張 明 葉翠標(biāo)

（1.廉江市石嶺畜牧獸醫(yī)站，廣東廉江 524456；2.廉江市石城畜牧獸醫(yī)站，廣東廉江 524400）

雞弓形蟲診斷抗原的篩選探討

張 明1葉翠標(biāo)2

（1.廉江市石嶺畜牧獸醫(yī)站，廣東廉江 524456；2.廉江市石城畜牧獸醫(yī)站，廣東廉江 524400）

雞弓形蟲診斷抗原的篩選對(duì)于雞肉產(chǎn)品的質(zhì)量控制、人弓形蟲的防治有重要意義。ELSA是一種對(duì)雞弓形蟲感染篩查診斷技術(shù)，通過(guò)分離培養(yǎng)弓形蟲，然后制作模型，能夠獲得足夠量的弓形蟲速殖子，提取速殖子全蟲蛋白，而后蟲蛋白后電泳，獲得弓形蟲的全蟲蛋白，以此作為抗原進(jìn)行Western blot，能夠發(fā)現(xiàn)抗原，即敏感的蛋白條帶，能基于該抗原的ELSEA方法，明確ELSEA最佳工作條件，評(píng)價(jià)診斷的敏感度。

雞弓形蟲；抗原；診斷

剛地弓形蟲簡(jiǎn)稱弓形蟲或弓形體，是一種廣泛寄生于人和動(dòng)物原蟲。弓形蟲是一種血源性寄生蟲，傳播性強(qiáng)，感染率高，人感染力高達(dá)20～50%，可爆發(fā)性流行。雞是弓形蟲的重要中間宿主，在中間宿主體內(nèi)以速殖子的形態(tài)進(jìn)行無(wú)性生殖，可入侵大多數(shù)的有核細(xì)胞，以二分裂、內(nèi)二芽、裂體增殖的方式進(jìn)行不斷的繁殖。在慢性病例中，可在腦、肌肉等處快速增殖形成包囊。感染弓形蟲的雞是人類感染弓形蟲的主要來(lái)源，食用未經(jīng)充分烹調(diào)，含有弓形蟲包囊的雞肉制品是人類感染弓形蟲的重要原因。有報(bào)道顯示，中國(guó)地區(qū)散養(yǎng)雞的弓形蟲感染率約為10～50%，感染防控不容樂觀。對(duì)雞進(jìn)行弓形蟲的診斷，有助于降低人感染弓形蟲風(fēng)險(xiǎn)。本次研究嘗試探討探討雞弓形蟲診斷抗原的篩選策略，為今后的研究提供依據(jù)。

1 雞弓形蟲感染診斷

弓形蟲的感染診斷主要包括病原學(xué)診斷、核酸檢測(cè)、免疫診斷等。病原學(xué)檢查包括涂片或組織染色鏡檢，涂片檢查主要針對(duì)病死動(dòng)物的病料，處理時(shí)間長(zhǎng)，有一定的特異性。動(dòng)物或細(xì)胞接種實(shí)驗(yàn)是一種經(jīng)典的監(jiān)測(cè)方法，但敏感性較低，應(yīng)用范圍較狹窄，不適合大規(guī)模樣本的抽查。分子生物學(xué)檢查以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為代表，具有敏感、特異、快捷的特點(diǎn)，可提取病料的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，監(jiān)測(cè)弓形蟲把基因片段，巢式PCR的敏感度較高，最低檢出限18fg弓形蟲DNA。血清學(xué)診斷包括染色實(shí)驗(yàn)、凝集實(shí)驗(yàn)、間接熒光抗體實(shí)驗(yàn)，面聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等，其中ELSA方便、快速、成本低、高通量，應(yīng)用廣泛，其診斷弓形蟲感染受包被抗原的不同，診斷的效率不同。最早出現(xiàn)的弓形蟲ELISA診斷所使用的抗原為弓形蟲速增殖子提取的天然蛋白，特異性并不理想，與其他許多疾病都存在交叉反應(yīng)。目前同于弓形蟲ELISA抗體診斷的抗原包被較多，包括速殖子粗提蛋白、速殖子表面抗原（SAG）、棒狀體單板（ROP）系列、致密顆粒蛋白（GRA）系列等，在不同動(dòng)物弓形蟲檢測(cè)的效果不盡相同，如SAG1在人類以及犬類感染的診斷中靈敏度較好。近年來(lái)對(duì)弓形蟲抗原的研究不斷深入，為診斷抗原的篩查創(chuàng)造了條件。

2 抗原篩選的思路

（1）需要獲得分離保存的弓形蟲，送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行鑒定。進(jìn)行培養(yǎng)，采用小鼠腹腔注射培養(yǎng)方法，向小鼠注射5×106數(shù)量級(jí)的弓形蟲。飼養(yǎng)3日后斷頸處死，采用生理鹽水沖洗，收集含有弓形蟲速殖子的腹水。收集得到的小鼠腹水，除弓形蟲速殖外，還有大量的淋巴細(xì)胞，數(shù)量級(jí)會(huì)成本數(shù)量級(jí)上升。（2）需要去除收集腹水中的淋巴細(xì)胞，將腹腔沖洗液覆蓋在等體積的淋巴細(xì)胞分離液上進(jìn)行離心，速度2000r/min，持續(xù)20min，此時(shí)速殖子迅速沉淀，放棄所有的液體，采用生理鹽水洗滌管底。顯微鏡下計(jì)數(shù)，速殖子需要占95%以上，純化良好，-20℃冰箱下冬春。（3）需要建立雞弓形蟲感染的模型，具體方法是采用高錳酸鉀熏蒸殺毒雞舍，購(gòu)買1日齡雛雞，分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)蟲第2周齡開始，每只雞107的劑量的純化弓形蟲純化液與5%生理鹽水配置成的輸液10ml。（4）在第0～139日分別采集內(nèi)臟血以及翅靜脈血收集感染組以及對(duì)對(duì)照組的雞血，36術(shù)°留置，離心，分裝取血樣。（5）提取速殖子全蟲蛋白，將純化后的速殖子生理鹽水懸液進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)計(jì)算，離心，加入等量的水2×SDS-PAGE上樣緩沖液，95%℃加熱5min裂解速殖子，釋放全蟲單板。通過(guò)該注射器抽吸剪切力破碎剩余的速殖子以及蛋白提取液中的基因組DNA。95℃加熱10min，溶解全蟲蛋白并使單板與SDS結(jié)合變性。4℃下離心12000r/min，持續(xù)10min，按照說(shuō)明書監(jiān)測(cè)單板含量，封裝凍存。獲得全蟲蛋白后，進(jìn)行蛋白電泳，凝膠瓊脂蛋白電泳，電泳完成后，凝膠染色，直至背景清晰，拍照留存，分析全蟲蛋白的分布。（6）最后進(jìn)行全蟲蛋白的Western blot轉(zhuǎn)錄，采用離子水終止顯色，拍照記錄圖片。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)通過(guò)擴(kuò)增、增殖采集血清樣本，獲得弓形蟲的全蟲蛋白，以此作為抗原進(jìn)行Western blot，能夠發(fā)現(xiàn)抗原，即敏感的蛋白條帶，能夠與感染弓形蟲雞的血清結(jié)合，從而診斷雞的感染。在獲得目標(biāo)蛋白后，可進(jìn)行蛋白切膠的回收、電泳分離鑒定，然后進(jìn)行擴(kuò)增合成，作為ELISA檢驗(yàn)的包被抗原。然后采用正交試驗(yàn)，確認(rèn)基于該抗原的ELSEA方法，明確ELSEA最佳工作條件，評(píng)價(jià)診斷的敏感度。

篩選ELISA檢驗(yàn)雞弓形蟲監(jiān)測(cè)的包被抗原并不困難，但實(shí)驗(yàn)的步驟較多，同時(shí)弓形蟲的種類、感染情況、血樣中的滴度也可能會(huì)影響抗原的篩查，需要確保足夠的實(shí)驗(yàn)樣本，選擇有代表性的病株。

3 小結(jié)

雞弓形蟲診斷抗原篩查的工作量較大，理論上獲得目標(biāo)敏感單板作為包被進(jìn)行ELISA的診斷，能夠明顯提高雞弓形蟲感染的診斷效率，減少費(fèi)用。建立一套ELISA的診斷體系是一個(gè)系統(tǒng)性的工程，各個(gè)階段都需要加強(qiáng)質(zhì)控。

[1]劉守業(yè)，朱瑾瑩.遼寧省大石橋地區(qū)蛋雞弓形蟲流行病學(xué)調(diào)查[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2017，（8）：40-42.