尋常型銀屑病皮損組織中miR-138、hTERT、K17的表達(dá)及意義

馮世軍，李華蕊，張廣靜，王正想，楊秀芳

(滄州市中心醫(yī)院，河北滄州061001)

尋常型銀屑病皮損組織中miR-138、hTERT、K17的表達(dá)及意義

馮世軍，李華蕊，張廣靜，王正想，楊秀芳

(滄州市中心醫(yī)院，河北滄州061001)

目的觀察尋常型銀屑病皮損組織中miR-138、hTERT、K17的表達(dá)，分析三者之間的相互關(guān)系。方法選擇28例尋常型銀屑病患者(觀察組)和24例健康對(duì)照者(對(duì)照組)，取其皮膚組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-138表達(dá)，Western blotting法檢測(cè)hTERT、K17蛋白表達(dá)。采用Pearson相關(guān)分析miR-138與hTERT、K17及hTERT與K17表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果與對(duì)照組相比，觀察組皮損組織中miR-138表達(dá)降低，hTERT、K17蛋白表達(dá)升高(P均<0.05)。miR-138表達(dá)與hTERT、K17表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.623、-0.789，P均<0.01)，hTERT與K17表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.683，P<0.01)。結(jié)論尋常型銀屑病皮損組織中miR-138表達(dá)降低，hTERT、K17蛋白表達(dá)升高；miR-138可能參與角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖，通過靶向調(diào)節(jié)hTERT而上調(diào)K17蛋白的表達(dá)。

尋常型銀屑病;微小RNA；人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；K17

銀屑病是由T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，其中以尋常型銀屑病最為多見。目前銀屑病的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與遺傳因素、環(huán)境因素、免疫、新生血管、脂代謝紊亂、心態(tài)等有關(guān)[1]。據(jù)報(bào)道，銀屑病的一般治療方法為局部紫外線照射、甲氨蝶呤、環(huán)孢素A、阿曲汀和生物制劑治療[2]。隨著研究的深入，細(xì)胞因子、信號(hào)分子和微小RNA(miRNA)逐漸成為尋常型銀屑病的潛在治療靶點(diǎn)[3，4]。miRNA結(jié)合于mRNA的UTR區(qū)，能夠通過加速轉(zhuǎn)錄過程或miRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解過程而抑制翻譯進(jìn)程[5]。miRNA的異常表達(dá)與腫瘤、心血管疾病和炎癥性疾病等[6]的發(fā)生有關(guān)。最近關(guān)于某些特異性miRNA在銀屑病中的作用也逐漸受到關(guān)注，如hsa-miR-99a、miR-146a、miR-486-3p、miR-155、miR-203和miR-125b[4，7]。作為miRNA家族的一員，miR-138通過調(diào)節(jié)靶標(biāo)基因參與腫瘤轉(zhuǎn)移和分化、DNA損傷和細(xì)胞衰老等一系列生理反應(yīng)[8]，以往研究表明，miR-138的過量表達(dá)能夠降低人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)端粒酶在多種腫瘤中的活性，如惡性成神經(jīng)細(xì)胞瘤、甲狀腺癌和子宮頸癌。K17屬于Ⅰ型上皮角質(zhì)素(酸性)，通過向角質(zhì)形成細(xì)胞提供機(jī)械支持保護(hù)表皮的完整性[6]。然而，miR-138與hTERT、K17在尋常型銀屑病中的表達(dá)變化及意義目前尚不明確。本研究通過觀察尋常型銀屑病皮膚組織中miR-138、hTERT、K17的表達(dá)，進(jìn)一步分析三者之間的相互關(guān)系，以期為尋常型銀屑病尋找新的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年6月～2017年1月我院收治的28例尋常型銀屑病患者(觀察組)，其中男15例、女13例，平均年齡31.4歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷為尋常型銀屑??；②3個(gè)月內(nèi)未服用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素和維甲酸等藥物；③1個(gè)月內(nèi)無尋常型銀屑病外用藥物或光照治療；④無其他皮膚病、自體免疫性疾病、腫瘤或其他嚴(yán)重疾??；⑤患者非妊娠期、哺乳期或月經(jīng)期。對(duì)照組為我院燒傷科收治的24例患者，其中男11例、女13例，平均年齡32.2歲?；颊呔鶡o銀屑病史及家族史，無其他自身免疫性疾病，無腫瘤或其他嚴(yán)重疾病。兩組性別、年齡具有可比性。本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 miR-138檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。收集患者的皮膚組織，加入液氮研磨，使用RNA提取試劑盒(Qiagen)提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，控制OD260/280在1.7～2.1。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于ABI7500進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。PCR條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-138上游引物5′-GGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3′，下游引物5′-AACTTCACAACACCAGCTTA-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA -3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)內(nèi)參基因繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 hTERT、K17蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。收集患者的皮膚組織，以中性蛋白酶處理，4 ℃過夜，充分研磨處理后，加入細(xì)胞蛋白裂解液，離心取上清液，應(yīng)用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，煮沸5～10 min后，-20 ℃凍存。SDS-PAGE蛋白電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封膜后加入兔抗人和鼠抗人K17抗體，4 ℃過夜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體和HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體，37 ℃孵育1 h，一抗和二抗均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像，以目的蛋白占內(nèi)參蛋白的百分比計(jì)算目的蛋白相對(duì)濃度。

2 結(jié)果

2.1 兩組皮膚組織中miR-138表達(dá)比較 觀察組和對(duì)照組皮膚組織中miR-138的相對(duì)表達(dá)量分別為1.12±0.24、2.08±0.31，觀察組miR-138表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 兩組皮膚組織中hTERT、K17蛋白表達(dá)比較 觀察組hTERT、K17的表達(dá)量分別為0.78±0.11和0.67±0.12，對(duì)照組分別為0.34±0.06、0.28±0.04。觀察組hTERT、K17蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P均<0.05)。

2.3 miR-138與hTERT、K17蛋白表達(dá)的相關(guān)性 miR-138表達(dá)與hTERT、K17表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.623、-0.789，P均<0.01)，hTERT與K17表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.683，P<0.01)。

3 討論

miRNA是一種長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非蛋白質(zhì)編碼的小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)。miRNA是細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)以及慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制，其表達(dá)的改變會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。銀屑病是具有遺傳易感性的個(gè)體在內(nèi)外環(huán)境的共同作用下，由T細(xì)胞介導(dǎo)的常見慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病。以往研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA參與銀屑病的發(fā)病機(jī)制，包括miR-203、miR-146、miR-125b、miR-21、miR-221、miR-222以及miR-155等[9]，這些miRNA在銀屑病皮損組織中呈非正常表達(dá)模式，不同程度地參與銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。本研究結(jié)果顯示，觀察組皮損組織中miR-138表達(dá)低于對(duì)照組，表明miR-138可能與同一家族中其他miRNA成員共同參與了銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程。

研究表明，銀屑病皮損處表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中hTERT的表達(dá)水平顯著增高，提示銀屑病皮損中hTERT活性增加可能與銀屑病發(fā)病有關(guān)[10]。hTERT mRNA只在惡性腫瘤組織及某些有高度再生潛力的組織如銀屑病中表達(dá)，與端粒酶活性表達(dá)一致，被認(rèn)為是端粒酶活性的決定因素。以往研究顯示，在銀屑病皮損處可以檢測(cè)到較高水平的端粒酶表達(dá)，而正常皮膚則不表達(dá)或表達(dá)低水平的端粒酶活性，說明端粒酶可能參與細(xì)胞的增殖調(diào)控。本研究表明miR-138在銀屑病皮損中的低表達(dá)與hTERT呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)hTERT的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致端粒酶活性升高，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖，從而參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

K17被認(rèn)為是“銀屑病相關(guān)性細(xì)胞角蛋白”，與鏈球菌M蛋白具有相同的序列ALEEAN，可特異性刺激銀屑病T細(xì)胞，使之活化、釋放IFN-γ等炎癥因子，而IFN-γ又能夠經(jīng)STAT1信號(hào)通路上調(diào)K17表達(dá)，使機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)K17的自身免疫反應(yīng)，從而形成一個(gè)惡性環(huán)路，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生等病理改變，成為銀屑病發(fā)病過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因K17在銀屑病皮損中呈高表達(dá)以及其具有刺激T細(xì)胞活化的作用，被界定為銀屑病自身反應(yīng)性T細(xì)胞識(shí)別的候選靶抗原。以往研究證實(shí)，在銀屑病的病理過程中存在“K17-T細(xì)胞-細(xì)胞因子環(huán)路”，該環(huán)路可能是銀屑病皮損持續(xù)存在和反復(fù)發(fā)作的重要基礎(chǔ)[11，12]。近年來，許多學(xué)者也在不斷嘗試研究以K17作為靶點(diǎn)治療銀屑病的方法。本研究表明，miR-138與K17的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合miR-138在銀屑病皮損中的表達(dá)低于正常皮膚組織，我們推測(cè)miR-138在銀屑病皮損中的低表達(dá)引起K17表達(dá)升高，從而促進(jìn)銀屑病的發(fā)生發(fā)展，如果能夠利用miRNA藥物來抑制K17表達(dá)，可能起到治療和緩解銀屑病的目的。孫中斌等[7]研究證實(shí)，miR-486-3p在銀屑病皮損中通過K17 3′UTR種子序列結(jié)合抑制K17表達(dá)，說明miRNA對(duì)K17的調(diào)控作用參與銀屑病的發(fā)生和發(fā)展。

hTERT表達(dá)與K17呈正相關(guān)，然而關(guān)于二者之間相互作用的機(jī)制尚不清楚。K17在銀屑病皮損中的高表達(dá)刺激T細(xì)胞分泌IFN-γ，IFN-γ對(duì)細(xì)胞的刺激可以引起STAT蛋白聚集到IFNγR Ⅰ受體鏈的單個(gè)STAT結(jié)合位點(diǎn)上，進(jìn)而可被JAK1/JAK2激活，之后STAT從受體上游離、形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與干擾素激活部位增強(qiáng)子家族結(jié)合，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。JAK-STAT信號(hào)通路在多種疾病的病理改變中均扮演著重要角色，研究表明STAT3可以通過結(jié)合在TERT啟動(dòng)子特定位點(diǎn)引起TERT表達(dá)升高[13]。因此我們推測(cè)，銀屑病皮損中K17表達(dá)升高促使細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2增多，進(jìn)而激活JAK-STAT信號(hào)通路，從而上調(diào)hTERT的表達(dá)。

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2017-06-27)