長鏈非編碼RNA XIST在胰腺癌中的表達及意義

魏偉，楊波，唐翎

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1.普通外科 3.藥劑科，湖南 長沙 410008；2.湖南省常德市第四人民醫(yī)院 普通外科，湖南 常德415000）

胰腺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其病因和發(fā)病的分子機制尚不明確[1-4]。近年來，癌基因或抑癌基因變異引起的相關(guān)功能因子的表達紊亂而導(dǎo)致胰腺癌發(fā)生發(fā)展的基因功能研究是胰腺癌病因和發(fā)病分子機制研究的重要方向[5-8]。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的長鏈非編碼RNA分子，它可在多層面上，包括表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多個方面調(diào)控基因的表達[9]。近年來有研究[10-15]表明，lncRNA亦可作為原癌基因或抑癌基因參與腫瘤的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移過程，如MALAT1、HOTAIR、HNF1A-AS及XIST等。據(jù)報道[16]，X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄本（X-inactive specific transcript，XIST）在多種癌癥中均呈高表達，且XIST的高表達往往與癌癥預(yù)后不良有密切關(guān)系。Fang等[17]研究表明，在非小細胞肺癌中，XIST扮演了癌基因的角色。

本研究將檢測胰腺癌組織和胰腺癌細胞系中XIST的表達水平，并通過siRNA干擾胰腺癌細胞中XIST表達后檢測其增殖的變化情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞系HPDE、人胰腺癌細胞系A(chǔ)sPC-3、BxPC-3、Capan-1、CFPAC-1、Hs766T、Panc-1及SW1990購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。XIST siRNA套裝購自上海吉瑪生物；MTT檢測試劑盒和BrdU檢測試劑盒購自贏潤生物技術(shù)有限公司；0.25%胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibco公司；細胞轉(zhuǎn)染試劑lipo-2000購自美國Life Technology公司；總RNA提取試劑（RNA Lyz01）購自依科賽生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RT reagent Kit）購自TaKaRa公司；熒光定量PCR試劑購自Bio-Rad公司；改良Eagle培養(yǎng)基高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司；Ki-67、PCNA抗體購自Abcam公司；其它常用試劑均為國產(chǎn)分析純。實時熒光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 組織樣品收集

56對正常胰腺組織和胰腺癌組織標(biāo)本由本科室2013—2015年收集，所有病例術(shù)前均未行放療、化療。

1.3 細胞培養(yǎng)

HDPE、Capan-1、Hs766T、Panc-1在含10%胎牛血清的DMEM（Gibco，Carlsbad，CA）培養(yǎng)基中培養(yǎng)；AsPC-1、BxPC-3、SW1990細胞系在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；CFPAC-1在含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細胞均置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。實驗用細胞均為對數(shù)生長期細胞。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染

制備終濃度為80 nmol/L的XIST siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物，實驗組加入XIST siRNA，同時設(shè)置對照組。將人胰腺癌 SW1990細胞以每孔2×105個接種于6孔板，待細胞增殖至70%～80%時，更換無血清培養(yǎng)基，采用Lipo-2000 將XIST siRNA1、siRNA2、siRNA3分別轉(zhuǎn)染細胞。

1.5 RT-PCR檢測

收集各組細胞，每孔不少于1×106個細胞制備總RNA并定量；取5 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，然后以cDNA為模板、GAPDH作為內(nèi)參照，進行RT-PCR反應(yīng)。PCR擴增的反應(yīng)條件為:95 ℃ 30 s 預(yù)變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，使用BIO-RAD real-time PCR儀自帶軟件分析PCR過程中樣本的循環(huán)閾值（cycle threshold，CT），采用2-AACT計算各組細胞中目的基因相對反應(yīng)起始拷貝數(shù)。GAPDH引物序列正向:5'-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3'；反向:5'-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3'。XIST引物序列為正向:5'-ACG CTG CAT GTG TCC TTA G-3'；反向:5'-GAG CCT CTT ATA GCT GTT TG-3'。

1.6 MTT檢測細胞生長曲線

收集各組處于對數(shù)生長期的胰腺癌SW1990細胞，把細胞懸液濃度調(diào)節(jié)為1×105/mL。將100 μL（含1×104個細胞）的細胞懸液種入每孔中，每組設(shè)5個復(fù)孔，種5塊96孔板。置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育，把種板時間作為起始時間點0 h，在1 h取出一塊96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入10 μL 0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。1 000 r/min離心10 min，小心吸掉孔內(nèi)上清液，每孔均加入100 μL二甲基亞砜，將9 6孔板置搖床上，低速振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物。在酶聯(lián)免疫檢測儀上波長490 nm處分別測量各孔的吸光度（A）。同時設(shè)置調(diào)零孔（MTT、培養(yǎng)基、二甲基亞砜）。此后每隔12 h取1塊培養(yǎng)板檢測490 nm的OD值，一共檢測72 h。

1.7 BrdU檢測細胞增殖能力

細胞以2×103/mL細胞數(shù)接種于96孔板中，培養(yǎng)1 d，用含0.4%FCS培養(yǎng)液同步化2 d，使絕大多數(shù)細胞處于G0期。終止細胞培養(yǎng)前，加入BrdU（終濃度為10 μmol/L），37 ℃，孵育24 h。去除培養(yǎng)基，細胞被固定30 min，過氧化物酶孵育耦合抗BrdU抗體（Sigma-Aldrich公司）孵育60 min，用PBS洗3次，加過氧化物酶底物（四甲基聯(lián)苯胺）染色30 min，在490 nm處測定各組的OD值。

1.8 Western blot檢測Ki-67、PCNA

收集各組細胞，每孔不少于1×106個細胞制備總蛋白，定量后按相同總量和濃度進行SDSPAGE垂直電泳（1.5～2.5 h）；然后用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVC膜上（90 V，45～90 min），用5%的脫脂牛奶封閉；洗膜后分別孵育一抗，4 ℃孵育過夜后洗膜3次；孵育二抗，1～2 h后洗膜3次；制備化學(xué)發(fā)光試劑并滴加到含目的蛋白的膜上，暗室顯影或用成像系統(tǒng)直接采集圖像。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 XIST在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達

應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分別檢測56對胰腺癌組織及正常組織中XIST的表達情況，結(jié)果顯示:胰腺癌組織XIST的表達量明顯高于癌旁正常胰腺組織[（2.452±0.134）vs.（0.9729±0.035），P＜0.001]（圖1）。結(jié)合臨床指標(biāo)進行統(tǒng)計分析得出:XIST的高表達與胰腺癌腫瘤分期（P=0.016）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.032）有關(guān)（表1）。

圖1 XIST在胰腺癌組織及癌旁正常組織的表達Figure 1 XIST expression in pancreatic cancer and normal tissues

表1 XIST的表達與胰腺癌患者臨床病理的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relations of XIST expression with clinicopathologic variables of pancreatic cancer patients [n (%)]

2.2 XIST在胰腺癌細胞系中的表達

為了確定XIST在胰腺癌中的表達情況，實驗中選取人胰腺導(dǎo)管上皮細胞HPDE作為對照，同時選擇7個胰腺癌細胞系A(chǔ)sPC-3、BxPC-3、Capan-1、CFPAC-1、Hs766T、Panc-1和SW1990為研究對象。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分別檢測8組細胞中XIST的表達水平，結(jié)果顯示:與HPDE細胞比較，XIST在7個胰腺癌細胞系中均呈高表達（均P＜0.05）；其中SW1990相比較于HPDE，XIST表達水平升高（2.510±0.170）倍（圖2）。

圖2 XIST在胰腺導(dǎo)管上皮細胞與不同胰腺癌細胞系中的表達Figure 2 XIST expressions in pancreatic duct epithelial cells and diあerent pancreatic cancer cell lines

2.3 XIST有效siRNA序列篩選

實驗選擇XIST高表達的SW1990細胞為后續(xù)研究工具細胞，并設(shè)計在SW1990細胞中沉默XIST。將合成的3個XIST siRNA序列分別轉(zhuǎn)染至SW1990細胞，根據(jù)siRNA產(chǎn)品使用手冊推薦，在轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分別檢測4組細胞中XIST mRNA的表達水平，結(jié)果顯示:siRNA2對XIST的RNA表達水平抑制最明顯，表達水平為0.247±0.021，抑制率達到75.3%（P＜0.01）（圖3），滿足后續(xù)實驗需求。

圖3 XIST siRNA序列篩選結(jié)果Figure 3 Results of XIST siRNA screening

2.4 XIST調(diào)控胰腺癌細胞增殖

研究應(yīng)用MTT法和BrdU法測定了XIST siRNA2轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞系SW1990后細胞的活力和增殖水平的變化。MTT法檢測結(jié)果顯示:48 h對照組及沉默組OD（490nm）分別為1.215±0.048、0.812±0.024，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（圖4）。BrdU法檢測結(jié)果顯示:48 h對照組及沉默組OD（450 nm）分別為1.007±0.065、0.708±0.085，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（圖5）。

圖4 MTT檢測XIST沉默對胰腺癌細胞活力的影響Figure 4 In fluence of XIST silencing on viability of pancreatic cancer cells detected by MTT assay

圖5 BrdU法檢測XIST沉默對胰腺癌細胞增殖的影響Figure 5 Influence of XIST silencing on proliferation of pancreatic cancer cells detected by BrdU assay

2.5 XIST調(diào)控細胞增殖相關(guān)蛋白

為進一步驗證XIST抑制胰腺癌細胞增殖的分子機制，實驗在SW1990細胞中轉(zhuǎn)染XIST siRNA2，48 h后收集細胞應(yīng)用Western blot檢測細胞中與增殖相關(guān)基因Ki-67、PCNA的蛋白表達變化。結(jié)果顯示:在48 h對照組與XIST沉默組Ki-67的表達水平分別為1.027±0.074、0.467±0.055，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；在48 h對照組與XIST沉默組PCNA的表達水平分別為0.997±0.105、0.600±0.082，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（圖6）。結(jié)果從分子層面證明:在胰腺癌細胞中，沉默XIST后細胞增殖促進因子Ki-67、PCNA表達被抑制，從而實現(xiàn)抑制癌細胞的增殖。

圖6 XIST沉默對胰腺癌細胞Ki-67、PCNA蛋白表達的影響Figure 6 In fluence of XIST silencing on Ki-67 and PCNA expressions in pancreatic cancer cells

3 討 論

據(jù)2014年最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，發(fā)達國家（美國）胰腺癌新發(fā)估計病例數(shù)，男性列第10位，女性列第9位，占惡性腫瘤病死率的第4位。據(jù)《2013年中國腫瘤登記年報》統(tǒng)計，胰腺癌位列我國男性惡性腫瘤發(fā)病率的第8位，人群惡性腫瘤病死率的第7位，全球范圍內(nèi)均呈快速上升趨勢。胰腺的腫瘤大多是外分泌型腫瘤，80%是胰腺導(dǎo)管腺瘤，只有2%的胰腺外分泌腫瘤為良性[18-20]。胰腺癌以高侵襲性和早期轉(zhuǎn)移為特點，臨床癥狀出現(xiàn)晚，發(fā)現(xiàn)時已為晚期，很難施行治愈性的手術(shù)治療，預(yù)后較差。近幾年在我國發(fā)病率逐年上升，并且有年輕化的趨勢。雖然放療和化療對延長患者生存期起到了一定的作用，但是患者中位生存期仍小于2年[21]。由于胰腺癌的這些特性，尋找參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展，尤其是與胰腺癌早期診斷及預(yù)后相關(guān)的新的生物學(xué)指標(biāo)，對于早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌并改善胰腺癌患者的預(yù)后具有重要意義。

XIST是雌性哺乳動物X染色體的轉(zhuǎn)錄沉默所需的一個長非編碼RNA，它在X染色體失活過程中發(fā)揮重要作用。近年來，越來越多的證據(jù)[22-25]顯示XIST與腫瘤的發(fā)生、進展密切相關(guān)。在膠質(zhì)母細胞瘤中，XIST敲除通過減少細胞增殖、遷移和侵襲以及誘導(dǎo)細胞凋亡而表現(xiàn)出抑制腫瘤發(fā)展的作用[22]。據(jù)Ma等[14-15]報道，在胃癌患者中，XIST高表達同更大的腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。

RT-PCR檢測分析本科室2013—2015年收集的56對正常胰腺組織和胰腺癌組織、人胰腺導(dǎo)管上皮細胞及7個胰腺癌細胞系中XIST的表達情況。結(jié)果顯示在胰腺癌組織和7個胰腺癌細胞系中，XIST均呈現(xiàn)高表達，在SW1990細胞系中表達升高尤其明顯；結(jié)合臨床資料分析顯示XIST的高表達可能與更差的胰腺癌分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與其他學(xué)者[14,26]研究結(jié)果一致。

利用RNA干擾技術(shù)在SW1990細胞中成功實現(xiàn)細胞內(nèi)XIST沉默，胰腺癌細胞的細胞活力和增殖均被顯著抑制，說明XIST在胰腺癌組織和胰腺癌細胞系中的高表達可能與胰腺癌生長及胰腺癌細胞增殖相關(guān)。XIST沉默后，胰腺癌細胞中Ki-67、PCNA的蛋白表達被顯著抑制，說明XIST可能通過調(diào)控胰腺癌細胞中Ki-67、PCNA的蛋白表達來影響胰腺癌細胞增殖。Yue等[27]研究報道，胰腺癌組織及細胞系中，PCNA蛋白過表達可能有助于胰腺癌的發(fā)生或進展；本研究結(jié)果表明XIST沉默可抑制PCNA蛋白表達，并可能通過抑制PCNA蛋白表達而影響胰腺癌細胞活力和增殖。以上結(jié)果表明XIST可能是胰腺癌惡性程度高，增殖快的原因之一。

綜上所述，深入了解XIST促進胰腺癌細胞的增殖及相關(guān)機制，可能為胰腺癌的診斷、病情監(jiān)測提供實驗依據(jù)，有可能將其作為胰腺癌治療的新的作用靶點，對于指導(dǎo)治療、提高術(shù)后生存率有重要的意義。

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