骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜注對(duì)堿燒傷兔角膜修復(fù)的促進(jìn)作用及機(jī)制

孫紅，喬麗萍，侯世科，趙少貞，孫惠敏，袁佳琴，韓泉洪

(1 天津醫(yī)科大學(xué)眼科臨床學(xué)院，天津市眼科醫(yī)院，天津300020；2武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院；3天津醫(yī)科大學(xué)眼科中心)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜注對(duì)堿燒傷兔角膜修復(fù)的促進(jìn)作用及機(jī)制

孫紅1，喬麗萍2，侯世科2，趙少貞3，孫惠敏3，袁佳琴3，韓泉洪1

(1 天津醫(yī)科大學(xué)眼科臨床學(xué)院，天津市眼科醫(yī)院，天津300020；2武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院；3天津醫(yī)科大學(xué)眼科中心)

目的 觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)靜注對(duì)堿燒傷兔角膜修復(fù)的促進(jìn)作用并探討其機(jī)制。方法 取新西蘭大白兔60只，制備右眼角膜緣堿燒傷模型，隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，各30只(30眼)。觀察組耳緣靜脈注射BMSCs細(xì)胞懸液3.47×106個(gè)/kg，對(duì)照組注射等體積PBS。注射后第3、21、60天，兩組行右眼角膜透明度和角膜上皮再生狀況評(píng)分，采用裂隙生物顯微鏡觀察角膜血管新生情況，計(jì)算角膜新生血管面積。結(jié)果 第3、21、60天觀察組角膜上皮再生程度評(píng)分均低于對(duì)照組(P均<0.05)。第3天兩組角膜混濁程度評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第21、60天觀察組均低于對(duì)照組(P均<0.05)。觀察組第3、21天角膜新生血管面積大于對(duì)照組(P均<0.05)，第60天小于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論BMSCs靜注可促進(jìn)堿燒傷兔角膜的修復(fù)，提高角膜透明度；其機(jī)制可能與其早期促進(jìn)損傷角膜新生血管生成、晚期抑制角膜新生血管生成有關(guān)。

角膜修復(fù)；堿燒傷；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；新生血管生成；兔

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)存在于骨髓中，是一種具有自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞，亦是能分泌多種細(xì)胞因子的較原始骨髓基質(zhì)細(xì)胞，具有基質(zhì)細(xì)胞的特性。在適宜的培養(yǎng)條件下，BMSCs可增殖并被誘導(dǎo)分化為包括骨、軟骨、肌肉、脂肪、神經(jīng)等組織細(xì)胞，是組織工程良好的種子細(xì)胞[1～3]。BMSCs可取自自體骨髓，取材方便，由其誘導(dǎo)而來的組織在進(jìn)行移植時(shí)不存在組織配型及免疫排斥等問題，常作為組織工程的種子細(xì)胞用于修復(fù)組織缺損[4]；但其靜脈應(yīng)用對(duì)堿燒傷角膜修復(fù)作用的報(bào)道鮮見。為此，我們于2015年6月～2016年12月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭大白兔60只，體質(zhì)量(1.5±0.6)kg，月齡2個(gè)月，雌雄不分，健康無任何眼疾。兔BMSCs為我實(shí)驗(yàn)室自制。制備方法：取1 個(gè)月齡體重0.5～1.0 kg新西蘭大白兔1 只, 肌注快速眠0.1 mL麻醉。無菌操作下穿刺股骨骨髓腔,抽出骨髓5～8 mL。DF12稀釋后，直接接種于含有20 %胎牛血清的DF12 培養(yǎng)液中,于37 ℃、5 %CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。每48 h更換一次培養(yǎng)液。收集第二代或第三代細(xì)胞備用。

1.2 角膜堿燒傷模型制備及分組處理 將60只兔麻醉后制備角膜堿燒傷模型[5]：將浸透1 mol/L氫氧化鈉溶液的濾紙環(huán)片(內(nèi)徑8 mm，外徑14 mm)置于兔右眼角膜緣上45 s，再用生理鹽水沖洗5 min。結(jié)果顯示，角膜堿燒傷程度均在Ⅲ級(jí)以上，造模成功?；\養(yǎng)24 h后用隨機(jī)雙盲法(編號(hào)，查表法)分為觀察組和對(duì)照組，各30只(30眼)。 觀察組麻醉后耳緣靜脈注射BMSCs細(xì)胞懸液3.47×106個(gè)/kg。對(duì)照組經(jīng)耳緣靜脈靜注等體積PBS。兩組均用氟哌酸眼液滴眼，4次/d；結(jié)膜囊涂四環(huán)素眼膏，1次/晚。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察 第3、21、60天兩組各分別行空氣栓塞處死10只兔，取完整角膜組織觀察以下指標(biāo)。

1.3.1 角膜上皮再生程度 角膜組織行熒光素鈉染色，按角膜染色面積進(jìn)行評(píng)分：角膜無著色為0分，染色面積≤1/4象限計(jì)1分，染色面積>1/4～≤1/2象限計(jì)2分，染色面積>1/2～≤3/4象限計(jì)3分，染色面積>3/4象限計(jì)4分。

1.3.2 角膜透明度 采用裂隙顯微鏡觀察角膜透明度，角膜透明無混濁為0分，輕度混濁且虹膜紋理可見計(jì)1分，中度混濁且虹膜紋理不清計(jì)2分，重度混濁隱見瞳孔計(jì)3分，極重度混濁且瞳孔不見計(jì)4分。

1.3.3 角膜新生血管面積 計(jì)數(shù)自角鞏緣長(zhǎng)出、連續(xù)彎曲度小、朝向植入物最長(zhǎng)血管(即新生血管)的長(zhǎng)度和數(shù)量；計(jì)算其面積。角膜新生血管生長(zhǎng)面積(mm2)=C/12×3.141 6[r2-(r-L)2]。C為發(fā)生新生血管的角膜圓周鐘點(diǎn)數(shù)，r為角膜半徑，L為血管長(zhǎng)度。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同時(shí)間角膜上皮再生評(píng)分比較 觀察組及對(duì)照組第3天角膜上皮再生評(píng)分分別為(2.9±0.45)、(3.5±0.56)分，第21天分別為(2.7±0.39)、(3.8±0.47)分，第60天分別為(2.1±0.43)、(3.9±0.51)分。觀察組第3、21、60天均低于對(duì)照組(P均<0.05)。

2.2 兩組不同時(shí)間角膜混濁程度評(píng)分比較 觀察組及對(duì)照組第3天角膜混濁程度評(píng)分分別為(2.8±0.2)、(2.9±0.3)分，兩組比較P>0.05；第21天分別為(2.7±0.4)、(3.1±0.2)分，第60天分別為(1.9±0.3)、(3.5±0.4)分；第21、60天均低于對(duì)照組(P均<0.05)。

2.3 兩組不同時(shí)間角膜新生血管面積比較 觀察組及對(duì)照組第3天角膜新生血管面積分別為(12.56±0.46)、(3.34±0.51)mm2，第21天分別為(19.16±0.76)、(14.56±0.46)mm2，第60天分別為(4.36±0.66)、(29.16±0.68)mm2。第3、21天觀察組高于對(duì)照組(P均<0.05)，第60天低于對(duì)照組(P均<0.05)。

3 討論

在角膜緣堿燒傷早期，如果建立良好的角膜緣血管網(wǎng)的血液供應(yīng)，可為角膜修復(fù)提供充分的氧氣和營(yíng)養(yǎng)，阻斷角膜發(fā)生進(jìn)一步損傷。角膜緣化學(xué)損傷的預(yù)后與角膜緣缺血的嚴(yán)重程度有直接關(guān)系[6]。研究發(fā)現(xiàn)，角膜緣堿燒傷早期組織分泌促血管新生因子的能力缺陷，組織炎癥及缺血缺氧誘發(fā)的新生血管形成可導(dǎo)致角膜瘢痕、瞼球粘連[8]。故此期急救措施中首先要積極改善角膜血管供養(yǎng)狀態(tài)[7]。因組織炎癥及缺血缺氧誘發(fā)的新生血管形成可在角膜形成瘢痕，引起瞼球粘連[8]。

最初認(rèn)為，缺血誘導(dǎo)的血管重建僅僅依賴于缺氧、炎癥介導(dǎo)的血管新生過程。但最近的研究發(fā)現(xiàn)，出生后的血管重建不僅依賴于血管新生，還需骨髓來源的前體干/祖細(xì)胞的參與[9]。胚胎發(fā)育中的血管生成是指由中胚層衍生的血管干細(xì)胞遷移、聚集、分化在原位形成原始毛細(xì)血管網(wǎng)[10]，而成體骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞能夠趨化、黏附、增殖、分化成內(nèi)皮細(xì)胞并參與血管的重建，這一過程類似于胚胎發(fā)育過程中的血管生成，所以被稱為出生后或成體的血管生成[11]。后來發(fā)現(xiàn)有許多生長(zhǎng)因子如粒細(xì)胞巨核細(xì)胞集落生長(zhǎng)因子(GM-CSF)、VEGF等能夠募集骨髓來源的干細(xì)胞到血管重建所需的部位。而缺血本身不僅能增加血管干細(xì)胞的數(shù)量，且能夠增強(qiáng)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的能力[12]。但缺血誘導(dǎo)的血管重建往往不能完全彌補(bǔ)外周血管病變和動(dòng)脈閉塞所引起的血流減少，而提供外源性干細(xì)胞可增強(qiáng)血管生成，并促進(jìn)缺血組織的血流恢復(fù)。

與血管新生不同，動(dòng)脈生成的調(diào)控不依賴于局部的缺氧，但局部的血流剪切力以及局部?jī)?nèi)皮活化卻發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[13]。動(dòng)脈生成也稱為側(cè)支循環(huán)建立，即原先存在的潛在血管在血流壓力的作用下增殖生長(zhǎng)，形成較粗的能顯著促進(jìn)血流的大動(dòng)脈[14]。在此過程中，血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞扮演著重要角色，其能調(diào)節(jié)血流量和血管壁的通透性，促進(jìn)血管生長(zhǎng)；還能通過分泌細(xì)胞因子傳遞信號(hào)給內(nèi)皮和作用于細(xì)胞外基質(zhì)[15]等。側(cè)支循環(huán)建立后，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)單核細(xì)胞趨化因子和單核細(xì)胞黏附分子等[16]。單核巨噬細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞以及其他細(xì)胞被趨化因子(如VEGF)趨化到炎癥和缺血部位[17]。這些細(xì)胞能產(chǎn)生促血管新生和促血管生成的因子，如VEGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、IL-8、血小板衍生生長(zhǎng)因子等，這些因子反過來吸引更多的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板[18]。這樣的一個(gè)新環(huán)境導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞大量增殖、遷移，血管增粗和成熟，細(xì)胞外基質(zhì)的大量合成。最終，小血管重塑形成大的側(cè)支循環(huán)，從而提供有效血流量，促進(jìn)缺血角膜再生[19,20]。

研究發(fā)現(xiàn)，在血管新生過程中動(dòng)脈生成和血管新生常同時(shí)發(fā)生、發(fā)展，不能絕對(duì)分開[21]；循環(huán)中注射骨髓干/祖細(xì)胞的兔血管新生起主要作用[22]。BMSCs既能在VEGF刺激下分化成內(nèi)皮細(xì)胞，也能在PDGF作用下形成平滑肌細(xì)胞。在細(xì)胞水平上，骨髓來源的干/祖細(xì)胞能分化為毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞(血管新生)，亦可形成由平滑肌細(xì)胞包被的大血管(血管生成)。盡管這兩種機(jī)制存在著許多交迭，但目前尚無法明確區(qū)分其分子過程。BMSCs對(duì)血管新生、血管生成、動(dòng)脈生成作用的區(qū)分也很不清楚。目前所知的細(xì)胞生成因子均不是僅對(duì)血管重建發(fā)生作用；內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞/平滑肌細(xì)胞的接觸在血管成熟中起著尤為重要的作用。如果沒有周細(xì)胞/平滑肌細(xì)胞的參與，新生的裸露內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)很不穩(wěn)定，容易退縮和消失。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，移植的BMSCs可參與到血管網(wǎng)中并分泌VEGF[2]；外周血和房水中的VEGF濃度變化以及角膜組織中VEGF、VEGFR基因表達(dá)水平均證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)。VEGF能刺激周細(xì)胞/平滑肌細(xì)胞增殖和募集，進(jìn)而促進(jìn)血管生長(zhǎng)和成熟。本研究觀察組第3、21、60天角膜上皮再生程度評(píng)分均低于對(duì)照組，第21、60天角膜混濁程度評(píng)分均低于對(duì)照組。說明靜注BMSCs可促進(jìn)損傷角膜再生，提高角膜透明度。觀察組注射BMSCs第3、21天角膜新生血管面積高于對(duì)照組，表明靜注BMSCs可促進(jìn)堿燒傷角膜損傷后早期血管新生，進(jìn)而改善燒傷后早期角膜血供。第60天觀察組右眼角膜新生血管面積小于對(duì)照組，說明在損傷后期，觀察組血管新生程度較低，此可能為觀察組右眼角膜透明度較高的原因之一。

綜上所述，BMSCs靜注可促進(jìn)堿燒傷兔角膜修復(fù)，提高角膜透明度；其機(jī)制可能為早期可促進(jìn)損傷角膜新生血管生成、晚期可抑制角膜新生血管生成。本研究的不足為未對(duì)角膜緣組織中的周細(xì)胞/平滑肌細(xì)胞進(jìn)行抗體標(biāo)記。

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天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究項(xiàng)目(15JCYBJC26500)。

韓泉洪(E-mail：hanquanhong126@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.012

R772.2

A

1002-266X(2017)20-0040-03

2016-11-11)