魯斯可皂苷元制備方法研究

曹青云，李 琦，王 敏，肖順麗，高榮凱，張宏桂

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

·實(shí)驗(yàn)研究·

魯斯可皂苷元制備方法研究

曹青云，李 琦，王 敏，肖順麗，高榮凱，張宏桂

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

目的探尋從麥冬中分離、純化魯斯可皂苷元的方法。方法80%乙醇提取總皂苷，兩相酸水解總皂苷，硅膠柱層析分離，甲醇重結(jié)晶，薄層色譜（TLC）法、高效液相色譜（HPLC）法檢查純度。結(jié)果魯斯可皂苷元經(jīng)TLC檢查與對(duì)照品一致，無(wú)雜質(zhì)斑點(diǎn)，HPLC法檢查純度達(dá)98．58%。結(jié)論該試驗(yàn)中建立的制備方法簡(jiǎn)單、安全、可行性強(qiáng)，成本低，效率高，可用于制備魯斯可皂苷元。

麥冬；魯斯可皂苷元；制備；薄層色譜法；高效液相色譜法

麥冬 Ophiopogonis Radix為百合科植物麥冬Ophiopogon japonicus（Linn．f．）Ker－Gawl．的干燥塊根，味甘、微苦，歸心、肺、胃經(jīng)，有養(yǎng)陰生津、潤(rùn)肺清心等功效，常用于治療肺燥干咳、陰虛癆嗽、喉痹咽痛、津傷口渴等癥[1]。麥冬中所含化學(xué)成分主要有皂苷類、黃酮類、氨基酸類、多糖類及揮發(fā)油等。研究表明，麥冬有抗心肌缺血[2－4]、降血糖[2，5－6]、抗炎[7－8]、抗腫瘤[9－11]、增強(qiáng)免疫[12－13]等作用。麥冬甾體皂苷是麥冬的主要活性成分，魯斯可皂苷元是其藥材質(zhì)量控制的關(guān)鍵性指標(biāo)，是2015年版《中國(guó)藥典(一部)》規(guī)定的麥冬藥材質(zhì)量檢驗(yàn)的化學(xué)對(duì)照品，現(xiàn)有文獻(xiàn)針對(duì)魯斯可皂苷元的提取分離多用制備型高效液相分離儀，但制作成本較高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。本試驗(yàn)中采用乙醇提取，兩相酸水解，硅膠柱層析分離，甲醇重結(jié)晶的方法制備魯斯可皂苷元，效果滿意?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Waters 1525型高效液相色譜儀，Breeze 2色譜工作站，Waters 2489型紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，色譜柱為Waters SunfireTMC18柱（150 mm×4．6 mm，5 μm）(美國(guó) Waters公司)；FLBP－250型萬(wàn)能高速粉碎機(jī)（上海菲力博食品機(jī)械有限公司）；SHB－Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BS223S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；薄層色譜及柱色譜用硅膠（青島海洋化工廠）。

1．2 試藥

魯斯可皂苷元對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111909－201204，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98．4%；甲醇（賽默飛世爾科技＜中國(guó)＞有限公司）為色譜純；其他試劑均為分析純；麥冬藥材購(gòu)自河北安國(guó)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)張貴君教授鑒定為 Ophiopogon japonicus（Linn．f．）Ker－Gawl．的干燥塊根。

2 方法與結(jié)果

2．1 提取與分離

取麥冬藥材2 kg，粉碎，過(guò)20目篩，置圓底燒瓶中，用10倍量80%乙醇加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，減壓回收乙醇至無(wú)乙醇味，得總皂苷浸膏。采用兩相酸水解法，將總皂苷浸膏置圓底燒瓶中，加入10倍量5%硫酸（下層），6倍量石油醚與二氯甲烷（3∶1）混合液，加熱水解5 h，冷卻后得酸水層和有機(jī)層，用等體積的二氯甲烷萃取酸水層3次，與有機(jī)層合并，用水洗至pH接近7，濃縮至干，得浸膏。將硅膠（200～300目）石油醚濕法裝柱。將酸水解得到的浸膏用硅膠（100～200目）拌樣，揮干溶劑，干法上樣，進(jìn)行柱色譜分離。用二氯甲烷－石油醚－甲醇（V∶V∶V，10∶10∶1）洗脫，收集餾分，根據(jù)薄層色譜檢識(shí)，合并相同斑點(diǎn)的餾分。含有魯斯可皂苷元的餾分濃縮后放置，析出白色針晶，即為魯斯可皂苷元粗品，粗品用甲醇重結(jié)晶多次，即得魯斯可皂苷元純品。

2．2 結(jié)構(gòu)鑒定

白色針狀結(jié)晶（甲醇），與魯斯可皂苷元對(duì)照品同條件下薄層層析顯示二者保留因子（Rf）值一致；1H－NMR（500 MHz，CDCl3），δ：0．79（3H，s，H－18），0．98（3H，d，H－27），1．05（3H，s，H－19），1．46（3H，d，H－21），3．37（1H，m，H－1），3．56（1H，m，H－3），5．54（1H，d，H－6），與文獻(xiàn)[14]研究數(shù)據(jù)一致，鑒定為魯斯可皂苷元。

2．3 純度檢查

2．3．1 薄層色譜（TLC）法

將制備的魯斯可皂苷元和對(duì)照品分別點(diǎn)樣于硅膠G254板上，分別以石油醚－二氯甲烷－甲醇（10∶10∶1）、環(huán)己烷－乙酸乙酯－冰乙酸（6∶2∶0．6）、二氯甲烷－甲醇（12∶1）為展開(kāi)劑進(jìn)行硅膠薄層層析，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，加熱，在紫外燈365 nm波長(zhǎng)下觀察。結(jié)果樣品與對(duì)照品Rf值相同，均無(wú)雜質(zhì)斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

2．3．2 高效液相色譜（HPLC）法

色譜條件：色譜柱為WatersSunfireTMC18柱（150mm× 4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇－水溶液（85∶15），流速為1．0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm；柱溫為35℃。樣品與對(duì)照品的質(zhì)量濃度均為1 mg／mL。在此色譜條件下，理論板數(shù)按魯斯可皂苷元峰計(jì)應(yīng)不低于3 000。取魯斯可皂苷元對(duì)照品與樣品各10 μL進(jìn)樣，相應(yīng)的樣品與對(duì)照品出峰時(shí)間一致，按面積歸一化法計(jì)算，魯斯可皂苷元的純度為98．58%，見(jiàn)圖2。

3 討論

本試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的制備工藝主要包括麥冬總皂苷的提取、兩相酸水解、硅膠柱層析得粗品、重結(jié)晶4個(gè)步驟，在較短時(shí)間內(nèi)應(yīng)用簡(jiǎn)單的常規(guī)提取分離方法，從麥冬中分離出符合2015年版《中國(guó)藥典（一部）》標(biāo)準(zhǔn)的魯斯可皂苷元對(duì)照品，且較傳統(tǒng)方法優(yōu)勢(shì)明顯。現(xiàn)有文獻(xiàn)中關(guān)于麥冬中魯斯可皂苷元的分離純化較少，且相關(guān)文獻(xiàn)、專利大多采用制備型高效液相分離儀，試驗(yàn)成本較高，而本試驗(yàn)中采用傳統(tǒng)的硅膠柱層析分離，甲醇重結(jié)晶的方法制備魯斯可皂苷元，試驗(yàn)成本低，易于工業(yè)化生產(chǎn)。

圖1 不同展開(kāi)劑的薄層色譜圖

圖2 高效液相色譜圖

傳統(tǒng)水解總皂苷常用酸水解法，可能破壞苷元結(jié)構(gòu)，且硅膠柱層析分離中多采用含有三氯甲烷的洗脫系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。而本試驗(yàn)中采用兩相酸水解法，水解得到的苷元得以迅速進(jìn)入有機(jī)相中，可保護(hù)苷元結(jié)構(gòu)不被破壞，且由于采用二氯甲烷，減少了對(duì)環(huán)境的污染，相對(duì)更安全。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：155．

[2]馬艷春，朱丹妮，余伯陽(yáng)，等．麥冬水提物抗急性心肌缺血活性部位的初步篩選[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（3）：561－563．

[3]Wang S，Zhang Z，Lin X，et al．A polysaccharide，MDG－1，induces S1P1 and bFGF expressionand augments survival andangiogenesis in the ischemic heart[J]．Glycobiology，2010，20（4）：473－484．

[4]Tao J，Wang H，Zhou H，et al．The saponin monomer of dwarf lilyturf tuber，DT－13，reduces L－type calcium currents during hypoxia in adult rat ventricular myocytes[J]．Life Sci，2005，77（24）：3021－3030．

[5]許 潔．麥冬多糖 MDG－1口服降糖及作用機(jī)制研究[D]．上海：上海中醫(yī)藥大學(xué)，2011．

[6]毛 訊．麥冬天冬提取物對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖及胸腺、脾臟指數(shù)的影響[J]．中國(guó)老年學(xué)雜志，2010，30（13）：1861－1862．

[7]田友清，寇俊萍，李林洲，等．短葶山麥冬水提物及其主要有效部位和成的抗炎活性[J]．中國(guó)天然藥物，2011，9（3）：222－226．

[8]Hung TM，Thu CV，Dat NT，et，al．Homoisoflavonoid derivatives from the roots of Ophiopogon japonicus and their in vitro anti－inflammolation activity[J]．Bioorg Med Chem Lett，2010，20（8）：2412－2416．

[9]Sun L，Lin S．The saponin monomer of dwarf lilyturf tuber，DT－13，reduces human breast cancer cell adhesion and migration during hypoxia via regulation of tissue factor[J]．Biol Pharm Bull，2010，33（7）：1192－1198．

[10]汪 波，丁德秭．四君子湯合沙參麥冬湯加減配合化療治療中晚期非小細(xì)胞肺癌臨床觀察[J]．世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，4（8）：564－566．

[11]周宇輝，詹 ，唐于平，等．麥門(mén)冬合千金葦莖湯抑制A549細(xì)胞增殖作用及其機(jī)制[J]．中國(guó)肺癌雜志，2010，13（5）：477－482．

[12]茍興能，張克英，楊興江，等．川麥冬多糖對(duì)恒磁場(chǎng)致小鼠免疫損傷的防護(hù)作用[J]．四川中醫(yī)，2009，27（5）：18－20．

[13]Xiong SL，Hou DB，Hang N，et al．Preparation and biological activity of saponin from Ophiopogon japonicas[J]．Afr J Pharm Pharmacol，2012，6（26）：1964－1970．

[14]馬海波．麥冬化學(xué)成分的研究[D]．北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2013．

Preparation Method of Ruscogenin

Cao Qingyun，Li Qi，Wang Min，Xiao Shunli，Gao Rongkai，Zhang Honggui
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，China 100102）

Objective To investigate the method of separating and purifying ruscogenin from Ophiopogon japonicus．Methods 80% ethanol was used to extract the total saponins，two－phase acid hydrolysis of total saponins，silica gel column chromatography separation，methanol recrystallization；TLC，HPLC methods were used to check the purity．Results Ruscogenin was consistent with the control substance by TLC and no impurity spots．The purity was 98．58% by HPLC．Conclusion The preparation method is simple，safe，feasible with low cost and high efficiency．The obtained ruscogenin can be used as a reference substance for qualitative and quantitative analysis of traditional Chinese medicine．

Ophiopogon japonicus；ruscogenin；preparation；TLC；HPLC

R282．4；R282．71

A

1006－4931(2017)04－0006－03

2016－11－07；

2016－11－18)

10．3969／j．issn．1006－4931．2017．04．002

國(guó)家自然科學(xué)基金[31070328]。

曹青云（1992－），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)，（電子信箱）caoqingy＠126．com。

張宏桂（1955－），男，教授，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)應(yīng)用及體內(nèi)代謝，（電話）010－84738642（電子信箱）bzy714＠163．com。