樺褐孔菌菌質(zhì)提取物對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

李東文 蘇明聲 龍 凱 梁永紅 謝小梅

（1 江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌330004；2 江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌330004）

樺褐孔菌學(xué)名為Inonotus obliquus（Pers.:Fr.）Pi?lat，又名斜生褐孔菌、白樺茸，是一種珍稀藥用真菌，菌核外形呈現(xiàn)出瘤狀，表面深褐色并有許多深的裂痕，質(zhì)地硬且脆[1]。樺褐孔菌含有多糖類(lèi)化合物、芳香物質(zhì)、葉酸衍生物、多酚類(lèi)化合物、甾體類(lèi)化合物和三萜類(lèi)化合物等多種活性成分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和防治糖尿病等多種生理活性[2]。尤其樺褐孔菌在防治糖尿病方面的應(yīng)用更是受到普遍關(guān)注，俄羅斯Komsomlshi 制藥公司生產(chǎn)的樺褐孔菌精粉對(duì)糖尿病的治愈率達(dá)93%。但目前樺褐孔菌資源匱乏，野生資源日益枯竭，現(xiàn)有的資源量已經(jīng)滿(mǎn)足不了大量的臨床需求[3]。研究運(yùn)用雙向固體發(fā)酵技術(shù)[4]，以樺褐孔菌為發(fā)酵菌種，中藥渣為發(fā)酵基質(zhì)，在特定條件下進(jìn)行固體發(fā)酵，獲得了藥性菌質(zhì)--樺褐孔菌菌質(zhì)。測(cè)定樺褐孔菌菌質(zhì)不同溶劑提取組分對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制活性，為實(shí)現(xiàn)利用中藥渣的同時(shí)獲取具有降糖活性的樺褐孔菌菌質(zhì)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

樺褐孔菌菌質(zhì)（簡(jiǎn)稱(chēng)“菌質(zhì)”，簡(jiǎn)寫(xiě)“JZ”），實(shí)驗(yàn)室自制（自制過(guò)程另文發(fā)表）。樺褐孔菌菌核（簡(jiǎn)稱(chēng)“菌核”，簡(jiǎn)寫(xiě)“JH”），購(gòu)自延邊華廈桑黃菌業(yè)有限公司，羅永明教授鑒定。

淀粉、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、PNPG 均購(gòu)于Sigma 公司；阿卡波糖對(duì)照品（Solarbio），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。UV-2102 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司），DK-8D 型電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 活性物質(zhì)的提?。砦陌l(fā)表） 簡(jiǎn)述如下:取樺褐孔菌菌質(zhì)和菌核粗粉1 kg，按1∶12（g∶mL）的比例分別加入80%乙醇回流提取（1 h/次，提取3 次）。提取液合并后減壓回收溶劑，得乙醇浸膏，將乙醇浸膏混懸于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別減壓回收溶劑，得各萃取組分。取乙醇浸提后的殘?jiān)鼰崴?，提取液濃縮后醇沉得粗多糖。

1.2.2 抑酶活性測(cè)定

1.2.2.1 各組分對(duì)α-淀粉酶抑制活性的測(cè)定 淀粉酶與底物淀粉發(fā)生反應(yīng)生成還原糖，還原糖與DNS 共熱后在過(guò)量的NaOH 溶液中被還原生成具有特征吸收峰的橘紅色氨基化合物，在一定的濃度范圍內(nèi)氨基化合物的吸光度值與α-淀粉酶的活性成正比[5]。

參照文獻(xiàn)[5]改進(jìn)后的反應(yīng)體系為:1 mL 的抑制劑（樣品），0.3 mL 的α-淀粉酶溶液（酶活為6 U/mL，用pH6.8，0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液配制），0.4 mL 1%的淀粉溶液（用pH6.8，0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液配制），37℃反應(yīng)5 min，加1 mL 的DNS 試劑沸水浴10 min，取出冰水冷卻，定容至25 mL，540 nm測(cè)吸光度，以阿卡波糖作陽(yáng)性對(duì)照。具體參照表1，空白處用等體積的pH6.8，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足。

表1 α-淀粉酶活性抑制體系

1.2.2.2 各組分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定pNPG（4-硝基酚-α-D-吡喃-葡萄糖苷）在α-葡萄糖苷酶作用下水解生成葡萄糖和pNP（對(duì)硝基苯酚），pNP在堿性環(huán)境下呈黃色在400 nm處有最大吸收[6]。

參照文獻(xiàn)[7]改進(jìn)后的反應(yīng)體系為:1 mL 的抑制劑（樣品），0.2 mLα-葡萄糖苷酶（酶活為3.75 U/mL，用pH6.8，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液配制），0.2 mL pNPG溶液（6 mmol/L 用pH6.8，0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液配制），37℃恒溫水浴30 min，加6 mLNa2CO3溶液（0.1 mol/L）終止反應(yīng)，400 nm 處測(cè)吸光值，以阿卡波糖作陽(yáng)性對(duì)照。具體參照表2進(jìn)行，空白處用等體積的pH6.8，0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足。

表2 α-葡萄糖苷酶活性抑制體系

2 結(jié)果與分析

2.1 各組分對(duì)α-淀粉酶抑制率根據(jù)公式，抑制率/%=（1-A00/A01）×100；A00=A3-A4，A01=A1-A2；式中:A1、A2、A3、A4分別為540 nm 處空白管、空白對(duì)照管、樣品管和背景管的吸光值。通過(guò)計(jì)算菌質(zhì)、菌核石油醚組分的抑制率為0，其它各組分的抑制率見(jiàn)表3，圖1。

表3 不同組分對(duì)α-淀粉酶抑制率（%）

由表3 結(jié)合圖1 可清晰看出，菌質(zhì)和菌核粗多糖對(duì)α-淀粉酶抑制率與陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖相比，差異極顯著（P＜0.01），但比相應(yīng)的乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水層提取物、石油醚提取物的抑制率高，差異極顯著（P＜0.01）；菌核粗多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制作用比菌質(zhì)高，差異顯著（P＜0.05）。

2.2 各組分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率根據(jù)公式，抑制率/%=（1-A00/A01）×100；A00=A3-A4，A01=A1-A2；式中:A1、A2、A3、A4分別為400 nm 處空白管、空白對(duì)照管、樣品管和背景管的吸光值。通過(guò)計(jì)算菌質(zhì)、菌核石油醚組分的抑制率為0，其它組分的抑制率見(jiàn)表4，圖2。

由表4 及圖2 可清晰看出，菌質(zhì)和菌核粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率與陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖相比，差異極顯著（P＜0.01），但比相應(yīng)的乙酸乙酯、正丁醇、水層提取物、石油醚的抑制率高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；菌核粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用比菌質(zhì)高（P＜0.05）。

圖1 樺褐孔菌菌質(zhì)和菌核不同溶劑提取組分對(duì)α-淀粉酶抑制率隨樣品質(zhì)量濃度變化趨勢(shì)

圖2 樺褐孔菌菌質(zhì)和菌核不同溶劑提取組分對(duì)α-葡萄糖酶抑制率隨組分質(zhì)量濃度變化趨勢(shì)

表4 不同組分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率（%）

3 小結(jié)與討論

α-葡萄糖苷酶的抑制劑能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制小腸上皮絨毛膜刷狀緣上多種酶的活性[8]，α-淀粉酶抑制劑能夠有效抑制腸道內(nèi)唾液及胰淀粉酶的活性[9]，這兩種酶抑制劑通過(guò)調(diào)控碳水化合物的降解，延緩葡萄糖在腸道內(nèi)的吸收，進(jìn)而降低餐后血糖，是目前進(jìn)行糖尿病防治比較有效的方法。研究通過(guò)測(cè)定樺褐孔菌菌質(zhì)不同溶劑提取組分對(duì)這兩種酶的抑制活性，并與菌核進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，菌質(zhì)和菌核粗多糖提取物對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有較高的抑制作用。

目前樺褐孔菌降糖作用有效成分的研究主要集中在其水提物和多糖上[10]，還有研究證實(shí)其乙酸乙酯（提?。┙M分能較好的降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖[11]。對(duì)比樺褐孔菌菌質(zhì)和菌核提取各組分對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)不管菌核還是菌質(zhì)其抑制作用較強(qiáng)的組分均是粗多糖。

可見(jiàn)通過(guò)雙向固體發(fā)酵技術(shù)制得的樺褐孔菌菌質(zhì)提取物能較好抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，其活性成分的分離鑒定和藥理作用還有待進(jìn)一步研究。雙向固體發(fā)酵技術(shù)其工藝簡(jiǎn)單，設(shè)備要求不高，成本也較低，并能將中藥渣重新開(kāi)發(fā)利用，不僅節(jié)約了資源，而且彌補(bǔ)了名貴藥用真菌樺褐孔菌野生資源短缺，為樺褐孔菌資源的來(lái)源增添了一條新的途徑，后續(xù)將對(duì)菌質(zhì)多糖的降糖作用進(jìn)一步研究。