維甲酸聯(lián)合膽汁酸對結(jié)腸癌細胞增殖、抑制凋亡的影響及初步機制研究

曾國祥　王琦　熊娟

[摘要] 目的 探討維甲酸聯(lián)合膽汁酸對結(jié)腸癌細胞增殖、抑制凋亡的影響及初步機制。 方法 選用不同濃度的維甲酸及脫氧膽酸鈉，分別或聯(lián)合作用于人結(jié)腸腺癌HT-29細胞，檢測細胞的增殖以及抑制凋亡情況。 結(jié)果 維甲酸聯(lián)合膽汁酸可以有效抑制HT-29細胞的生長，誘導細胞凋亡，效果優(yōu)于單獨應用（P<0.05）。 結(jié)論 維甲酸聯(lián)合膽汁酸能夠抑制結(jié)腸癌細胞增殖，且抑制凋亡的程度與濃度相關(guān)，能夠為結(jié)腸癌的治療提供參考。

[關(guān)鍵詞] 維甲酸；膽汁酸；結(jié)腸癌；細胞增殖；抑制凋亡

[中圖分類號] R735.35 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）01-0008-03

結(jié)腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國僅次于胃癌和食道癌，居消化道惡性腫瘤的第3位。隨著我國居民生活質(zhì)量以及飲食結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)腸癌的臨床發(fā)病率越來越高。腸腔內(nèi)部微環(huán)境的變化同結(jié)腸癌發(fā)病之間的聯(lián)系受到人們的重視，并且研究人員發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生發(fā)展同動物脂肪的攝入存在聯(lián)系，推測原因是高脂飲食會加大腸腔內(nèi)部的脫氧膽酸，脫氧膽酸作為膽汁酸的一種，能夠通過誘發(fā)細胞DNA的損傷而誘導結(jié)腸癌出現(xiàn)[1]。維甲酸（ATRA）有著廣泛抗腫瘤增殖的活性，能夠降低結(jié)腸癌細胞的耐藥性，不過大劑量使用的毒副作用較為明顯，這就需要探索聯(lián)合用藥抑制細胞增殖的小劑量ATRA。本研究分析ATRA聯(lián)合膽汁酸脫氧膽酸對結(jié)腸癌細胞增殖以及凋亡的影響，探討其可能的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

結(jié)腸癌細胞株為SW116，細胞培養(yǎng)瓶以及培養(yǎng)板為Nuck公司生產(chǎn)，培養(yǎng)基以及MTT為Promaga公司生產(chǎn)，小牛血清為杭州四季清公司生產(chǎn)，脫氧膽酸為上海華美公司生產(chǎn)，兔抗人COX-2抗體為Neomarkers公司生產(chǎn)，ATRA為sigma公司生產(chǎn)，酶標儀型號為Elx800。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)以及藥物準備 腫瘤細胞在培養(yǎng)時選用胎牛血清培養(yǎng)液，條件設置方面，溫度37℃，CO2 5%，濕度100%，培養(yǎng)細胞1 d到對數(shù)生長期，在弱光條件下?lián)Q液后進行實驗[2]。使用100 mg的ATRA加入乙醇當中配成10 mmol/L的母液，在-20℃條件下避光儲存。實驗所需要的ATRA使用培養(yǎng)液進行稀釋，且全部實驗均需要重復3次進行細胞培養(yǎng)。HT-29細胞培養(yǎng)使用RPMI-1640溶液，添加胎牛血清、鏈霉素以及青霉素，37℃條件下傳代培養(yǎng)，每天觀察細胞的生長狀況[3]。

1.2.2 MTT實驗 取對數(shù)生長期HT-29細胞接種到96孔板，每孔10 000。細胞貼壁1 d之后按組別添加濃度10、50、100 μmol/L的ATRA，每孔20 μL，每組共5個復孔，持續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h或72 h，在反應終止前吸去培養(yǎng)液，并加入RPMI-1640培養(yǎng)基，孵箱內(nèi)3 h之后棄上清，使用異丙醇100 μL溶解結(jié)晶振蕩10 min之后應用酶標儀讀取值[4]。

1.2.3 細胞周期以及細胞凋亡 HT-29細胞根據(jù)5×105/mL接種到6空板，每孔3 mL，1 d之后按組別加入不同濃度的脫氧膽酸，每孔3 mL，每組設置5個復孔。作用1 d之后收集貼壁以及懸浮的細胞，根據(jù)說明書使用細胞儀進行檢測[5]。

1.2.4 免疫細胞染色 HT-29細胞根據(jù)5×105/mL接種到6空板，每孔3 mL，在1 d之后分別加入不同濃度的脫氧膽酸，每組設置3個復孔。作用1 d之后終止反應并吸去培養(yǎng)液。使用冷丙酮進行10 min固定，PBS反復進行3次沖洗，滴加100 μL的兔抗人COX-2抗體，5℃冰箱儲存，第2天使用PBS反復進行3次沖洗，滴加100 μL羊抗兔IgG-HRP，并37℃孵育1 h，PBS反復進行3次沖洗之后DAB顯色，脫水，透明，使用樹膠封片[6]。

1.3 判斷標準

結(jié)果判定方面，COX-2及caspase-3染色定位到細胞質(zhì)。PARP-1染色定位到細胞核，其中陽性物質(zhì)為棕黃色或黃色的顆粒。每張玻片選取3個視野（×400），每個視野統(tǒng)計100個細胞，由病理科醫(yī)師使用相關(guān)軟件來測定三者的密度值之后取均值[7]。

1.4 統(tǒng)計學方法

檢測數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件進行分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度/時間ATRA對結(jié)腸癌細胞增殖的抑制率

不同濃度/時間的ATRA對于細胞增殖有明顯的抑制作用，8 μmol/L的ATRA在作用72 h之后對腫瘤細胞的抑制效果顯著優(yōu)于24 h以及48 h（P<0.05），見表1。

2.2 ATRA聯(lián)合脫氧膽酸對HT-29細胞周期和細胞凋亡的影響

流式細胞儀的分析結(jié)果表明，10 μmol/L的脫氧膽酸聯(lián)合8 μmol/L的ATRA作用HT-29細胞24 h，能夠增加HT-29細胞的凋亡，同時細胞周期阻滯在G0/G1期，并且S期細胞明顯減少（P<0.05），見表2。

2.3 ATRA聯(lián)合脫氧膽酸對HT-29細胞COX-2、PARP-1及caspase-3表達的影響

免疫細胞化學染色和光密度分析結(jié)果顯示，ATRA聯(lián)合脫氧膽酸可以有效抑制HT-29細胞的生長，顯著優(yōu)于單用ATRA或單用脫氧膽酸，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

3結(jié)論

腫瘤可以說是多種基因改變誘發(fā)的細胞增殖，使得細胞周期的調(diào)控出現(xiàn)問題，導致細胞出現(xiàn)異常分化。細胞周期控制點以及蛋白表達的失控可以說是腫瘤增生的一個重要影響因素。ATRA能夠誘導細胞分化以及逆轉(zhuǎn)功能，推測起作用途徑在于癌細胞ATRA受體互相作用或借助于抑制細胞表面的黏附蛋白而發(fā)揮影響。近年研究結(jié)果顯示，ATRA能夠誘導小鼠的胚胎癌細胞進一步分化成為纖維母細胞或內(nèi)皮細胞，同時也能夠分化成熟超過90%的人類白血病細胞株，同時體現(xiàn)出成熟細胞的功能以及形態(tài)[8]。在接種不同濃度的ATRA來處理肺癌細胞株到Boyden小室之后，癌細胞的侵襲功能顯著下降，并且同接種的濃度存在直接的聯(lián)系。這意味著ATRA有著影響癌細胞運動以及抑制癌細胞粘附的效果。

有研究報道經(jīng)過ATRA處理之后的胃癌細胞株在接種到裸鼠之后，同未接種的裸鼠比較，接種裸鼠的腫瘤生成率及直徑均顯著下降。電鏡觀察結(jié)果顯示細胞形態(tài)從橢圓形、大核、周邊凹陷改變?yōu)殚L橢圓形、小核以及核周邊光滑，同時癌細胞的G0/G1百分比上升，S期以及M期的百分比明顯下降，意味著ATRA對實體瘤能夠發(fā)揮一定的治療效果[9]。本研究的結(jié)果顯示，ATRA對體外結(jié)腸癌細胞的增殖能夠發(fā)揮明顯的抑制效果，抑制癌細胞增殖并加速癌細胞的分化，同時抑制強度同ATRA的濃度存在著正相關(guān)關(guān)系[10]。TRA能夠借助于誘導癌細胞當中的線粒體基因來調(diào)控腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)與分化。ATRA一方面對白血病能夠發(fā)揮理想的治療效果，另一方面能夠借助于干預多種不同的腫瘤細胞因子，來控制細胞增殖[11]。本研究的結(jié)果顯示，ATRA對于體外結(jié)腸癌細胞的增殖有著明顯的抑制效果，并且同ATRA濃度存在正相關(guān)，ATRA的濃度越高，抑制效果就越為顯著（P<0.05）。需要注意的是，本研究并未直接觀察ATRA對實體瘤直接的作用，要想確定ATRA對于結(jié)腸癌治療的效果，還需要在后續(xù)的研究中觀察ATRA對于實體瘤細胞以及結(jié)腸癌患者的效果。

COX-2在不同類型的腫瘤組織當中都存在過表達，同結(jié)腸癌出現(xiàn)及惡化有著密切的聯(lián)系。抑制COX-2能夠下調(diào)周期調(diào)節(jié)蛋白的表達，并可以上調(diào)caspase-3的表達，阻滯細胞的周期從而誘導細胞的凋亡[12]。常見的細胞凋亡路徑包括細胞內(nèi)凋亡以及細胞外凋亡，后者主要是激活死亡受體并且活化caspase-3，前者主要是借助于線粒體釋放色素來活化caspase-3，從而裂解PARP-1讓其喪失修復DNA的作用，加速腫瘤細胞的凋亡[13]。本研究結(jié)果提示，脫氧膽酸能夠借助于調(diào)高COX-2蛋白的表達而加速結(jié)腸癌細胞的增殖（P<0.05）。有研究人員發(fā)現(xiàn)PARP-l抑制劑對于人肝癌細胞株的生長能夠發(fā)揮抑制效果，但在存在脫氧膽酸的條件下是否可以發(fā)揮這一效果還不確定。本研究的結(jié)果顯示，脫氧膽酸可以加速結(jié)腸腺癌HT-29菌株的增殖，提高COX-2及PARP-1的表達，降低caspase-3的表達，這表明經(jīng)過脫氧膽酸的作用之后，一方面可以損傷HT-29菌株的細胞DNA，從而調(diào)整PARP-1表達并修復DNA，另一方面可以借助于誘導COX-2表達而控制細胞色素，尤其是caspase-3的活性，最終抑制細胞的凋亡[14]。這可以說是脫氧膽酸刺激HT-29細胞增殖的一個影響因素。脫氧膽酸同ATRA聯(lián)合作用于HT-29細胞之后，可以抑制脫氧膽酸對HT-29菌株細胞的增殖效果，從而阻滯細胞的周期并誘導細胞凋亡，降低COX-2以及PARP-1蛋白的表達。脫氧膽酸損傷DNA之后需要PARP-1進行修復，而ATRA作為PARP-l的抑制劑可以降低PARP-1的活性，使得其無法同DNA的缺口進行結(jié)合，從而喪失修復損傷的作用，誘導腫瘤細胞凋亡。除此之外，有研究人員認為二者連用能夠抑制HT-29同內(nèi)皮細胞之間的黏附，聯(lián)系本研究當中COX-2表達同PARP-l表達之間的一致性，推測二者之間存在聯(lián)系[15]。

綜上所述，ATRA聯(lián)合膽汁酸能夠抑制結(jié)腸癌細胞的增殖，同時其抑制凋亡的程度同濃度相關(guān)，能夠為結(jié)腸癌的治療提供參考。

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（收稿日期：2016-06-26）