緊密連接相關(guān)蛋白對血腦屏障通透性影響的研究進(jìn)展

張楠，王思迪，涂盼春，岳英芳，楊智航

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2013級7班，遼寧 沈陽 110034；2.麻醉學(xué)專業(yè)2013級2班；3.2012級英文2班；4.2013級6班；5.生理學(xué)教研室）

緊密連接相關(guān)蛋白對血腦屏障通透性影響的研究進(jìn)展

張楠1，王思迪2，涂盼春3，岳英芳4，楊智航5*

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2013級7班，遼寧 沈陽 110034；2.麻醉學(xué)專業(yè)2013級2班；3.2012級英文2班；4.2013級6班；5.生理學(xué)教研室）

血腦屏障作為機(jī)體中重要的組織結(jié)構(gòu)，對于維持腦組織的安全及穩(wěn)定具有十分重要的作用，緊密連接是血腦屏障的重要組成部分，其相關(guān)蛋白在維持緊密連接的穩(wěn)定性和血腦屏障通透性方面同樣至關(guān)重要。

緊密連接；血腦屏障；緊密連接相關(guān)蛋白

血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是人體的重要組織結(jié)構(gòu)，是腦毛細(xì)血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成的血漿與腦細(xì)胞之間的屏障以及由脈絡(luò)叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障。BBB限制血液中的某些物質(zhì)進(jìn)入腦，在很大程度上維持了腦組織內(nèi)環(huán)境的基本穩(wěn)定，這是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮正常生理調(diào)控功能的保證。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）及細(xì)胞間的緊密連接（tight junctions，TJs）是構(gòu)成BBB的主要結(jié)構(gòu)［1］，TJs是由相鄰細(xì)胞膜外層通過特異性的跨膜蛋白彼此融合構(gòu)成的閉鎖結(jié)構(gòu)，位于BMECs間，主要由跨膜蛋白（閉合蛋白Claudins家族、咬合蛋白Occludin家族、連接黏附分子JAMs）、胞質(zhì)附著蛋白ZOs家族、細(xì)胞骨架蛋白（F-actin）等多種蛋白構(gòu)成。TJs調(diào)控的細(xì)胞旁途徑和caveolae介導(dǎo)的跨細(xì)胞途徑可以調(diào)節(jié)BBB的通透性［2］。緊密連接相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)、分布和表達(dá)水平的變化，都將導(dǎo)致TJs的開放或關(guān)閉，從而改變BBB的通透性。本文旨在探討緊密連接相關(guān)蛋白對BBB通透性的影響。

1 緊密連接相關(guān)蛋白的分類及組成

1.1 跨膜蛋白

1.1.1 閉合蛋白Claudins Claudins蛋白是含有4個(gè)跨膜區(qū)域和2個(gè)細(xì)胞外環(huán)的跨膜緊密連接蛋白，相對分子質(zhì)量為20～27 kDa，其跨膜或胞質(zhì)部分決定緊密連接絲的構(gòu)建，與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域無關(guān)，相鄰細(xì)胞膜中Claudins的細(xì)胞外環(huán)可以相互作用，從而封閉細(xì)胞間隙，這也是TJs的形成和離子通透選擇性的原因之一［3］。Claudins蛋白在維持組織結(jié)構(gòu)和功能中起到關(guān)鍵作用，它的異常表達(dá)可能造成TJs的改變，從而導(dǎo)致各種相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展［4］。

目前至少已發(fā)現(xiàn)Claudin家族的24個(gè)成員，其中Claudins-3、5、12在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)［5］，Claudin-5/TMVCF參與形成TJs，進(jìn)而構(gòu)成BBB，這在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)方面是至關(guān)重要的，但是這種高度選擇性分子界面也限制了藥物對神經(jīng)退行性變性和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的干預(yù)治療［6］。在體實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)證明，特定產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素的突變片段綁定到Claudin-5，可以調(diào)制的大腦血管滲透性［3］。

1.1.2 咬合蛋白Occludin Occludin是緊密連接相關(guān)蛋白中最具有代表性的蛋白質(zhì)之一，直接參與TJs的屏障功能和柵欄功能。它的相對分子質(zhì)量約60 kDa，有2個(gè)細(xì)胞外環(huán)和4個(gè)跨膜區(qū)域，其中第1個(gè)細(xì)胞外環(huán)和羧基端在不同種屬間有高度同源性，相鄰細(xì)胞間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可彼此作用于封閉細(xì)胞旁空間。Occludin的氨基端和羧基端均位于胞質(zhì)內(nèi)，氨基端對TJs的裝配和屏障功能的保持起重要作用，羧基端與ZO-1蛋白直接相連，與ZO-1一起調(diào)節(jié)TJs的結(jié)構(gòu)變化，對Occludin蛋白在TJs間的定位及細(xì)胞間的通透性調(diào)節(jié)具有重要作用。Occludin蛋白的移動(dòng)范圍主要是在細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞黏附和細(xì)胞調(diào)節(jié)等方面具有關(guān)鍵作用。有研究表明作為 BBB典型結(jié)構(gòu)的Claudin、ZO-1、Occludin均勻分布在腦實(shí)質(zhì)和腦血管的不同部分［7］。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Occludin的表達(dá)水平下降可能引起TJs的開放，增加BBB通透性。Diaz等［8］研究發(fā)現(xiàn)，局部缺血缺氧可以誘導(dǎo)Occludin表達(dá)水平下降，同時(shí)伊文思藍(lán)溢出進(jìn)入大腦實(shí)質(zhì)，證實(shí)了BBB功能障礙，通透性增加。

1.1.3 連接黏附分子JAMs JAMs屬于免疫球蛋白超家族成員，不僅在TJs部位上表達(dá)，也可以表達(dá)于白細(xì)胞和血小板。JAMs有JAM-1、2、3、4等4種類型，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)JAM-1、JAM-2和JAM-3，而JAM-1在BMECs高表達(dá)［9］。

JAM-1是細(xì)胞連接形成過程中首先出現(xiàn)在細(xì)胞間接觸位點(diǎn)的分子，能募集其他蛋白以啟動(dòng)TJs形成［10］，在穩(wěn)定細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)和降低旁細(xì)胞通路通透性方面發(fā)揮作用，且TJs完整性被破壞與JAM-1表達(dá)的降低有關(guān)［9，11］。此外，JAM-1還可以調(diào)節(jié)TJs的重裝。研究發(fā)現(xiàn)在使用抗JAMs單克隆抗體后，不僅難以將JAM-1組裝到TJs上，同時(shí)也阻斷了Occludin的重新分布，從而阻礙了上皮屏障功能的恢復(fù)［11］。

1.2 胞質(zhì)附著蛋白ZOs ZOs屬于膜相關(guān)鳥苷酸激酶（membrane-associated guanylate kinase，MA GUK）家族，是第1個(gè)被證實(shí)的TJs附著蛋白，主要有ZO-1、ZO-2和ZO-3 3個(gè)亞型，3個(gè)亞型所含區(qū)域相同，均有3個(gè)PDZ區(qū)域，1個(gè)SH3區(qū)域和1個(gè)GUK區(qū)域。ZOs家族在胞質(zhì)內(nèi)具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并與Occludin的羧基端及Claudins相互作用，將跨膜蛋白和細(xì)胞骨架連接起來，進(jìn)而發(fā)揮傳遞信號的作用，形成穩(wěn)定的連接系統(tǒng)。

1.2.1 ZO-1 ZO-1是構(gòu)成TJs的主要蛋白之一，沿著細(xì)胞膜連續(xù)分布，其表達(dá)水平的高低與BBB的開放程度相關(guān)，其相對分子質(zhì)量約220～225 kDa，在胞漿內(nèi)具有許多結(jié)合位點(diǎn)，多數(shù)位于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜相接觸的TJs處，少數(shù)存在于非上皮細(xì)胞黏附連接內(nèi)層的細(xì)胞質(zhì)中。ZO-1蛋白作為細(xì)胞間TJs復(fù)合體的重要結(jié)構(gòu)蛋白之一，一方面連接跨膜蛋白，另一方面與TJs細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架連接，起到細(xì)胞間連接樞紐作用。ZO-1的磷酸化調(diào)控是決定BBB血管通透性的至關(guān)重要的因素［12］。

1.2.2 ZO-2 ZO-2與ZO-1以復(fù)合物的方式定位于TJs的胞漿側(cè)，共同參與組成基因表達(dá)和細(xì)胞功能的信號傳導(dǎo)通路［13］，相對分子質(zhì)量約為160 kDa，具有一個(gè)含有豐富精氨酸的區(qū)域，存在于PDZ1和PDZ2之間。ZO-2與ZO-1兩者具有較高同源性，尤其在MAGUK保守區(qū)域，但是ZO-2僅存在于TJs部位，而ZO-1則廣泛分布。

1.2.3 ZO-3 ZO-3相對分子質(zhì)量約130 kDa，定位于TJs部位，在PDZ1和PDZ2部位富含精氨酸，在PDZ2和PDZ3之間存在一個(gè)富含脯氨酸區(qū)域。有研究表明，抑制Src活性可以降低Occludin的酪氨酸磷酸化，通過與ZO-1和ZO-3的相互作用提高BBB的通透性［14］。

1.3 細(xì)胞骨架蛋白F-actin F-actin蛋白相對分子質(zhì)量約42 kDa，通過與胞質(zhì)附著蛋白連接，進(jìn)而與TJs跨膜蛋白結(jié)合，即ZO-1蛋白連接F-actin與Occludin蛋白及Claudins-5蛋白，是TJs復(fù)合體不可缺少的部分，是TJs形成胞旁屏障的重要因素之一，對于維持TJs的穩(wěn)定性具有重要作用。有研究表明冰片能夠通過下調(diào)ZO-1和F-actin表達(dá)水平，選擇性的開放血腫瘤屏障，增加其通透性［15］。另有研究表明，氧化應(yīng)激能導(dǎo)致F-actin重新聚合形成張力絲，從而增強(qiáng)BBB的通透性［16］。

上述緊密連接相關(guān)蛋白之間彼此存在復(fù)雜聯(lián)系，不僅作用于TJs，維持其完整性，還為腦內(nèi)皮組織提供結(jié)構(gòu)支持，如果這些蛋白發(fā)生表達(dá)紊亂將直接影響TJs的完整性，從而改變BBB的功能。

2 緊密連接相關(guān)蛋白的功能

TJs構(gòu)成了離子與分子通過細(xì)胞旁途徑跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的屏障，是保持BBB完整性的重要因素之一，功能主要為屏障作用與柵欄作用，即形成極窄的細(xì)胞間粘連，以遮擋細(xì)胞外空間和創(chuàng)建可調(diào)的分子選擇性篩孔。緊密連接相關(guān)蛋白在其作用功能中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

2.1 屏障功能 上皮細(xì)胞和（或）內(nèi)皮細(xì)胞屏障的關(guān)鍵成分就是細(xì)胞間的連接點(diǎn)，即TJs，其通透性與不同物質(zhì)的大小、脂溶性及離子所帶電荷有關(guān)。BBB細(xì)胞排列緊密，常用跨膜電阻（transepithelial electrical resistance，TER）作為衡量其通透性的敏感指標(biāo)，還能用來比較和監(jiān)視屏障細(xì)胞層的形成和調(diào)控［17-18］。TJs鏈?zhǔn)亲枞?xì)胞外空間的基本結(jié)構(gòu)單位，TJs平行鏈的數(shù)目與TER之間也存在著密不可分的聯(lián)系。

2.2 柵欄功能 Occludin蛋白和Claudins蛋白像柵欄一樣鑲嵌在脂膜上，在脂膜的頂膜和底側(cè)膜區(qū)域形成邊界，限制該區(qū)域的脂質(zhì)和蛋白的橫向移動(dòng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞旁途徑的通透性［19］。TJs沒有完全的密封，具有選擇透過性，在細(xì)胞外的連接部分包含著一定數(shù)量的離子選擇性孔，發(fā)揮選擇性運(yùn)輸功能。

3 TJs的調(diào)節(jié)

3.1 滲透壓對TJs的調(diào)節(jié) 甘露醇是臨床上常用的滲透性利尿劑和脫水劑，可以有效地降低顱內(nèi)壓，其作用機(jī)制是增加滲透壓，使BMECs暫時(shí)脫水，構(gòu)成BBB的細(xì)胞體積縮小，間距增寬，其結(jié)果是TJs開放，BBB通透性升高。有臨床研究表明，應(yīng)用25%的甘露醇，利用其高滲作用，促進(jìn)干細(xì)胞通過BBB，進(jìn)而治療慢性腦卒中［20］。

3.2 PKA對TJs的調(diào)節(jié) 有研究胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）對BBB體外模型的作用發(fā)現(xiàn)：GLP-1能夠增加Occludin和Claudin-5的含量，屏障作用增強(qiáng)；而應(yīng)用GLP-1受體阻斷劑exendin-3（9-39）和PKA阻斷劑H89時(shí)，屏障作用顯著降低，提示GLP-1可能通過cAMP/PKA信號傳導(dǎo)，上調(diào)緊密連接相關(guān)蛋白，穩(wěn)定BBB的完整性［21］。

3.3 PKC對緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)及屏障功能的調(diào)節(jié) 蛋白質(zhì)的功能可以通過結(jié)構(gòu)域的不同修飾產(chǎn)生特異性的變化，磷酸化修飾是其中重要的一種形式，主要集中在肽鏈中的絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸殘基上，可使上述殘基上不帶電荷游離的羥基帶電荷，引起結(jié)構(gòu)改變，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性和功能。PKC是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，研究表明PKC參與ZO-1、Occludin和Claudin-5的磷酸化修飾，誘導(dǎo)其由細(xì)胞膜上向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)重新分布，調(diào)節(jié)TJs的通透性［22］。

3.4 RhoA-ROCK對TJs的調(diào)節(jié) Rho蛋白屬于小G蛋白超家族的亞家族成員，有RhoA、RhoB、RhoC三種異構(gòu)體。ROCK即Rho激酶，屬于絲/蘇氨酸激酶的一種，有ROCK1和ROCK2兩個(gè)亞型，其中ROCK1主要參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，ROCK2則參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮和血管平滑肌的功能。研究發(fā)現(xiàn)，人類免疫缺陷病毒-1型反式轉(zhuǎn)錄激活因子（HIV-1 Tat）可使Occludin蛋白和mRNA表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致BBB破壞，而阻斷Rho/ROCK信號傳導(dǎo)通路可抑制HIV-1 Tat誘導(dǎo)BBB破壞作用［23］。膜聯(lián)蛋白A1可以通過抑制RhoA-ROCK信號通路，修復(fù)Aβ1-42誘導(dǎo)的BBB破壞［24］?？梢?，RhoAROCK信號通路的激活，能夠引起TJs蛋白磷酸化反應(yīng)，使TJ開放，破壞BBB的完整性。

4 問題與展望

TJs作為維持體內(nèi)BBB完整性的重要結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)，在應(yīng)用藥物后，緊密連接相關(guān)蛋白含量的下降、緊密連接通道的開放對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治愈具有重要作用，但目前尚未發(fā)現(xiàn)能夠有效應(yīng)用于臨床治療的此類藥物。雖然在緊密連接相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)開放BBB的過程中還存在許多未知，但相信在未來，通過人們的不斷實(shí)驗(yàn)和探索，緊密連接相關(guān)蛋白影響B(tài)BB的研究能夠進(jìn)一步完善。

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（文敏編輯）

Research Progress of Roles of Tight Junction Proteins Involved in the Permeability of Blood-Brain Barrier

ZHANG Nan1，WANG Sidi2，TU Panchun3，YUE Yingfang4，YANG Zhihang5*

（1.Grade 2013，Class 7，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Grade 2013，Class 2；3.Grade 2012，Class 2；4.Grade 2013，Class 6；5.Department of Physiology）

As one of the important organization structure，the blood-brain barrier（BBB）is essential for maintaining brain homeostasis.Tight junctions form the basis structure of BBB to limiting paracellular permeability.This review summerizes the constituentsoftightjunction proteins and its role in the regulation oftightjunction.

tight junctions；blood?brain barrier；tight junction proteins

R338.25

A

1008-2344（2017）01-0072-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.01.023

2016-08-01

遼寧省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.2015020370）；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（No.乙類1163）；沈陽醫(yī)學(xué)院科技基金項(xiàng)目（No.20131001）

楊智航（1976—），男（漢），博士，副教授.研究方向：選擇性開放血腦屏障的病理機(jī)制.E-mail：18940209532@163.com