特發(fā)性肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中miR-29的作用及上下游信號通路研究進展

岳中正，李娟，暴磊，陳慧婷，姚武，郝長付(鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,鄭州450001)

特發(fā)性肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中miR-29的作用及上下游信號通路研究進展

岳中正，李娟，暴磊，陳慧婷，姚武，郝長付
(鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,鄭州450001)

小分子RNA(miRNA)是一類由18～25個核苷酸構(gòu)成的功能性非編碼RNA，主要參與轉(zhuǎn)錄后基因水平的調(diào)控。miR-29是一類與纖維化密切相關(guān)的miRNA。動物實驗證實，抑制特發(fā)性肺纖維化動物肺組織miR-29表達(dá)可以促進特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生。特發(fā)性纖維化患者肺組織中miR-29各亞型表達(dá)均下降。miR-29通過對轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)/Smad3、蛋白磷酸酶2A(PP2A)/組蛋白脫乙酰酶C4(HDAC4)、Wnt/β-catenin、PI3K-AKT、Fas死亡受體途徑等多條信號通路的調(diào)節(jié)，進而抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成和分泌，參與特發(fā)性肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程。

小分子RNA；miR-29；特發(fā)性肺纖維化；轉(zhuǎn)化生長因子β/Smad3信號通路；蛋白磷酸酶2A/組蛋白脫乙酰酶C4信號通路；Wnt/β-catenin信號通路；PI3K-AKT信號通路；Fas死亡受體

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一類慢性、進行性、致死性的肺部疾病，是間質(zhì)性肺病中最常見的形式[1～4]。2014年的一項研究顯示，全球范圍內(nèi)IPF造成的死亡率持續(xù)增長，僅2014年一年，在歐洲就有28 000～65 000例患者死于IPF，在美國為13 000～17 000例[5]。IPF沒有明確的病因[6～8]。成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子和大量的膠原等基質(zhì)蛋白成分，在IPF發(fā)病過程中具有十分重要的作用[9～11]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對小分子RNA(miRNA)認(rèn)識的不斷加深，miRNA在IPF發(fā)病過程中的作用越來越受到人們的重視。有研究表明，miR-29是IPF肺組織中表達(dá)下調(diào)最明顯的一類miRNA分子[1, 12, 13]。miR-29其可抑制細(xì)胞外基質(zhì)多種組分的合成，具有明顯的抗纖維化作用[14～16]。肺組織中miR-29表達(dá)受到轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)/Smad3等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，也調(diào)控Wnt/β-catenin等多種信號傳導(dǎo)通路的表達(dá)。miR-29通過這些信號傳導(dǎo)通路在IPF發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。現(xiàn)就miR-29在IPF發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用以及相關(guān)信號通路作一綜述。

1 IPF發(fā)生發(fā)展過程中miR-29的作用

miR-29家族在物種之間具有高度保守性，通過對人和小鼠miR-29的研究發(fā)現(xiàn)，miR-29家族主要由miR-29a、miR-29b、miR-29c三類成員構(gòu)成，分別由7號染色體或1號染色體上串聯(lián)的兩個基因編碼，其中miR-29a和miR-29b的編碼基因分別位于7號和1號染色體，miR-29b的編碼基因由于可以同時位于7號染色體和1號染色體，因此又將其分為miR-29b1和miR-29b2兩種亞型[14, 17]。成熟的miR-29分子具有高度的保守性，miR-29家族各成員之間僅存在2～3個核苷酸位點的差異，且各成員之間具有相同的種子序列，因此它們作用的靶基因也往往相同[14, 18]。對miR-29表達(dá)譜的研究發(fā)現(xiàn)，miR-29在生物體的不同發(fā)育階段、同一發(fā)育階段不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)各不相同。有研究表明，成年小鼠肺內(nèi)miR-29的表達(dá)明顯高于其在早期發(fā)育階段的胎肺中的表達(dá)[19, 20]。Cushing等[7]的研究也證實miR-29的表達(dá)水平可以隨著肺的發(fā)育成熟程度而不斷增加，在成年小鼠的肺組織中達(dá)到最高。同時研究還發(fā)現(xiàn)，在成年小鼠的肺組織中，miR-29主要表達(dá)在易于發(fā)生纖維化部位的肺泡和胸膜下的細(xì)胞以及肺泡管入口處的間充質(zhì)細(xì)胞中。

雖然到目前為止，引起IPF的病因仍然未知，但是纖維化肺內(nèi)成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞異常增加和活化引起的細(xì)胞外基質(zhì)的大量蓄積，在IPF發(fā)病過程中具有十分重要的作用[9, 18]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-29可以直接控制膠原以及其他細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)組分基因的表達(dá)，miR-29的下調(diào)作為IPF發(fā)生發(fā)展過程中的重要分子事件，已在多種細(xì)胞和動物實驗中得到證實[6, 7, 15, 18]。

TGF-β是肺纖維化過程中處于中心調(diào)控地位的細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)能力明顯增強[21, 22]。因此，TGF-β被廣泛的應(yīng)用于與肺纖維化有關(guān)的細(xì)胞實驗的研究。Wang等[21]通過使用TGF-β刺激人胚肺成纖維細(xì)胞株(IMR-90)發(fā)現(xiàn)，IMR-90細(xì)胞內(nèi)miR-29家族各成員均出現(xiàn)明顯下調(diào)。該結(jié)果與Yang等[22]的研究結(jié)果相一致，進一步研究發(fā)現(xiàn)，在IMR-90細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-29類似物可以逆轉(zhuǎn)TGF-β誘發(fā)的細(xì)胞表型和功能的改變。Cushing等[7]使用基因敲除技術(shù)沉默IMR-90細(xì)胞內(nèi)miR-29的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量與纖維化有關(guān)的基因表達(dá)明顯增加。雖然目前還沒有發(fā)現(xiàn)TGF-β直接刺激肺原代成纖維細(xì)胞引起miR-29家族改變的資料，但是Khalil等[23]通過將IPF患者肺原代成纖維細(xì)胞和對照組來源的成纖維細(xì)胞分別與聚合的膠原基質(zhì)共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，IPF組中原代成纖維細(xì)胞內(nèi)miR-29c的表達(dá)水平顯著降低。以上研究結(jié)果表明，miR-29可能參與IPF的發(fā)生，并發(fā)揮負(fù)向調(diào)控的作用。

博來霉素是一種具有抗腫瘤作用的多組分抗生素，其不良反應(yīng)之一是引起肺纖維化，由于其引起肺纖維化的病理組織學(xué)改變與人類肺纖維化最為接近，故被廣泛用于誘導(dǎo)肺纖維化的動物模型。2011年的一項研究采用miRNA微陣列分析技術(shù)對博來霉素刺激后小鼠肺組織中609種miRNA進行了檢測，發(fā)現(xiàn)有49種miRNA發(fā)生明顯的上調(diào)和下調(diào)，其中就包括let-7d(另一種與IPF有關(guān)的重要的miRNA)和miR-29[14]。這與Xiao等[24]的研究相一致，同時，研究還發(fā)現(xiàn)，將miR-29b基因?qū)胄∈篌w內(nèi)會對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化起到明顯的抑制作用，同時miR-29對已經(jīng)建立的小鼠肺纖維化模型也具有一定的治療作用。miR-29對肺纖維化的治療作用在Montgonery等[25]的研究中得到進一步驗證。動物實驗的結(jié)果進一步證實了miR-29與IPF之間的關(guān)聯(lián)性。

除此之外，IPF與miR-29異常之間的聯(lián)系也在IPF患者中得到證實。Roak等[16]研究發(fā)現(xiàn)，無論是在快速進展型還是在慢性遷延型肺纖維化中，miR-29各亞型表達(dá)均顯著下降，而在這兩種肺纖維化類型中miR-29的表達(dá)不存在明顯差異。

2 IPF發(fā)生發(fā)展過程中miR-29的上下游信號通路

研究表明，一種miRNA可以調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，單一的miRNA表達(dá)的改變就足以引起多種基因信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的改變[26, 27]。miR-29可以調(diào)控多種與肺纖維化密切相關(guān)的基因的表達(dá)，其中涉及到多條信號傳遞通路[18]。

2.1 miR-29的上游信號通路

2.1.1 TGF-β/Smad3信號通路 TGF-β是纖維化發(fā)生過程中處于中心地位的細(xì)胞因子。Cushing等[7]的研究發(fā)現(xiàn)TGF-β可以引起miR-29的顯著下調(diào)，從而引起IPF中與纖維化有關(guān)的基因上調(diào)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β對miR-29的調(diào)控有Smad3依賴性，Xiao等[24]采用基因敲除小鼠的方法，分別提取Smad3基因敲除小鼠和野生型小鼠的原代肺成纖維細(xì)胞，并給予TGF-β刺激，結(jié)果顯示與野生型小鼠相比，Smad3基因敲除小鼠來源的成纖維細(xì)胞不會發(fā)生miR-29的下調(diào)和纖維化。有關(guān)Smad3對miR-29調(diào)控的具體過程目前還缺乏相應(yīng)的研究，不過Pandit等[12]通過對let-7d(另一種與纖維化發(fā)生密切相關(guān)的miRNA分子)的研究發(fā)現(xiàn)，Smad3可以與let-7d基因上游的啟動子區(qū)域結(jié)合，從而調(diào)控let-7d的表達(dá)。這為我們研究Smad3對miR-29的調(diào)控提供了依據(jù)。另外更值得注意的是，有研究表明miR-29的過表達(dá)可以反向抑制TGF-B和結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達(dá)，并對Smad3信號通路產(chǎn)生抑制作用，其具體機制還有待進一步研究[14]。

2.1.2 蛋白磷酸酶2A(PP2A)/組蛋白脫乙酰酶C4(HDAC4)信號通路 IPF患者肺內(nèi)的一項相對特征性的變化是成纖維細(xì)胞異常增殖和活化，導(dǎo)致肺泡壁過量的Ⅰ型膠原蓄積，形成瘢痕樣無功能肺泡腔；隨著病程的進展，纖維病變可以從已發(fā)生纖維變化的肺泡向解剖學(xué)上鄰近的正常呼吸單元上擴展，導(dǎo)致纖維病變的持續(xù)性發(fā)展，引起機體進行性缺氧，最終導(dǎo)致窒息死亡[28, 29]。miR-29是Ⅰ型膠原表達(dá)的重要的調(diào)控分子。有文獻報道，在IPF發(fā)展過程中，聚合的膠原等細(xì)胞外基質(zhì)可以反饋性的作用于周圍的成纖維細(xì)胞，繼而引起成纖維細(xì)胞內(nèi)miR-29表達(dá)降低，細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加，形成一個正向的反饋通路[30]。在正常機體內(nèi)，聚合的膠原可以限制成纖維細(xì)胞的過度增殖。Xia等[31]報道，當(dāng)與聚合的膠原相互作用時，IPF肺成纖維細(xì)胞表面的一種主要的膠原識別受體-α2β1整合素的表達(dá)發(fā)生病理性降低，α2β1整合素功能的異常使其失去激活PP2A的能力，而 PP2A是HDAC4發(fā)揮功能的主要的調(diào)節(jié)因子。HDAC4包含一段N段的調(diào)控區(qū)域，易于發(fā)生磷酸化，當(dāng)HDAC4發(fā)生磷酸化時，其極易被胞質(zhì)中的蛋白酶水解；當(dāng)HDAC4在PP2A的作用下發(fā)生脫磷酸化作用時，HDAC4可以以穩(wěn)定形式存在，并能在PP2A作用下發(fā)生核內(nèi)的轉(zhuǎn)運。Khali等[23]證實了HDAC4的核轉(zhuǎn)運受其磷酸化狀態(tài)的控制，而PP2A可以穩(wěn)定HDAC4并促進其核轉(zhuǎn)運，HDAC4進入細(xì)胞核后可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能，直接調(diào)控Ⅰ型膠原和miR-29的表達(dá)。

2.2 miR-29的下游信號通路

2.2.1 Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化以及極化過程中具有重要作用。動物模型的研究表明，在博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的過程中出現(xiàn)了Wnt/β-catenin信號通路的活化。Wang等[21]通過對IMR-90細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β刺激可以增加細(xì)胞內(nèi)Wnt3α的表達(dá)和β-catenin磷酸化水平，激活Wnt/β-catenin信號通路，調(diào)控COL1A1的表達(dá)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)miR-29過表達(dá)后，可以抑制TGF-β誘導(dǎo)的Wnt3α的表達(dá)，從而間接抑制β-catenin活化的過程。miR-29可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，實現(xiàn)對膠原表達(dá)的調(diào)控。

2.2.2 PI3K-AKT信號通路 PI3K-AKT信號通路在細(xì)胞分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，TGF-β可以通過激活PI3K-AKT信號通路，實現(xiàn)對膠原等細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的調(diào)控；miR-29類似物可以抑制阻斷PI3K和AKT的磷酸化，抑制PI3K-AKT信號通路，進而降低膠原的表達(dá)[32]。

2.2.3 Fas死亡受體途徑 成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞是導(dǎo)致IPF肺內(nèi)過量膠原蓄積和瘢痕組織形成的重要效應(yīng)細(xì)胞。一些研究發(fā)現(xiàn)，來自IPF肺內(nèi)的成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞凋亡活性降低，F(xiàn)as死亡受體途徑在其中具有重要作用[33]。miR-29功能的抑制會引起肺成纖維細(xì)胞Fas受體死亡途徑相關(guān)蛋白異?；钴S表達(dá)。IPF肺內(nèi)成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞凋亡活性降低可能是由于TGF-β抑制了miR-29的表達(dá)，進而引起細(xì)胞表面Fas表達(dá)降低的結(jié)果[26]。

miR-29表達(dá)的改變是IPF發(fā)生發(fā)展過程中重要的分子事件，miR-29可以參與多條與肺纖維化密切相關(guān)的信號通路的調(diào)節(jié)，在纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位。但就目前而言，有關(guān)miRNA-29與IPF的研究還存在一些不足。在IPF發(fā)病過程中，miR-29表達(dá)的異常涉及多條已知或未知的信號通路，這些信號通路之間是否存在相互影響和相互作用，信號通路之間相互影響和相互作用的方式是什么，以及如何應(yīng)用miR-29與纖維化有關(guān)的信號通路之間的相互作用來實施對IPF的治療？所有這些問題的解決，還有待進一步更細(xì)致的實驗設(shè)計與研究。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.11.036

R563.9

A

1002-266X(2017)11-0111-04

2017-01-17)