復(fù)方木香丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高

趙軍+徐媛+王慶偉++劉梅

[摘要] 目的 提高并完善復(fù)方木香丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 方法 采用薄層色譜法分別對青皮、萊菔子、姜黃、草豆蔻、香附進(jìn)行定性鑒別；以高效液相色譜法測定橙皮苷的含量。分析采用C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇-水（48∶52），體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測波長284 nm。 結(jié)果 各藥材在相應(yīng)的薄層色譜條件下斑點清晰，分離度好，陰性無干擾。橙皮苷在17.5～350 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.9995），平均加樣回收率為102.88%，RSD為1.22%（n=6），3批樣品含量測定結(jié)果均值為12.41 mg/g。 結(jié)論 該鑒別方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高；定量方法簡便快速、結(jié)果準(zhǔn)確且重復(fù)性好，可用于控制復(fù)方木香丸的質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞] 復(fù)方木香丸；青皮；萊菔子；姜黃；草豆蔻；香附；橙皮苷；薄層色譜；高效液相色譜

[中圖分類號] R284 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（c）-0146-05

復(fù)方木香丸由青皮、木香、草豆蔻、姜黃、萊菔子、香附、白術(shù)、蓽澄茄及砂仁組成，功能主治為補(bǔ)脾益胃、理氣解郁、止痛調(diào)經(jīng)，用于食積不消、不思飲食、脘腹脹滿、氣郁不舒、月經(jīng)不調(diào)、乳腫、乳核等癥。該制劑所含藥味種類眾多，成分非常復(fù)雜，原標(biāo)準(zhǔn)僅有木香的薄層色譜（TLC）鑒別。為更全面控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，本研究采用TLC法鑒別青皮、姜黃、草豆蔻、萊菔子、香附；以青皮中有效成分橙皮苷[1]為指標(biāo)成分，應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）法對其進(jìn)行定量測定，為復(fù)方木香丸質(zhì)量控制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀，ZF-2C型暗箱式自動紫外分析儀（上海安靈），BT125D電子天平（sartorius），HK5200DV超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

橙皮苷、小豆蔻明、芥子堿硫氰酸鹽、萊菔子對照藥材、姜黃素、姜黃對照藥材、香附對照藥材，均由中國食品藥品檢定研究院提供，批號分別為110721-201316、110763-201403、111702-201504、121074-201304、110823 -201405、121188-201304、121059-201407，復(fù)方木香丸（批號：20141207、20150314、20150509，解放軍第一醫(yī)院），甲醇為色譜純（Fisher），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 青皮 取本品5 g研細(xì)，加甲醇20 mL超聲20 min，濾過取濾液5 mL濃縮至2 mL作為供試品溶液。另取橙皮苷對照品加甲醇制成飽和溶液，作為對照品溶液。照TLC法[2]吸取上述溶液各2 μL分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13）為展開劑展開至5 cm，取出晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20∶10∶1∶1）的上層溶液為展開劑展至約8 cm，取出晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見圖1，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2.1.2 姜黃 取本品2 g研細(xì)，加乙醇20 mL靜置10 min，時時振搖，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取姜黃對照藥材0.2 g，同法制成對照藥材溶液；再取姜黃素對照品，制成0.5 mg/mL的乙醇溶液作為對照品溶液。照TLC法[2]吸取供上述溶液各1 μL分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水（100∶2∶0.7）為展開劑展開，取出晾干分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見圖2，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點或熒光斑點。

2.1.3 草豆蔻 取本品5 g研細(xì)，加甲醇20 mL靜置5 min，時時振搖，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解作為供試品溶液。另取小豆蔻明對照品，制成3 mg/mL的甲醇溶液作為對照品溶液。照TLC法[2]吸取上述溶液各2 μL分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇（15∶4∶1）為展開劑展開，取出晾干，100℃加熱至斑點顯色清晰，噴以5% FeCl3乙醇溶液，結(jié)果見圖3，供試品色譜中，在于對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.1.4 萊菔子 取本品3 g研細(xì)，加乙酸乙酯50 mL超聲15 min，棄去乙酸乙酯溶液，藥渣揮干，加甲醇40 mL超聲15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解作為供試品溶液。另取萊菔子對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。再取芥子堿硫氰酸鹽對照品制成1 mg/mL的甲醇溶液作為對照品溶液。照TLC法[2]吸取上述溶液各3 μL分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（10∶2∶3）的上層溶液為展開劑展開，取出晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見圖4，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色熒光斑點。

2.1.5 香附 取本品2 g研細(xì)，加環(huán)己烷30 mL超聲30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解作為供試品溶液。取香附對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。照TLC法[2]吸取上述溶液各1 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-乙酸（100∶1∶0.5）為展開劑展開，取出晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見圖5，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2.2 HPLC含量測定

2.2.1 色譜條件 Inertsil ODS-3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（48∶52，v/v）；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測波長284 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定橙皮苷對照品適量，制成0.1 mg/mL的甲醇溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品0.3 g研細(xì)，精密稱定，置三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，搖勻，超聲處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 專屬性試驗 按復(fù)方木香丸處方比例及工藝，同法制成不含青皮的陰性樣品，按“2.2.3”項下方法制備陰性樣品溶液，精密吸取對照品、供試品及陰性樣品溶液各10 μL，進(jìn)樣分析。結(jié)果見圖6，供試品與橙皮苷對照品均在8.4 min顯相同的色譜峰，而陰性樣品在此無相關(guān)峰出現(xiàn)，表明此方法的專屬性良好。

2.2.5 線性與范圍 精密稱定橙皮苷對照品，加甲醇制成350 μg/mL的儲備液。精密吸取儲備液適量，用甲醇稀釋成系列濃度對照品溶液（17.5、87.5、131.3、175、262.5、350 μg/mL）。測定橙皮苷峰面積，分別以濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=14.658X+106.64，R2=0.9995（n=6），橙皮苷在17.5～350 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗 取同一供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測定橙皮苷峰面積，RSD為0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 分別取放置0、2、4、6、8、16、24 h的供試品溶液，測定橙皮苷的峰面積，RSD為0.45%，結(jié)果表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取同批（批號：20150509）樣品，按“2.2.3”項下的方法平行制備6份供試品溶液，分別測定，RSD為1.3%，表明此方法的重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率 取同一批已知含量的復(fù)方木香丸（批號：20150509）6份，研細(xì)，每份取約0.3 g，精密稱定，分別精密加入橙皮苷對照品（對照品加入量與所取供試品中待測成分量之比控制在1∶1），按“2.2.3”方法制備樣品溶液，用6個測定結(jié)果進(jìn)行評價。結(jié)果見表1，平均回收率為102.88%，RSD為1.22%（n=6）。

2.2.10 樣品測定 取樣品3批（批號：20141207、20150314、 20150509），按“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液，測定橙皮苷的含量。

3 討論

3.1 青皮的鑒別考察

青皮具有疏肝破氣、消積化滯的功效[3]，中醫(yī)用于治療胸肋脹痛、胃部痞滿、疝氣、食積、乳腫、乳核等癥[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，青皮具有促進(jìn)胃腸運動、利膽、松弛支氣管平滑肌等作用[5]?！吨袊幍洹分星嗥よb別的前處理采用回流的方式[6]，試驗中發(fā)現(xiàn)超聲與回流處理的效果相當(dāng)，故采取更為簡便的超聲處理；藥典中鑒別青皮采用二次展開的方法，首次展距為3 cm[6]，橙皮苷薄層斑點比移值Rf < 0.2，不是十分合理；將首次展距調(diào)整為為5 cm后，橙皮苷薄層斑點比移值Rf約為0.4，有助于結(jié)果的觀察和判斷。

3.2 草豆蔻的鑒別考察

草豆蔻主治燥濕健脾、溫胃止嘔[7]，近年藥理研究表明，草豆蔻能夠鎮(zhèn)吐、保護(hù)胃黏膜[8]及治療胃潰瘍的作用，臨床上用于治療脘腹脹滿冷痛、噯氣嘔逆、不思飲食等[9]?！吨袊幍洹分胁荻罐㈣b別的前處理采用水浴的方式[6]；試驗表明靜置與水浴處理的效果相當(dāng)，故采取更為簡便的靜置處理；藥典中采用小豆蔻明和山姜素兩種對照品作為草豆蔻的鑒別指標(biāo)[6]，實際在陰性樣品中具有明顯的山姜素干擾斑點，而小豆蔻明專屬性較好，因此在草豆蔻鑒別中只采用小豆蔻明作為鑒別指標(biāo)。

3.3 萊菔子的鑒別考察

萊菔子具有消食除脹、降氣化痰的功效[10]，用于飲食停滯，脘腹脹痛，大便秘結(jié)，積滯瀉痢，痰壅喘咳[11]?，F(xiàn)代藥理研究表明，萊菔子具有促進(jìn)胃腸動力、抗結(jié)腸癌、降壓等作用[12]?！吨袊幍洹分腥R菔子的鑒別中前處理采用易燃易爆試劑乙醚回流處理[6]，用乙酸乙酯代替乙醚后取得相同的效果，故采用更安全的乙酸乙酯作為前處理試劑；同時前處理方法由更簡便的超聲提取替代回流提取，處理時間由2 h縮短為30 min。

3.4 姜黃的鑒別考察

姜黃具有破血行氣、通經(jīng)止痛之功效[13]，在臨床上用于胸脅剌痛、閉經(jīng)、癓瘕等療效卓著[14]?，F(xiàn)代藥理研究表明，姜黃具有輔助保護(hù)胃黏膜、保護(hù)肝臟等作用[15]。《中國藥典》中姜黃的鑒別中展開劑為三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）[6]，由于三氯甲烷毒性較大，并具有潛在的致癌性[16]，故用毒性較低的二氯甲烷替代，調(diào)整展開劑比例為二氯甲烷-甲醇-甲酸（100∶1∶0.7），取得了較好的效果，因此采用更安全的二氯甲烷-甲醇-甲酸（100∶1∶0.7）作為展開劑。

3.5 香附的鑒別考察

香附主要具有疏肝解郁、調(diào)經(jīng)止痛的功效[17]，現(xiàn)代研究表明，香附揮發(fā)油具有抗抑郁[18]、促胃腸動力、保護(hù)胃黏膜等藥理活性[19]?！吨袊幍洹分邢愀降蔫b別中使用三氯甲烷-乙酸乙酯-乙酸（80∶1∶1）作為展開劑[6]，斑點不清晰，并且對實驗人員的危害較大，因此用毒性較低的二氯甲烷替代三氯甲烷，并調(diào)整展開劑比例為二氯甲烷-甲醇-甲酸（100∶1∶0.7），結(jié)果具有良好的專屬性和重現(xiàn)性。藥典中前處理采用易燃易爆試劑乙醚靜置1 h的方法[6]，為了提高實驗的安全性及縮短處理時間，改用環(huán)己烷超聲30 min的前處理方法，取得了相同的效果。

3.6 橙皮苷的含量測定

橙皮苷是柑橘類藥用植物果實的主要藥效成分[20]，橙皮苷具有降壓、改變體內(nèi)酶活性、改善微循環(huán)等生理功能[21]?！吨袊幍洹穼η嗥さ暮繙y定以橙皮苷為標(biāo)準(zhǔn)品，流動相為甲醇-水（25∶75）[6]，實際操作中使用該流動相運行1 h無相關(guān)峰出現(xiàn)，調(diào)整流動相比例為甲醇-水（48∶52），橙皮苷出峰時間在8.4 min，峰形較好，陰性無干擾，穩(wěn)定性、重復(fù)性俱佳，故最終采取甲醇-水（48∶52）作為橙皮苷含量測定的流動相。

復(fù)方木香丸原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂時間較早，沒有有效成分含量測定項；其鑒別項僅有木香的鑒別，且沒有陰性樣品作對照，因而不夠嚴(yán)謹(jǐn)，不能作為判定藥品質(zhì)量的依據(jù)?，F(xiàn)結(jié)合中醫(yī)藥理論選擇了方中5味中藥做鑒別，占據(jù)處方藥味的1/2以上。在TLC鑒別中，采用對人和環(huán)境更安全、更環(huán)保的試劑，縮短工作時間，提高了實驗效率。由于處方中藥材大多含有揮發(fā)油成分，且含量較高，君藥木香的含量測定指標(biāo)木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯[6]在陰性樣品中有明顯干擾，且通過調(diào)整前處理方法及色譜條件無法排除，因此選取臣藥青皮的有效成分橙皮苷作為含量測定指標(biāo)。在實際操作中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)行藥典方法不是十分理想，甚至出現(xiàn)明顯錯誤，隨后對其進(jìn)行優(yōu)化，最終確定了行之有效的檢測條件。本實驗建立了復(fù)方木香丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，該方法操作簡單，重復(fù)性良好，準(zhǔn)確可靠，從不同角度全面規(guī)范了該制劑的質(zhì)量控制方法，保證了安全性與有效性，為同類藥物的質(zhì)量研究提供了參考。

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（收稿日期：2016-11-15 本文編輯：李亞聰）