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    甘草飲片標準湯劑的研究

    2017-04-06 16:41:46林偉雄樂智勇車海燕劉蔭貞劉沖
    中國中藥雜志 2017年5期
    關鍵詞:指紋圖譜甘草

    林偉雄+樂智勇+車海燕+劉蔭貞+劉沖+王暉

    [摘要]制備了15批不同產(chǎn)地的甘草飲片標準湯劑,對甘草苷和甘草酸進行含量測定,計算轉(zhuǎn)移率與出膏率,并建立了HPLC指紋圖譜分析方法。通過對15批甘草飲片標準湯劑進行測定,甘草苷和甘草酸轉(zhuǎn)移率范圍分別為59.4%~87.4%和49.8%~78.9%,出膏率范圍為29.9%~38.9%,并用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012A)軟件進行指紋圖譜分析,確定了10個共有峰,對15批甘草飲片標準湯劑分別進行了相似度評價,其相似度均大于0.9。該研究中甘草飲片標準湯劑制備方法規(guī)范,15批樣品質(zhì)量穩(wěn)定,指紋圖譜相似度高,其方法精密度、穩(wěn)定性和重復性良好,可為甘草配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

    [關鍵詞] 甘草; 標準湯劑; HPLC; 指紋圖譜

    [Abstract] Fifteen batches of Glycyrrhizeae Radix standard decoction were prepared for determination of the content of the glycyrrhizic acid and liquiritin, then the transfer rate and the extract rate were calculated and a method was established to analyze the fingerprint by HPLC. According to the measurement of 15 batches of samples,the transfer rate of the glycyrrhizic acid and liquiritin were 59.4%-87.4% and 49.8%-78.9% with extract rate of 29.9%-38.9%. Moreover,10 common chromatographic peaks were determined based on their fingerprint by using similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of traditional Chinese medicine (TCM)(2012A) .The similarity results of 15 batches of samples were analyzed and compared,and the results showed that the similarity was all higher than 0.9. Fifteen batches of samples,prepared by a standard method,have stable quality and the high similarity.The method displayed good precision,stability and repeatability in fingerprint analysis. Therefore,this study can provide a reference for the quality control of Glycyrrhizae Radix dispensing granules.

    [Key words] Glycyrrhizae Radix; standard decoction; HPLC; fingerprint

    甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草G. inflata Bat.或光果甘草G. glabra L.的干燥根和根莖[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,素有“國老”之稱,是常用中草藥[2-3],中醫(yī)處方離不開甘草,俗稱“十方九草”[4-5]。具有清熱解毒,補脾益氣,潤肺祛痰,緩急止痛,調(diào)和諸藥的作用[6-7]?,F(xiàn)代研究表明,甘草的主要活性成分為黃酮類和皂苷類,甘草苷具有保肝及抗抑郁樣作用,甘草酸具有抗炎、保肝、抗病毒及類固醇樣作用,且在治療腎病、心臟疾病及抗癌等方面有著廣泛的應用[8]。

    隨著科技的發(fā)展與進步,配方顆粒、精制飲片、超微飲片、破壁飲片等多種中藥飲片用藥形式不斷出現(xiàn),具有積極的臨床意義,但也存在標準不明確、劑量不統(tǒng)一、臨床合理性有待進一步論證等各種問題[9]。為加強對中藥配方顆粒的管理,國家食品藥品監(jiān)督管理總局起草了《中藥配方顆粒管理辦法》,要求應體現(xiàn)配方顆粒多成分和整體性質(zhì)量控制,2016年8月5日,國家藥典委員會進一步公布《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求(征求意見稿)》,提出標準湯劑概念,明確要求中藥配方顆粒的所有藥學研究均須與標準湯劑進行對比,以保證與標準湯劑質(zhì)量一致性。

    中藥飲片標準湯劑可作為一種化學基準,同時還可以作為效應基準的陽性對照藥,用于評價不同飲片的用藥形式,用于標化臨床用藥,其制備遵循傳統(tǒng)湯劑的煎煮原則,整個流程具有標準化和規(guī)范化的特點,能夠保證工藝的統(tǒng)一,進一步保障其質(zhì)量的穩(wěn)定和統(tǒng)一,提高臨床用藥的準確性和劑量的一致性[9]。中藥飲片標準湯劑失去了原有飲片的形態(tài)學特征,單純的指標成分的定性和定量分析難以反映其質(zhì)量的優(yōu)劣,因而中藥飲片標準湯劑質(zhì)量控制要重視以指紋圖譜為主的整體質(zhì)量控制[9]。本實驗選用不同產(chǎn)地的15批甘草制備甘草飲片標準湯劑,考察了有效成分含量,轉(zhuǎn)移率和出膏率范圍,并主要建立其HPLC指紋圖譜,為甘草飲片標準湯劑的應用和其他中藥飲片標準湯劑的研究提供參考數(shù)據(jù),同時提高甘草配方顆粒的質(zhì)量控制水平。

    1 材料

    Agilent 1260高效液相色譜儀,配備G1311C四元泵,G1316A恒溫箱,G1315DDAD檢測器,G1329A自動進樣器,Chem Station色譜工作站;XP6型電子分析天平(METTLER TOLEDO,精密度0.001 mg),XPE205型電子分析天平(METTLER TOLEDO,精密度0.000 1 g),KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),HWS26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司),Arium 611DI型超純水儀(德國Sartorius公司)。

    乙腈(色譜純,155803,賽默飛世爾科技);超純水(自制);磷酸(分析純,20080304,廣東光華化學廠);乙醇(分析純,20160708,天津福晨化學試劑)。

    甘草苷(批號111610-201607)、甘草酸銨(批號110731-201418)對照品和甘草(批號120904-201117)對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院;15批甘草藥材來源見表1,甘草飲片標準湯劑由康美(北京)藥物研究院有限公司自制。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 甘草飲片標準湯劑的制備

    2.1.1 甘草前處理 根據(jù)《中國藥典》2015年版四部通則0213炮制通則,按《中國藥典》2015年版一部甘草項下炮制方法進行炮制,除去雜質(zhì)、洗凈、潤透、切厚片、干燥制得。炮制加工得到的飲片按《中國藥典》2015年版第一部甘草飲片項下有關規(guī)定進行檢測,均符合規(guī)定。

    2.1.2 標準湯劑的制備[10] 稱取甘草飲片100 g,加水煎煮2次。第1次加入水900 mL,浸泡30 min,煮沸后再煎煮1 h,用350目篩網(wǎng)趁熱濾過,濾液迅速放入冷水中攪拌冷卻;藥渣再加入水700 mL,煮沸后再煎煮30 min,用350目篩網(wǎng)趁熱濾過,濾液迅速放入冷水中攪拌冷卻;合并2次濾液,減壓濃縮(50 ℃,-0.09 MPa)至100~200 mL的流浸膏,放入冰柜冷凍(-10 ℃)過夜,用冷凍干燥機干燥,即得標準湯劑干燥粉末。

    標準湯劑是甘草飲片經(jīng)水煎煮提取加工制得的粉末,主要成分為甘草藥材中水溶性物質(zhì),參照《中國藥典》2015年版第一部甘草項下的含量測定方法,考察了供試品制備方法,并對其方法進行方法學驗證,建立了甘草苷和甘草酸2個成分的含量測定方法,并計算其出膏率和轉(zhuǎn)移率,結(jié)果見表2。

    結(jié)果顯示,15批標準湯劑出膏率在29.9%~38.9%,平均出膏率為33.0%,標準偏差為2.7%;甘草苷的質(zhì)量分數(shù)在2.25%~8.25%,平均質(zhì)量分數(shù)為4.90%,標準偏差為2.4%,轉(zhuǎn)移率在59.4%~87.4%,平均轉(zhuǎn)移率為76.7%,標準偏差為8.0%;甘草酸的質(zhì)量分數(shù)在5.97%~14.80%,平均質(zhì)量分數(shù)為9.79%,標準偏差為2.6%,轉(zhuǎn)移率在49.8%~78.9%,平均轉(zhuǎn)移率為66.2%。標準偏差為6.9%。

    2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性

    Waters symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B),梯度洗脫(0~8 min,19%A;8~45 min,19%~50%A);檢測波長237 nm;流速1 mL·min-1;柱溫25 ℃。精密吸取參照物和供試品溶液各10 μL,注入液相色譜儀,測定,記錄空白溶液、參照物和供試品的色譜圖,結(jié)果見圖1~3。

    2.3 溶液的配制

    2.3.1 供試品溶液的配制 取本品粉末約0.1 g,置具塞錐形瓶中,加入100 mL的70%乙醇,密塞,稱重,超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz)30 min,酸銨對照品適量,精密稱定,加70%乙醇分別制成每 l mL含甘草苷20 μg、甘草酸銨0.2 mg的溶液,即得。

    2.4 HPLC-DAD指紋圖譜分析

    2.4.1 精密度考察 按2.3.1項下方法制備同一批標準湯劑供試品溶液,按2.2項下色譜條件連續(xù)進樣6次,記錄色譜圖,以甘草酸色譜峰為參照,對各主要共有色譜峰相對保留時間及相對峰面積進行統(tǒng)計,并利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2012A)計算相似度。結(jié)果表明相對保留時間RSD<0.50%,相對峰面積RSD<1.0%,相似度為1,說明儀器精密度良好,符合指紋圖譜要求。

    2.4.2 穩(wěn)定性考察 按2.3.1項下方法制備同一批標準湯劑供試品溶液,按2.2項下色譜條件,分別在0, 2, 4, 8, 12, 24 h時測定,記錄色譜圖,以甘草酸色譜峰為參照,對各主要共有色譜峰相對保留時間及相對峰面積進行統(tǒng)計,并利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2012A)計算相似度。結(jié)果表明相對保留時間RSD<1.7%,相對峰面積RSD<3.0%,相似度>0.99,說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定,符合指紋圖譜要求。

    2.4.3 重復性考察 取平行制備的同一批標準湯劑干燥粉末樣品6份,按2.2項下色譜條件測定,記錄色譜圖,以甘草酸色譜峰為參照,對各主要共有色譜峰相對保留時間及相對峰面積進行統(tǒng)計,并利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2012A)計算相似度。結(jié)果表明相對保留時間RSD<0.50%,相對峰面積的RSD<2.0%,相似度為1,說明該方法重復性良好,符合指紋圖譜要求。

    2.4.4 樣品檢測與分析 分別取15批甘草飲片標準湯劑干燥粉末,按2.3.1項下方法制備得標準湯劑供試品溶液,再按2.2項下色譜條件分別測定,記錄HPLC圖。將15批供試品色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2012A)中,采用自動匹配法生成共有模式對照圖譜,并分析各樣品之間共有峰和相似度,確定共有峰,結(jié)果確定了15批樣品共有10個共有峰,見圖4,5,各指紋圖譜與共有模式對照指紋圖譜相似度均在0.9以上,符合指紋圖譜相似度要求。具體結(jié)果如下,S1 0.961;S2 0.953;S3 0.963;S4 0.927;S5 0.952;S6 0.975;S7 0.984;S8 0.990;S9 0.988;S10 0.987;S11 0.981;S12 0.988;S13 0.981;S14 0.995;S15 0.988。以選定的峰面積相對較大、出峰時間較穩(wěn)定的10號峰甘草酸作為參比峰,計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積,結(jié)果其相對保留時間RSD<0.20%,相對峰面積差異較大,RSD介于20%~48%。

    2.4.5 對照藥材與標準湯劑指紋圖譜的相關性 為了驗證制備工藝的科學性和穩(wěn)定性,用甘草對照藥材制備供試品溶液,按上述色譜條件進行檢測,記錄色譜圖,與標準湯劑對照指紋圖譜進行對比,驗證其相關性。結(jié)果表明,對照藥材和標準湯劑對照指紋圖譜相似度很好,有較多相同的成分。結(jié)果見圖6。

    3 討論

    3.1 甘草藥材來源

    為保證標準湯劑的代表性,本實驗甘草藥材的來源盡可能地包括了道地產(chǎn)區(qū)、主產(chǎn)區(qū)、傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)的規(guī)范化種植藥材和野生藥材,主要采自新疆人工種植甘草藥材、山西和甘肅野生甘草藥材。

    3.2 標準湯劑制備工藝合理性

    本實驗甘草飲片標準湯劑以中醫(yī)理論為指導、臨床應用為基礎,參照國家藥典委員會公布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求(征求意見稿)》和《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》,利用現(xiàn)代提取設備,用經(jīng)標準化工藝制備而成的甘草飲片,以水為提取溶劑,采用物理方法分離固液、低溫減壓濃縮、冷凍干燥,制得樣品。實驗中考慮到固液分離對成分得率的影響較大,采用趁熱過濾方式進行固液分離,二煎過后的藥渣進行了適當壓榨處理,減少了成分的損失,趁熱過濾后,濾液放置冷水中迅速冷卻,抑制了各成分的熱分解,同時采用低溫減壓濃縮、冷凍干燥方法提高煎煮液中各成分的穩(wěn)定性,保證了其質(zhì)量的穩(wěn)定,最大限度上達到與傳統(tǒng)湯劑一致的目的。

    3.3 供試品溶液制備方法考察

    本實驗考察了提取溶劑(乙醇、70%乙醇、50%乙醇),結(jié)果表明乙醇提取的供試品溶液中信號峰最少,70%乙醇和50%乙醇提取的供試品溶液中信號峰較多,共有成分提取效果相近,與甘草苷和甘草酸參照峰相應的峰峰形和分離度均良好,最終確定采用70%乙醇提??;同時考察了提取方式(回流和超聲),結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流和超聲提取效果一致,因此采用操作簡便的超聲提取。

    3.4 色譜條件的考察

    標準湯劑是甘草飲片經(jīng)水煎煮提取加工制得的粉末,主要成分為甘草藥材中水溶性物質(zhì),本實驗參照《中國藥典》2015年版一部甘草項下的含量測定方法,選用237 nm為檢測波長,以流動相乙腈-0.05%磷酸溶液進行梯度洗脫,結(jié)果表明,45 min之后沒有明顯的特征峰,故梯度洗脫時間和記錄色譜圖的時間定為45 min,最終確定其洗脫方式(0~8 min,19%A;8~45 min,19%~50%A);同時比較不同生產(chǎn)廠家(Waters, Merck, Kromasil)色譜柱的分離效果,根據(jù)特征峰的數(shù)量、分離度和各個特征峰的峰形,決定采用Waters symmetry C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱。

    3.5 指紋圖譜相似度評價分析

    通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2012A)相似度分析結(jié)果顯示15批甘草飲片標準湯劑與對照指紋圖譜的相似度均高于0.9,表明各批甘草飲片標準湯劑具有較高的均一性,質(zhì)量相對較穩(wěn)定,說明本實驗建立的甘草飲片指紋圖譜中10個共有峰及對照指紋圖譜可反映其指紋特征,具有鑒別評價意義。其相對保留時間RSD均小于0.20%,說明不同產(chǎn)地和不同批次的樣品有較多相同的成分,但相對峰面積差異較大,RSD介于20%~48%,說明不同產(chǎn)地和不同批次的樣品含量差異較大,可能與原料質(zhì)量有關。

    3.6 應用

    本實驗目的是為甘草配方顆粒的研究制定質(zhì)量控制標準參照物,根據(jù)15批標準湯劑的研究結(jié)果顯示各批甘草飲片標準湯劑具有較高的均一性,質(zhì)量相對較穩(wěn)定,說明其可作為配方顆粒的質(zhì)量控制標準參照物。以標準湯劑的檢測數(shù)據(jù)為依據(jù),可為甘草配方顆粒制定各項指標,保證成品與標準湯劑質(zhì)量一致性。

    [參考文獻]

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    [10] 中華人民共和國藥典委員會. 中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求(征求意見稿)[S]. 2016.

    [責任編輯 丁廣治]

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