HBV DNA整合與肝癌關(guān)系的研究進(jìn)展

方向，鄧偉

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所，南寧530021)

·綜述·

HBV DNA整合與肝癌關(guān)系的研究進(jìn)展

方向，鄧偉

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所，南寧530021)

乙型肝炎病毒(HBV)與人基因組整合在肝細(xì)胞癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前研究表明，HBV包含編碼表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X蛋白的4個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，均可以形成斷裂位點(diǎn)整合到人基因組，其整合率從高至低依次是X區(qū)、S區(qū)、C區(qū)和P區(qū)。HBV在人染色體上的整合位點(diǎn)并非隨機(jī)分布，而是存在與肝癌相關(guān)的潛在優(yōu)勢(shì)整合位點(diǎn)，這些優(yōu)勢(shì)整合位點(diǎn)附近的基因常常涉及到細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和永生化。HBV DNA整合入人基因組后，通過(guò)影響整合位點(diǎn)周?chē)蚬δ?、形成具有致癌作用的HBV截短蛋白以及增加人染色體的不穩(wěn)定性促使肝細(xì)胞的癌變。

乙型肝炎病毒；DNA整合；肝細(xì)胞癌；宿主基因組；遺傳信息；染色體異位；堿基缺失

肝細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌)是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位。全球每年有大約60萬(wàn)人死于肝癌，其中將近一半發(fā)生在中國(guó)[1]。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是我國(guó)肝癌最重要的危險(xiǎn)因素，在HBV慢性感染期間，HBV可以通過(guò)DNA整合來(lái)影響整合位點(diǎn)周?chē)蚬δ?，破壞或促進(jìn)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化至關(guān)重要基因的表達(dá)，從而促進(jìn)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[2]。目前研究[3～6]證實(shí)，HBV DNA可通過(guò)整合進(jìn)入宿主基因組促使肝細(xì)胞癌變。現(xiàn)將HBV整合與肝癌關(guān)系的研究進(jìn)展綜述如下。

1 HBV整合的機(jī)制與特點(diǎn)

1.1 HBV整合機(jī)制 1980年人們首次在HBV相關(guān)性肝癌患者體內(nèi)中檢測(cè)到HBV DNA與人染色體整合[7]。HBV復(fù)制過(guò)程中存在反轉(zhuǎn)錄這一特殊階段，人體感染HBV后，HBV病毒成熟體通過(guò)黏附進(jìn)入到肝細(xì)胞，HBV DNA疏松的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(rcDNA)首先轉(zhuǎn)變?yōu)殚]合環(huán)狀DNA(cccDNA)，接著cccDNA轉(zhuǎn)錄為前基因組RNA(pgRNA)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后反轉(zhuǎn)錄為rcDNA，rcDNA再次進(jìn)入肝細(xì)胞核循環(huán)。在cccDNA的循環(huán)中，部分rcDNA可能復(fù)制失敗，形成雙鏈線型DNA(d1DNA)，d1DNA可以在斷裂DNA修復(fù)過(guò)程中再次整合入宿主基因。同時(shí)，HBV感染可造成其雙鏈DNA斷裂(DsBs)，DsBs修復(fù)途徑可以把不同來(lái)源的非鄰近的DNA片段拼接起來(lái)，這就為HBV整合入宿主基因提供了分子基礎(chǔ)。HBV整合至宿主基因組中有利于其持續(xù)感染，長(zhǎng)期慢性炎癥可以導(dǎo)致肝細(xì)胞生命周期改變和增殖，增加宿主基因組DNA終端數(shù)量，反過(guò)來(lái)又有利于HBV DNA整合到宿主基因組中[8]。

1.2 HBV整合特點(diǎn) HBV是具有松弛環(huán)形部分雙鏈的DNA病毒，全長(zhǎng)3 200 bp，由長(zhǎng)短2條鏈組成。其中長(zhǎng)鏈為負(fù)鏈，攜帶編碼HBV蛋白的所有遺傳信息，其包含編碼表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X蛋白的4個(gè)重疊的開(kāi)放閱讀框(ORF)。理論上4個(gè)ORF均可以形成斷裂位點(diǎn)插入到人基因組，但研究發(fā)現(xiàn)它們整合的頻率并不相同，其整合率從高至低依次是X、S、C、P，目前尚無(wú)完整HBV DNA整合到人基因組的病例報(bào)道。HBV這4個(gè)ORF在與人染色體整合后會(huì)重新排列，這種排列紊亂會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)異常，如果這種異常不斷疊加，最終會(huì)促使細(xì)胞癌變。

X基因是HBV DNA中最小的一個(gè)ORF，Jiang等[9]對(duì)癌組織與癌旁組織進(jìn)行對(duì)照，發(fā)現(xiàn)癌組織和癌旁組織中均存在整合，HBV整合部位平均分布在DR1和DR2附近。但屠紅等[10]對(duì)40例肝癌病例整合位點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，HBV DNA整合可發(fā)生在X基因的任意長(zhǎng)度，并非只出現(xiàn)在HBV DR1和DR2區(qū)，X基因有96%以截短形式插入宿主細(xì)胞DNA。研究表明，C-末端截短的HBX可以通過(guò)Stat3/Nanog級(jí)聯(lián)反應(yīng)增強(qiáng)肝癌干細(xì)胞樣特性，在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]。另外，C-末端截短的HBX可以促進(jìn)CD133肝癌干細(xì)胞亞型的出現(xiàn)，并在肝癌中表現(xiàn)出惡性和干細(xì)胞樣特征，通過(guò)激活法尼酯衍生物X受體(FXR)介導(dǎo)癌癥干細(xì)胞作用[12]。HBX蛋白作為反式激活因子，可以影響調(diào)節(jié)性非編碼RNA(ncRNA)，包括microRNA和長(zhǎng)ncRNA，HBX也參與表觀遺傳修飾和DNA修復(fù)，HBX與各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用，如p53、Wnt和核因子-κB通路[13]。另外，X蛋白還可引起肝癌中p21、p16、p62myc、c-myc、p2lras等癌基因和抑癌基因高表達(dá)[14，15]。另一個(gè)經(jīng)常出現(xiàn)斷裂整合的HBV基因是pre-S2/S基因，其編碼3種不同結(jié)構(gòu)相關(guān)的包膜蛋白，pre-S2蛋白可以作為反式激活因子，并與人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(hTERT)啟動(dòng)子相互作用，增加端粒酶活性[16]。pre-S2/S基因還可以產(chǎn)生截短的pre-S2/S蛋白，在大量肝癌組織中可以檢測(cè)到截短的pre-S2/S蛋白，這種截短的蛋白有與c-myc和c-fos相類(lèi)似的反式激活作用，可以通過(guò)激活與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，提高肝細(xì)胞的增生率[17]。

HBV整合可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型，Ⅰ型整合起始于DRl向負(fù)鏈3端延伸；Ⅱ型整合也起始于DRl，但延伸方向和Ⅰ型相反；Ⅲ型整合起自DR2向負(fù)鏈3端延伸；Ⅳ型整合也起自DR2，延伸方向和Ⅲ型相反。Chauhan等[18]報(bào)道，土撥鼠在感染HBV和土撥鼠肝炎病毒1 h后，其肝組織內(nèi)可以檢測(cè)到HBV和土撥鼠肝炎病毒DNA及其復(fù)制中間體，同時(shí)可以檢測(cè)到HBV DNA整合到宿主基因中，在感染后1 h和3 h可以檢測(cè)到土撥鼠肝炎病毒X和pre-S序列插入宿主基因組。該研究證實(shí)自然條件下的肝炎病毒在入侵后不久就可以整合入肝細(xì)胞DNA。

2 HBV在人染色體上的整合位點(diǎn)

目前在人23對(duì)染色體中均發(fā)現(xiàn)HBV DNA的整合，因此有學(xué)者認(rèn)為，HBV DNA在人染色體中的整合是隨機(jī)的[19]。但是，隨著對(duì)HBV DNA整合研究的深入以及第二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的整合位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)。有研究表明，在癌組織中，HBV在染色體5、8、10、19中整合常見(jiàn)，在癌旁組織中，HBV在1號(hào)和2號(hào)染色體上整合更常見(jiàn)；每個(gè)染色體上的整合位點(diǎn)數(shù)量與非腫瘤組織中脆性位點(diǎn)的數(shù)量相關(guān)，而與肝癌組織無(wú)關(guān)[20]。Zhao等[22]發(fā)現(xiàn)，HBV傾向于整合在染色體脆性位點(diǎn)和包括CpG島的功能基因區(qū)，并且優(yōu)先整合17號(hào)染色體[21]。近年研究顯示，HBV整合存在相對(duì)熱點(diǎn)區(qū)段，HBV整合傾向于發(fā)生在染色體轉(zhuǎn)錄區(qū)域和重復(fù)序列，包括長(zhǎng)散布核元素(LINE)、短散點(diǎn)核因子(SINE)和Alu序列。盡管目前所發(fā)現(xiàn)的熱點(diǎn)整合位點(diǎn)只能代表總體事件中的一小部分，但是反復(fù)發(fā)生的整合插入位點(diǎn)表明HBV存在與肝癌相關(guān)的潛在優(yōu)勢(shì)整合位點(diǎn)。最常見(jiàn)的HBV整合事件位于TERT和骨髓/淋巴或混合白血病4(MLL4)，TERT在覆蓋細(xì)胞衰老中起重要作用，細(xì)胞衰老通常在大多數(shù)癌細(xì)胞中上調(diào)，MLL4編碼組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，其在癌基因組的表觀遺傳修飾中具有關(guān)鍵作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HBV DNA在人基因組上整合的腫瘤相關(guān)靶基因有100多個(gè)，包括MLL4、TERT、纖連蛋白1、SMAD家族成員5SMAD5、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白E1、Rho鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子GEF12、磷酸酶和肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)物4、鈣信號(hào)相關(guān)基因、RNA結(jié)合蛋白fox-1同系物、醇脫氫酶1B、氨基甲酰磷酸合成酶1、雌激素相關(guān)受體γ、視黃酸誘導(dǎo)的1、CTD小磷酸酶、低密度脂蛋白相關(guān)性蛋白1B、sentrin特異性肽酶5、PDGF受體等，這些基因涉及到細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和永生化。

3 HBV DNA整合致肝癌的主要機(jī)制

Jiang等[23]報(bào)道，在60例HBV相關(guān)性肝癌患者癌組織及癌旁組織中都存在相同的X基因C-末端截短基因，此外，兩組的病毒序列具有相似的C1653T、A1762T/G1764A低頻率突變，HBV插入的頻率和模式在癌組織和癌旁組織之間相似，表明大部分HBV DNA整合事件與肝癌的發(fā)生無(wú)關(guān)。關(guān)于HBV整合的致癌機(jī)制，有研究認(rèn)為HBV整合的相關(guān)基因突變和HBV整合引起的染色體穩(wěn)定性改變與肝細(xì)胞癌變有關(guān)。但是，目前普遍認(rèn)為HBV整合導(dǎo)致肝癌的機(jī)制包括以下3個(gè)方面。

3.1 影響整合位點(diǎn)周?chē)虻墓δ?Cao等[24]使用名為“病毒掃描”的生物學(xué)信息系統(tǒng)，在3例肝癌患者癌組織中發(fā)現(xiàn)HBV整合到KMT2B基因，但對(duì)應(yīng)的癌旁組織未發(fā)現(xiàn)，由此推測(cè)HBV整合誘導(dǎo)宿主驅(qū)動(dòng)基因的改變可能會(huì)促使病毒癌基因表達(dá)和肝癌進(jìn)展。HBV基因組攜帶著諸多轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)元件，如增強(qiáng)子1、增強(qiáng)子2、負(fù)性調(diào)控元件、核心上游調(diào)節(jié)序列、基本核心啟動(dòng)子等，HBV DNA通過(guò)整合嵌入人基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，通過(guò)這些調(diào)控元件影響HBV整合位點(diǎn)周?chē)蚬δ?，從而?dǎo)致肝癌發(fā)生。

3.2 形成具有致癌作用的HBV截短蛋白 在HBV相關(guān)性肝癌中存在有大量截短的X蛋白，Tu等研究顯示，全長(zhǎng)的X蛋白可以抑制ras與myc引起的集落生長(zhǎng)的功能，截短的X蛋白可以加強(qiáng)ras與myc的轉(zhuǎn)化功能。整合的HBV DNA能夠表達(dá)合成成熟的pre-S/S和X蛋白觸發(fā)級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)也可以促使肝細(xì)胞惡變。

3.3 增加人基因的不穩(wěn)定性 HBV DNA整合到人基因組可引起人染色體DNA的缺失和易位以及細(xì)胞DNA的擴(kuò)增和融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而增加基因組DNA的脆性和不穩(wěn)定性。在肝癌組織中可以檢測(cè)到17p13、4q32、llpl4、4q32、11q13等區(qū)域的小片段缺失，有研究[25]在肝癌組織中發(fā)現(xiàn)HBV DNA整合位點(diǎn)兩端出現(xiàn)17號(hào)與18號(hào)染色體易位，并且18號(hào)染色體整合位點(diǎn)附近出現(xiàn)堿基缺失。

4 展望

目前已經(jīng)初步探明了HBV的整合機(jī)制，并檢測(cè)到了一些常見(jiàn)整合位點(diǎn)和受累基因，其中Pang等[26]通過(guò)量化HBV DNA與肝癌患者白細(xì)胞基因組的整合，確定OR4F3和OR4F17的組合是HBV相關(guān)疾病的新型潛在生物標(biāo)志物。但是，對(duì)于HBV DNA整合導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變的確切機(jī)制目前尚不完全清楚。HBV DNA整合與肝癌的關(guān)系非常復(fù)雜，不僅需要精心設(shè)計(jì)的流行病學(xué)研究，還需要對(duì)常見(jiàn)整合基因進(jìn)行體外細(xì)胞功能試驗(yàn)和動(dòng)物模型試驗(yàn)，為肝癌的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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2017-06-21)