水稻HGO基因啟動(dòng)子的克隆及轉(zhuǎn)化鑒定

蔡 薇，陳彥成，黃麗華，支添添，任春梅,3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省水稻研究所，湖南 長沙 410125；3.作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128)

水稻HGO基因啟動(dòng)子的克隆及轉(zhuǎn)化鑒定

蔡 薇1，陳彥成2，黃麗華1，支添添1，任春梅1,3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省水稻研究所，湖南 長沙 410125；3.作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128)

HGO是編碼酪氨酸降解途徑中尿黑酸1，2雙加氧酶的基因。探討了水稻HGO基因的表達(dá)特征，構(gòu)建了水稻HGO基因啟動(dòng)子與GUS表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過GUS組織化學(xué)染色法檢測，發(fā)現(xiàn)水稻HGO基因啟動(dòng)子在擬南芥根、下胚軸、葉柄和子葉中高度表達(dá)，在真葉中只有葉脈和葉尖上有微弱的表達(dá)。

水稻；HGO基因；啟動(dòng)子；載體構(gòu)建

酪氨酸降解途徑是動(dòng)物體內(nèi)必不可少的一條代謝途徑[1]，在酪氨酸降解途徑中，首先是酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶將酪氨酸催化生成對(duì)羥基苯丙酮酸，接著被對(duì)羥基苯丙酮酸雙氧化酶分解生成尿黑酸，然后在尿黑酸1,2雙加氧酶(homogentisate dioxygenase，HGO)的作用下氧化形成馬來酰乙酰乙酸，再經(jīng)馬來酰乙酰乙酸異構(gòu)酶作用形成延胡索酰乙酰乙酸，最后在延胡索酰乙酰乙酸酶(fumarylacetoacetate hydrolase，F(xiàn)AH)的作用下形成乙酰乙酸和延胡索酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)徹底分解[2]。在動(dòng)物體中，F(xiàn)AH的缺乏會(huì)導(dǎo)致Ⅰ型遺傳性酪氨酸血癥，先天缺乏HGO會(huì)導(dǎo)致尿黑酸血癥。但酪氨酸降解途徑在植物中的作用機(jī)制尚不完全清楚[3-4]。

前期研究分離得到一個(gè)擬南芥短日照依賴型突變體sscd1，它在短日照條件下(8 h光照/16 h黑暗)發(fā)生細(xì)胞死亡，通過圖位克隆的方法得出其編碼延胡索酰乙酰乙酸酶FAH是酪氨酸降解途徑中最后一個(gè)酶[5-6]。尿黑酸1,2雙加氧酶(HGO)位于FAH的上游，前期研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥雙突變體sscd1hgo能夠抑制sscd1的細(xì)胞死亡。進(jìn)一步研究hgo單突變體，發(fā)現(xiàn)其不僅不會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞死亡，且在幼苗期植株長勢強(qiáng)于Col-0野生型[7-8]。

水稻作為我國最主要的糧食作物,對(duì)其基因啟動(dòng)子的克隆及分析有助于深入了解其基因的功能[9]。此前將水稻HGO基因與擬南芥HGO進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩者具有較高的同源性；因此對(duì)水稻HGO基因進(jìn)行克隆并轉(zhuǎn)入擬南芥sscd1hgo雙突變體中，細(xì)胞死亡表型再次出現(xiàn)，證明水稻HGO基因可互補(bǔ)擬南芥HGO基因[7]。為了深入研究水稻HGO基因的表達(dá)特征，克隆水稻HGO基因啟動(dòng)子并轉(zhuǎn)入擬南芥中以觀察其表達(dá)情況。

本研究構(gòu)建了水稻HGO基因啟動(dòng)子與GUS表達(dá)載體的重組表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，通過抗性篩選獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，利用GUS染色檢測水稻HGO基因啟動(dòng)子的表達(dá)活性，旨在分析水稻HGO基因在擬南芥上的組織表達(dá)特征。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)野生型Col-0、水稻粳稻品種日本晴(OryzasativaL. cv. Nipponbare)、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefactions)GV3101，載體pCAMBIA1301由作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物信號(hào)傳導(dǎo)課題組保存。

1.2 植物的生長

1.2.1 水稻的生長 剝?nèi)コ墒焖痉N子的外殼，置于70%乙醇中浸泡90 s，棄去乙醇；用0.1% HgCl溶液浸泡種子15 min，倒掉HgCl；在超凈工作臺(tái)上用無菌水清洗4～5次，將種子放置在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱中28 ℃，14 h光照/10 h黑暗培養(yǎng)。

1.2.2 擬南芥的生長 用消毒液(20% bleach+0.1% Triton 100)浸泡擬南芥種子10 min后，在超凈工作臺(tái)上用無菌水清洗4～5次，播種在MS固體培養(yǎng)基上，放置4 ℃黑暗處理3 d后，放置培養(yǎng)室生長，培養(yǎng)溫度為(22±2) ℃；光周期為16 h光照/8 h黑暗。待生長7 d后，將其移栽到營養(yǎng)土(東北黑土與蛭石的體積比為1∶1)中，蓋上透明塑料薄蓋生長1～2 d，置于培養(yǎng)室內(nèi)生長。

1.3pOsHGO∷GUS表達(dá)載體的構(gòu)建

1.3.1 設(shè)計(jì)引物及目的片段的擴(kuò)增 在NCBI網(wǎng)站上找到水稻HGO基因的啟動(dòng)子序列，在線分析其包含的順式作用原件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)。利用軟件Primer Premier 5.0，根據(jù)網(wǎng)站上公布的啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增引物HGO-F/HGO-R，分別在上下游引物的5′端分別加上XbaⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基，PCR擴(kuò)增目的片段大小預(yù)期為1514 bp。引物序列如下：

HGO-F，5′-GCTCTAGATGTTTGTTGTGTTGGTGAGAT-3′

HGO-R，5′-CATGCCATGGAGAGGGAGAAGGACAA-3′

引物的預(yù)測退火溫度為66 ℃，根據(jù)預(yù)測溫度設(shè)計(jì)PCR的溫度梯度分別為64、66和68 ℃，得到最適溫度為68 ℃。用CTAB[10]法提取三葉期水稻總DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收并純化。

1.3.2 載體重組及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 用XbaⅠ和NcoⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)目的片段及pCAMBIA1301載體進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶將帶有相同粘性末端的目的片段和載體于37 ℃下過夜連接，使HGO基因啟動(dòng)子替換pCAMBIA1301載體上原有的35 S啟動(dòng)子。通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，隨機(jī)挑選陽性克隆進(jìn)行菌落PCR及酶切檢測，酶切正確的送上海鉑尚公司進(jìn)行測序。將測序驗(yàn)證正確的陽性克隆進(jìn)行搖菌和質(zhì)粒的提取，通過電擊法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中，進(jìn)行菌落PCR鑒定和質(zhì)粒PCR驗(yàn)證。

1.4 擬南芥的轉(zhuǎn)化與GUS染色

挑選經(jīng)驗(yàn)證成功轉(zhuǎn)入重組載體的農(nóng)桿菌陽性菌落置于含有卡那霉素(50 mg/L)、慶大霉素(50 mg/L)、利福平(25 mg/L)的YEB液體培養(yǎng)液中活化處理，在28 ℃下220 r/min振蕩培養(yǎng)18～24 h。6000 g離心大量活化菌液2 min，棄上清液，用農(nóng)桿菌懸浮液(5%蔗糖+1/2MS+0.02% Silwet-L77+0.01% 6-BA)將菌體重懸至OD600在0.6～1.0之間。采用浸花法[11]轉(zhuǎn)化擬南芥。

收取T0代種子，在含有潮霉素(25 mg/L)的MS培養(yǎng)基上篩選成功轉(zhuǎn)入pOsHGO∷GUS表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株，選取生長7～9 d抗性苗移栽至營養(yǎng)土中生長。收取T1代種子鋪種在含潮霉素(25 mg/L)的MS培養(yǎng)基上，得到分離比為3∶1的抗性苗和不抗苗。挑選抗性苗移栽至營養(yǎng)土中生長，得到T2代純合種子。將T2代的純合種子鋪種在含潮霉素(25 mg/L)的MS培養(yǎng)基上，選取生長7～9 d的抗性苗，同時(shí)取相同生長狀況的轉(zhuǎn)入pCAMBIA1301質(zhì)粒的擬南芥幼苗作為陽性對(duì)照以及Col-0野生型作為陰性對(duì)照，置于GUS染液中完全浸泡，37 ℃染色過夜后用卡諾固定液脫色5～10 h，75%無水乙醇洗滌1～2次，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果并進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1OsHGO啟動(dòng)子序列分析

通過plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)OsHGO基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其包含了啟動(dòng)子必需的核心原件CAAT-box和TATA-box，還有大量光反應(yīng)元件，如ACE、AE-box、Box-4、G-Box、I-box等；部分與生物脅迫相關(guān)的順式調(diào)控原件，如脫落酸、赤霉素、水楊酸、生長素等激素應(yīng)答元件(ABRE、GARE-motif、TCA-element、TGA-element)，響應(yīng)真菌刺激的Box-W1；非生物脅迫相關(guān)的調(diào)控原件有熱激反應(yīng)調(diào)控位點(diǎn)HSE，參與干旱脅迫誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。這表明HGO基因啟動(dòng)子在調(diào)控植物生長發(fā)育的過程中起到了重要作用。

圖1 OsHGO啟動(dòng)子序列分析結(jié)果

2.2OsHGO啟動(dòng)子重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以3葉期水稻的總DNA為模板，通過引物HGO-F/HGO-R擴(kuò)增出一段大小約為1500 bp的目的片段

(圖2-A)，與預(yù)期片段大小相符。經(jīng)過XbaⅠ和NcoⅠ雙酶切連接至pCAMBIA1301載體上驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)。為了驗(yàn)證目的片段是否成功連接至載體上，對(duì)重組載體進(jìn)行雙酶切檢測，結(jié)果出現(xiàn)了2條帶：一條帶大小約為15 kb，與載體片段大小一致；另一條帶大小約為1.5 kb，與目的片段大小一致(圖2-B)，這表明OsHGO基因啟動(dòng)子成功連接至pCAMBIA1301載體上。

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定及GUS染色分析

采用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥后，將收取到的T0代種子鋪種在含潮霉素(25 mg/L)的MS培養(yǎng)基上。因潮霉素對(duì)擬南芥真葉的生長具有抑制作用[12]，所以只有成功轉(zhuǎn)入帶有潮霉素抗性基因的pOsHGO∷GUS重組表達(dá)載體，才能在含潮霉素的培養(yǎng)基上正常生長(圖3-A)，而未轉(zhuǎn)入抗性基因的野生型，在加入潮霉素的培養(yǎng)基上生長將會(huì)被抑制(圖3-B)。

為了檢測OsHGO基因啟動(dòng)子的表達(dá)活性，將轉(zhuǎn)基因擬南芥的T2代種子播種于含潮霉素(25 mg/L)抗性的MS固體培養(yǎng)基上，對(duì)生長7 d的幼苗進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色檢測，染色結(jié)果顯示：GUS基因未在陰性對(duì)照幼苗中表達(dá)(圖4-A)，轉(zhuǎn)入pCAMBIA1301質(zhì)粒的陽性對(duì)照(圖4-B)幼苗中，GUS基因在根、下胚軸、葉中都高度表達(dá)，而轉(zhuǎn)入重組載體的擬南芥幼苗(圖4-C)中，真葉內(nèi)GUS基因的表達(dá)非常微弱，只有葉脈和葉尖上有微弱的表達(dá)，其他部位與陽性對(duì)照相似。

A為HGO基因啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增結(jié)果：Line 1為Marker(4K),Line 2～5為HGO啟動(dòng)子片段。B為pOsHGO∷GUS表達(dá)載體雙酶切檢測結(jié)果：Line 1為Marker(15K),Line 2為未酶切質(zhì)粒，Line 3、Line 4 為重組載體酶切

圖2pOsHGO∷GUS重組表達(dá)載體的構(gòu)建

A.紅色箭頭所指為轉(zhuǎn)基因陽性植株；B.未轉(zhuǎn)基因野生型植株

3 結(jié)論與討論

本研究成功構(gòu)建了水稻HGO基因啟動(dòng)子與GUS載體的重組表達(dá)載體，經(jīng)過電泳及測序檢測，證實(shí)目的片段與pCAMBIA1301在預(yù)測位點(diǎn)重組且插入片段無錯(cuò)配現(xiàn)象、大小正確。對(duì)擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化后代進(jìn)行篩選，在含有潮霉素(25 mg/L)的MS培養(yǎng)基上獲得抗性苗，GUS染色結(jié)果表明：OsHGO基因啟動(dòng)子成功轉(zhuǎn)入植株中且具有活性，因此重組載體可用于OsHGO基因在植物中表達(dá)情況的觀察。

本試驗(yàn)GUS染色的結(jié)果顯示水稻HGO基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入擬南芥，在根、下胚軸、葉柄和子葉中的表達(dá)量都較高，在真葉中只有葉脈和葉尖上有微弱的表達(dá)。根、下胚軸、葉柄和子葉中的表達(dá)量較高，說明在這些部位中酪氨酸的含量較高，酪氨酸降解途徑較為活躍；而真葉中只有葉脈和葉尖上有微弱的表達(dá)，說明酪氨酸在真葉上的積累較少，只在葉脈和葉尖上有少量積累，且酪氨酸降解途徑較為緩慢。在植株的不同組織部位，因生命活動(dòng)及功能的不同會(huì)導(dǎo)致同種物質(zhì)在不同組織中的特異性表達(dá)。水稻HGO基因就表現(xiàn)出這一特性，但HGO在酪氨酸降解途徑中的具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

A.陰性對(duì)照植株；B.陽性對(duì)照植株；C.轉(zhuǎn)基因植株

[1] Colditz P B, Yu J S, Billson F A. Tyrosinaemia Ⅱ[J]. Med J Aust, 1984, 141(4): 244-245.

[2] Dixon D P, Edwards R. Enzymes of tyrosine catabolism inArabidopsisthaliana[J]. Plant Science, 2006, 171(3): 360-366.

[3] Gagné R, Lescault A, Grenier A, et al. Prenatal diagnosis of hereditary tyrosinemia: Measurement of succinylacetone inamniotic fluid[J]. Prenat Diagn, 1982, 2(3): 185-188.

[4] Scriver C R, Clow C L. Phenylketonuria and other phenylalanine hydroxylation mutants in man[J]. Genetics, 1980, 14(14): 179-202.

[5] Han C Y, Ren C M, Zhi T T, et al. Disruption of fumarylacetoacetate hydrolase causes spontaneous cell death under short-day conditions in Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2013, 162(4): 1956-1964.

[6] 支添添，周舟，韓成云，等.臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定擬南芥sdl1突變體的細(xì)胞死亡[J].作物研究，2013，27(3)：217-218.

[7] 陳彥成.植物HGO基因功能的初步研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[8] 陳彥成，錢偉超，彭志紅，等.酪氨酸及酪氨酸降解途徑中HGO基因突變對(duì)擬南芥幼苗生長的影響[J].作物研究，2014，28(3)：251-253.

[9] 顏彥.水稻組織特異表達(dá)啟動(dòng)子的克隆及功能分析[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[10] Saghai M aroof M A, Solin an K M,Gorgensen R A, et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics[J]. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the USA, 1984, 81(21)： 8014-8018.

[11] Clough S, Bent A. Floral dip: a simpli fied method for Agrobacteriummediated transformation ofArabidopsisthaliana[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 1998, 16(6): 735-743.

[12] 丁笑生，段紅英，段志坤，等.潮霉素對(duì)擬南芥幼苗真葉形成的影響[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，38(5)：163-166.

(責(zé)任編輯：曾小軍)

Cloning, Transformation and Identification of GeneHGOPromoter in Rice

CAI Wei1, CHEN Yan-cheng2, HUANG Li-hua1, ZHI Tian-tian1, REN Chun-mei1,3*

(1. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Hunan Rice Research Institute, Changsha 410125, China; 3. Hunan Provincial Key Laboratory of Crop Gene Engineering, Changsha 410128, China)

GeneHGOencodes 1,2-homogentisate dioxygenase, which functions in Tyr degradation pathway. In order to further investigate the expression characteristics of theHGOgene in rice, we constructed rice geneHGOpromoter and GUS recombinant expression vector, and transformed this expression vector intoArabidopsisthalianato obtain transgenic plants by usingAgrobacterium-mediated floral dip method. By histochemical GUS staining, we found that the riceHGOgene promoter was highly expressed in the root, hypocotyl, petiole and cotyledon ofA.thaliana, but it was lowly expressed in the euphylla vein and euphylla apex ofA.thaliana.

Rice;HGOgene; Promoter; Vector construction

2016-09-19

國家科技部973前期研究專項(xiàng)(2014CB160308)。

蔡薇(1992─)，女，湖南湘潭人，碩士研究生，主要從事植物分子遺傳學(xué)研究。*通訊作者:任春梅。

Q786

A

1001-8581(2017)03-0018-04