and UCMSC group significantly reduced, spinal inflammatory cell infiltration score and demyelination score reduced, the proportion of regulatory T cells in the spleen increased and NK cells proportion decreased(P<0.05), and the changes in UCMSC-SPK1 group was more significant(P<0.05). GFAP expression of UCMSC-SPK1 group fell and that of MBP enhanced, IFN-γ,TNF-α,IL-17 levels in peripheral blood decreased and IL-4 level increased when compared with those of EAE group(P<0.05). Conclusion: UCMSC-SPK1 could significantly improve neurological function recovery in EAE mice than UCMSC.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.003

*國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目 81201760

R744.5+1