加味活絡(luò)效靈丹對啤酒誘發(fā)痛風(fēng)模型大鼠關(guān)節(jié)組織中IL—1β表達的影響

徐衛(wèi)東+羅紅梅+喻建平

【摘 要】目的：通過觀察活絡(luò)效靈丹對啤酒誘發(fā)痛風(fēng)模型大鼠的影響，對活絡(luò)效靈丹治療痛風(fēng)的療效及機制進行探索。方法：將60只雄性SD大鼠隨機分為空白對照組，造模啤酒組，加味活絡(luò)效靈丹高、中、低劑量組，每組12只。除空白對照組外，其余各組大鼠注射尿酸鈉誘導(dǎo)痛風(fēng)模型。空白對照組給予生理鹽水灌胃，其余各組均給予啤酒灌胃，加味活絡(luò)效靈丹高、中、低劑量組同時予以加味活絡(luò)效靈丹湯液高、中、低劑量灌胃。觀察各組大鼠的飲食、二便、毛色、精神狀態(tài)及活動情況，受試關(guān)節(jié)周徑變化；ELISA法檢測關(guān)節(jié)組織中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的水平。結(jié)果：與造模啤酒組比較，加味活絡(luò)效靈丹高、中、低各劑量組大鼠的飲食、二便、毛色、精神狀態(tài)及活動情況均有所改善。與空白對照組比較，造模啤酒組大鼠的受試關(guān)節(jié)周徑有所增加（P < 0.05）；與造模啤酒組比較，加味活絡(luò)效靈丹高、中、低各劑量組大鼠的受試關(guān)節(jié)周徑均有所減少（P < 0.05）。與空白對照組比較，造模啤酒組大鼠的關(guān)節(jié)組織中IL-1β的表達有所增加（P < 0.05）；與造模啤酒組比較，加味活絡(luò)效靈丹高、中、低各劑量組大鼠的關(guān)節(jié)組織中IL-1β的表達均有所降低（P < 0.05）。結(jié)論：加味活絡(luò)效靈丹可通過降低關(guān)節(jié)組織中IL-1β的表達而起到治療痛風(fēng)的作用。

【關(guān)鍵詞】 痛風(fēng)；高尿酸血癥；活絡(luò)效靈丹；IL-1β；大鼠

Effect of Modified Huoluo Xiaoling Dan（活絡(luò)效靈丹）on the Expression of IL-1β in Tissue of Beer-induced

Gout Rat Models

XU Wei-dong，LUO Hong-mei，YU Jian-ping

【ABSTRACT】Objective：To probe the therapeutic mechanism of Huoluo Xiaoling Dan（活絡(luò)效靈丹）

by observing its effect on beer-induced gout rat models.Methods：Sixty male SD rats were randomly divided into a blank control group，a beer model group，and high-dose，medium-dose and low-dose groups of Huoluo Xiaoling Dan，12 rats in each group.Except the blank control group，the rats in the other groups were induced by sodium urate injection to establish gout models.The blank control group was given intragastric administration of normal saline，while the other groups were given intragastric administration of beer.At the same time，the high-dose，medium-dose and low-dose groups were also given intragastric administration of corresponding doses of modified Huoluo Xiaoling Dan.An observation was made on the rats diet，urine，stool，hair color，mental state，activity and the circumference of subject joints.ELISA method was used to detect the level of IL-1β in the joint tissue.Results：Compared with the beer model group，the diet，urine，stool，hair color，mental state and activity of rats in the three groups of modified Huoluo Xiaoling Dan were improved to a certain degree.Compared with the blank control group，the joint circumference of rats in the beer model group increased to a certain degree

（P < 0.05）.Compared with the beer model group，the joint circumference of rats in the high-dose，medium-dose and low-dose groups decreased to a certain degree（P < 0.05）.Compared with the blank control group，the expression of IL-1β

in the beer model group increased to a certain degree（P < 0.05）.Compared with the beer model group，the expression of IL-1β in the high-dose，medium-dose and low-dose groups decreased to a certain degree （P < 0.05）.Conclusion：Modified Huoluo Xiaoling Dan treats gout by reducing the expression of IL-1β in the joint tissue.

【Keywords】 gout；hyperuricemia；Huoluo Xiaoling Dan（活絡(luò)效靈丹）；IL-1β；rats

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是嘌呤代謝紊亂和（或）尿酸排泄減少引起的一種晶體性關(guān)節(jié)炎，臨床特點為反復(fù)發(fā)作的急性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石沉積、痛風(fēng)石性慢性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)畸形，并且常累及腎和心臟，并引起多臟器損傷。我國痛風(fēng)發(fā)病率達0.26%～0.34%。痛風(fēng)的急性發(fā)作往往存在一定的誘因，目前認(rèn)為高嘌呤飲食與其急性發(fā)作密切相關(guān)，有更進一步的報道顯示，在痛風(fēng)的發(fā)病過程中，痛風(fēng)急性發(fā)作的誘發(fā)因素依次為暴飲暴食，特別是酗酒和高嘌呤飲食（25.4%）、勞累（12.6%）、感染（7.2%）、受涼（5.8%）、外傷（5.1%）等[1-4]。從臨床觀察來看，飲用啤酒和高嘌呤飲食是最常見的外界誘發(fā)因素。已有的臨床報告表明，活絡(luò)效靈丹方加減治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有一定療效[5-6]。但目前痛風(fēng)發(fā)病的具體作用機制還不清楚。本研究擬通過觀察活絡(luò)效靈丹對啤酒誘發(fā)痛風(fēng)模型大鼠的影響及其對關(guān)節(jié)組織中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）表達的影響，以揭示加味活絡(luò)效靈丹治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的藥理機制，為其進一步的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 4周齡SPF級SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量280～300 g，動物合格證號：SCXK（滬）2011-0003。實驗動物由江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 大鼠IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；南昌啤酒，乙醇8%vol；酶標(biāo)儀、洗板機（BIO-RAD公司）；微量移液器（德國Eppendorf公司）；超純水儀（Millipore公司）。

1.3 藥 物 加味活絡(luò)效靈丹藥物組成：金銀花10 g、山慈菇10 g、當(dāng)歸10 g、丹參10 g、制乳香10 g、制沒藥10 g。由本院藥劑科制劑室制成棕褐色藥液，每100 mL含中藥飲片生藥360 g。

2 方 法

2.1 動物分組 將60只SD大鼠隨機分為空白對照組，造模啤酒組，加味活絡(luò)效靈丹高、中、低劑量組，每組12只。

2.2 造模方法 除空白對照組外，其余各組大鼠以碘酒、酒精消毒局部，用6號滅菌注射針在大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)，從45°方向插入至脛骨肌腱內(nèi)側(cè)，將尿酸鈉溶液0.2 mL注入到關(guān)節(jié)腔，制備大鼠痛風(fēng)模型。

2.3 尿酸鈉溶液制備方法 388 mL蒸餾水加12 mL

體積分?jǐn)?shù)為1 mol·L-1的NaOH，煮沸后，加入

2 g尿酸，用HCL調(diào)pH至7.2，攪拌冷卻，4 ℃冰箱保存24 h，去上清液，用濾紙將沉淀物水分吸干，放入干燥箱（溫度70 ℃）烘2 h，取出，刮下粉末，放入研缽研成細(xì)末，制成尿酸鈉結(jié)晶。動物造模前，取500 mg尿酸鈉結(jié)晶加18 mL生理鹽水，再加

2 mL吐溫80，加熱攪拌，配成20 mL尿酸鈉溶液。

2.4 給藥方法 所有大鼠均于造模當(dāng)天開始灌胃?？瞻讓φ战M以生理鹽水2 mL·（100 g）-1·d-1灌胃；造模啤酒組給予啤酒9 mL·kg-1·d-1灌胃；加味活絡(luò)效靈丹高劑量組給予啤酒9 mL·kg-1·d-1、

加味活絡(luò)效靈丹湯48 g·kg-1·d-1灌胃；加味活絡(luò)效靈丹中劑量組給予啤酒9 mL·kg-1·d-1、加味活絡(luò)效靈丹湯24 g·kg-1·d-1灌胃；加味活絡(luò)效靈丹低劑量組給予啤酒9 mL·kg-1·d-1、加味活絡(luò)效靈丹湯12 g·kg-1·d-1灌胃。連續(xù)灌胃7 d后斷頭處死所有大鼠，并取右側(cè)后肢，低溫冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 觀察指標(biāo) 觀察大鼠的飲食、二便、毛色、精神狀態(tài)及活動情況。所有大鼠均在造模前1 d，用軟皮尺測量各鼠右后肢踝關(guān)節(jié)周徑，在處死動物前，再用軟皮尺在前次相同部位測量關(guān)節(jié)周徑。比較各組動物造模前后關(guān)節(jié)周徑的增大程度。

2.6 實驗室指標(biāo)檢測 取低溫保存的踝關(guān)節(jié)組織100 mg置于研缽中，加液氮研成粉末后，加入

1 mL生理鹽水，充分勻漿，取上清液，采用ELISA法檢測IL-1β的水平。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 大鼠一般情況 造模啤酒組大鼠飲食減少、二便減少、毛色粗糙、精神萎靡及活動減少。與造模啤酒組比較，加味活絡(luò)效靈丹高、中、低各劑量組大鼠的飲食、二便、毛色、精神狀態(tài)及活動情況均有所改善，以加味活絡(luò)效靈丹高劑量組改善最為明顯。

3.2 各組大鼠關(guān)節(jié)周徑比較 與空白對照組比較，造模啤酒組大鼠的受試關(guān)節(jié)周徑增加（P < 0.05）；

與造模啤酒組比較，加味活絡(luò)效靈丹高、中、低各劑量組大鼠的受試關(guān)節(jié)周徑均有所減小

（P < 0.05）。

3.3 各組大鼠關(guān)節(jié)組織中IL-1β的表達比較 與空白對照組比較，造模啤酒組大鼠的關(guān)節(jié)組織中IL-1β的表達升高（P < 0.05）；與造模啤酒組比較，加味活絡(luò)效靈丹高、中、低各劑量組大鼠的關(guān)節(jié)組織中IL-1β的表達均有所降低（P < 0.05）。

4 討 論

痛風(fēng)的發(fā)病主要與血尿酸水平相關(guān)，并受到一些環(huán)境及情緒因素的影響，約有5%～18.8%的高尿酸患者發(fā)展為痛風(fēng)，發(fā)展成痛風(fēng)或腎病變的幾率與血尿酸值或持續(xù)時間呈正比。臨床上僅有很少一部分高尿酸血癥患者出現(xiàn)尿酸鹽沉積或痛風(fēng)石，這可能與體內(nèi)環(huán)境，如溫度和pH值的改變、關(guān)節(jié)局部創(chuàng)傷、感染等因素相關(guān)。目前認(rèn)為，痛風(fēng)的急性發(fā)作往往與高嘌呤飲食（如飲用啤酒）等誘因密切相關(guān)[7-12]。最近，在尿酸鹽結(jié)晶介導(dǎo)的自身炎癥反應(yīng)研究方面有了重要進展。尿酸鹽結(jié)晶通過各種機制激發(fā)固有免疫應(yīng)答并參與誘導(dǎo)獲得性免疫。目前已證實尿酸鈉晶體作為一種危險信號，被固有免疫執(zhí)行細(xì)胞所帶有的模式識別受體（PRRS）所識別，啟動固有免疫，經(jīng)胞內(nèi)一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終激活I(lǐng)L-1和IL-18，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。IL-1β的產(chǎn)生為尿酸鈉晶體導(dǎo)致的炎癥級聯(lián)反應(yīng)的早期?；罨腎L-1β通過激活I(lǐng)L-1受體（IL-1R）使趨化因子和其他炎癥調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞進入關(guān)節(jié)等尿酸鹽沉積部位，并能使機體產(chǎn)生發(fā)熱反應(yīng)，導(dǎo)致痛風(fēng)的炎癥產(chǎn)生[13]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痛風(fēng)是由于內(nèi)有營衛(wèi)失調(diào)，氣血虧損，復(fù)感風(fēng)寒濕熱之邪，或飲酒縱欲而感風(fēng)寒濕之邪，導(dǎo)致經(jīng)脈結(jié)滯，血氣不行，四肢關(guān)節(jié)為病邪閉阻，不通則痛。故此，“瘀”在痛風(fēng)的發(fā)病中處于重要位置。治療上也以活血化瘀、通絡(luò)止痛為原則。活絡(luò)效靈丹出自張錫純的《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，組成為當(dāng)歸、丹參、生明乳香、生明沒藥。原文述：“治氣血凝滯，癖瘕，心腹疼痛，腿疼臂疼，內(nèi)外瘡瘍，一切臟腑積聚，經(jīng)絡(luò)湮瘀。”有實驗研究表明，當(dāng)歸及其有效成分阿魏酸具有明顯的抑制巨噬細(xì)胞活化、抑制花生四烯酸代謝等抗炎藥理作用。丹參中有效成分丹參素可抑制血小板血栓素A2合成和釋放的前列腺素類縮血管物質(zhì)。對乳香提取物進行實驗研究發(fā)現(xiàn)，乳香提取物能減輕膝關(guān)節(jié)炎疼痛，增強骨關(guān)節(jié)的屈伸以減少關(guān)節(jié)部位的隆突，并有修復(fù)功能[14-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，造模啤酒組大鼠的受試關(guān)節(jié)周徑有所增加，關(guān)節(jié)組織中IL-1β的表達有所增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。說明飲用啤酒確能誘發(fā)痛風(fēng)急性發(fā)作。同時，與造模啤酒組比較，加味活絡(luò)效靈丹高、中、低各劑量組大鼠的飲食、二便、毛色、精神狀態(tài)及活動情況均有所改善，大鼠的受試關(guān)節(jié)周徑均有所減小，大鼠關(guān)節(jié)組織中IL-1β的表達均有所降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義

（P < 0.05）。上述結(jié)果表明，加味活絡(luò)效靈丹可通過降低關(guān)節(jié)組織中IL-1β的表達而起到治療痛風(fēng)的作用。

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收稿日期：2016-06-23；修回日期：2016-12-22