水中微生物能力驗證菌落總數(shù)的方法研究

陳曉瑜

(佛山市水業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 佛山 528000)

水中微生物能力驗證菌落總數(shù)的方法研究

陳曉瑜

(佛山市水業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 佛山 528000)

現(xiàn)時檢測水中菌落總數(shù)的方法有國家標(biāo)準(zhǔn)的平皿計數(shù)法和地方標(biāo)準(zhǔn)的復(fù)合酶底物法，通過能力驗證和實驗室間比對，科學(xué)分析少量數(shù)據(jù)并得出結(jié)果，兩種方法的結(jié)果均接近樣品真值，其中復(fù)合酶底物法呈現(xiàn)的結(jié)果更準(zhǔn)確，不需要在無菌條件下操作，在實驗室經(jīng)驗成本條件允許下可推廣該技術(shù)。使用平皿計數(shù)法比較兩種不同形態(tài)的菌種，結(jié)果得出當(dāng)菌種體積越小、體液越深，在培養(yǎng)的時候越容易分辨?zhèn)€數(shù)，得出的結(jié)果越準(zhǔn)確。

菌落總數(shù)；復(fù)合酶底物法；能力驗證；實驗室間比對

1 引 言

菌落總數(shù)作為判定水中被細(xì)菌污染程度的標(biāo)志，長期作為常規(guī)指標(biāo)觀察水體中細(xì)菌的性質(zhì)和繁殖動態(tài)，對水質(zhì)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

在不同環(huán)境、不同操作人員、不同使用器皿的條件下，菌落總數(shù)的結(jié)果可能會受到影響，因此我們需要進(jìn)行能力驗證，去查找在檢驗中是否存在問題，挖掘不足之處進(jìn)行改進(jìn)。國際間的微生物能力驗證十分成熟，有著十幾年的經(jīng)驗成果；我國近年來引進(jìn)了該系列能力驗證，包括菌落總數(shù)、總大腸菌群、糞大腸菌群、埃希氏菌群、甲第鞭毛蟲、隱孢子蟲等共6項微生物實驗室間能力驗證。以上能力驗證均被國際認(rèn)可，通過驗證的實驗室及操作人員可獲頒證書；存在不足的實驗室，有專業(yè)的團(tuán)隊協(xié)助發(fā)現(xiàn)問題，改進(jìn)實驗室條件，以達(dá)到符合國家規(guī)定的實驗標(biāo)準(zhǔn)。

2 材料與方法

2.1 培養(yǎng)基和試劑

適用于《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 微生物指標(biāo)》GB/T 5750.12-2006 1.1平皿法計數(shù)中的培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

適用于《水中菌落總數(shù)符合酶底物檢測方法》DB44/T 1163-2013中的培養(yǎng)基套裝，包含SimPalte 100mL瓶裝無菌培養(yǎng)基和84孔穴樣品盤。

2.2 實驗儀器

恒溫生化培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、便攜式紫外燈。

2.3 實驗方法及原理

2.3.1 樣品處理

將樣品凍存管從冰箱中取出，于室溫下平衡10至15分鐘。將100毫升無菌水倒入無菌取樣瓶中。打開樣品凍存管，將有顏色的圓形膠盤無菌操作轉(zhuǎn)移到裝有無菌水的取樣瓶中，充分振蕩后靜置10至15分鐘，直至圓形膠盤完全溶解，得到待檢測的樣品原液。

盲樣需再取90毫升無菌水倒入另一無菌取樣瓶，取10毫升樣品原液轉(zhuǎn)移到90毫升無菌水中，充分混合，得到待檢測的10倍稀釋度樣品。

從樣品接觸無菌水到完成檢測，全過程在45分鐘內(nèi)完成。

2.3.2 平皿計數(shù)法

滅菌移液管吸取1毫升樣品，注入滅菌平皿中，傾注月15毫升已融化并冷卻到45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋搖平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混勻。凝固后倒置放入36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48小時。

質(zhì)控樣品原液、盲樣樣品原液、盲樣10倍稀釋樣品等各做5個平行接種，合共3組樣品。同時對營養(yǎng)瓊脂和1毫升無菌水各做1個空白對照。

2.3.3 復(fù)合酶底物法

滅菌移液管吸取1毫升樣品和9毫升培養(yǎng)基加入到樣品盤中心，蓋上樣品盤蓋子，輕輕轉(zhuǎn)動樣品盤將液體分配到每個孔穴中。然后慢慢將盤子豎起90°至120°，將多余的液體吸到樣品盤中的還買上。把樣品盤緩慢倒置，放入36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48小時。

已知盲樣樣品原液濃度在該方法上限值738MPN/mL范圍內(nèi)，故只需使用原液做5個平行接種，合共1組樣品。用10毫升培養(yǎng)基做1個培養(yǎng)基空白，用1毫升無菌水代替樣品做1個純水空白對照。

3 結(jié)果討論

3.1 兩個方法菌落總數(shù)生長情況

每5個平行樣為一組的樣品，以樣品轉(zhuǎn)移到平皿或樣品盤的時間為排序方式，在45分鐘內(nèi)完成整個操作過程，4組樣品中均沒有出現(xiàn)隨時間變化而有規(guī)律性的結(jié)果變化。具體結(jié)果如表1。

表1 平皿計數(shù)法、復(fù)合酶底物法菌落總數(shù)培養(yǎng)結(jié)果

在檢驗結(jié)果的可信度時，通過質(zhì)控樣結(jié)果，可判斷在此次實驗操作過程中測量值的準(zhǔn)確性是可信的。

在選取有效結(jié)果數(shù)值時，因每組樣品的樣品量較少，且微生物培養(yǎng)結(jié)果的允許限值跨度較大，通常在檢驗微生物結(jié)果時，取二倍相對偏差為合理范圍，對應(yīng)此次實驗結(jié)果，各組樣品結(jié)果均在合理范圍之內(nèi)，直接求得平均值得出最終結(jié)果。

在選擇平皿計數(shù)法中是否稀釋過的樣品作為最終結(jié)果時，按照GB/T 5750.12-2006 1.1.7的要求，“首先選擇平均菌落數(shù)在30～300之間者進(jìn)行計算”，但是，根據(jù)實際情況，對平皿的觀察與比較，盲樣中的菌落形狀較小、輪廓清晰、分布均勻、數(shù)量可計數(shù)，同時考慮到通過二次稀釋，可能將外來菌種帶到樣品中造成結(jié)果偏高，故最終結(jié)果選取不經(jīng)稀釋的培養(yǎng)皿進(jìn)行計數(shù)與結(jié)果上報。

3.2 質(zhì)控樣品與考核樣品菌種大小、形狀的對比

在相同的200倍顯微鏡放大后觀察質(zhì)控樣和盲樣菌種大小及形狀，質(zhì)控樣品最長直徑較大、整體呈橢圓形、兩頭較圓、菌種有透光性、濃度較高的時候培養(yǎng)效果容易結(jié)團(tuán)連成一片；盲樣最長直徑是質(zhì)控樣的25%、整體呈尖錐形、兩頭較尖、菌種透光度較低、濃度較高時候培養(yǎng)效果清晰可辨、不容易結(jié)塊結(jié)團(tuán)。

4 小 結(jié)

微生物比對在國內(nèi)處于起步階段，每年全國性的微生物實驗室間比對規(guī)模越來越大，認(rèn)可度越來越廣，對實驗室能力要求也越來越高。

對于平皿計數(shù)法與復(fù)合酶底物法優(yōu)越性比較，平皿計數(shù)法是傳統(tǒng)的檢測方法，低成本、應(yīng)用時間長、技術(shù)成熟，對操作環(huán)境的衛(wèi)生條件要求高，需要在無菌室內(nèi)操作；復(fù)合酶底物法是近年開法出來的新方法，操作簡單，在普通的實驗室內(nèi)也可以進(jìn)行培養(yǎng)，多次質(zhì)控樣的結(jié)果，復(fù)合酶底物法比平皿計數(shù)法更接近樣品真值，但實驗用的培養(yǎng)基培養(yǎng)皿等材料成本較高。

無論選取何種方法，若要做好實驗室間比對，前期準(zhǔn)備工作至關(guān)重要。對恒溫培養(yǎng)箱48小時的恒溫觀察記錄、對實驗用具的清潔消毒、對培養(yǎng)基的儲存與配制，還有就是多次練習(xí)提升操作速度，從而能在規(guī)定的菌種活性有效時間內(nèi)多做幾組平行樣。

[1]肖劍，李慧琴，陳楷，等.食品微生物能力驗證樣品菌落總數(shù)檢驗方法[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2014，10(5)：3343-3348.

Study on Heterotrophic Plate Counts (HPC) Proficiency Test in Water Environment

CHEN Xiaoyu

(Foshan Water Group Ltd.，Guangdong Foshan 528000)

There are two methods to test HPC in water environment.One is traditional plate counts method，the other is SimPlate method. A proficiency testing with scientific data analysis，the testing result turned out that the SimPlate value is closer the true value than the traditional method.SimPlate method also can operate outside the aseptic environment. Moreover，two different colony samples were observed under microscope，a smaller shape and deeper color is easier to count.

Heterotrophic Plate Counts (HPC)；SimPlate；proficiency test；quality control

陳曉瑜，碩士研究生，從事水質(zhì)檢測與分析工作

X21

A

1673-288X(2017)02-0104-02

引用文獻(xiàn)格式：陳曉瑜.水中微生物能力驗證菌落總數(shù)的方法研究[J].環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展，2017，42(2)：104-105.