熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)肺癌ROS1易位病例臨床病理特點(diǎn)

陳敏 劉曉羽 呂麗霞 楊潔亮 王威亞

熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)肺癌ROS1易位病例臨床病理特點(diǎn)

陳敏 劉曉羽 呂麗霞 楊潔亮 王威亞★

目的總結(jié)ROS1（c?ros oncogene1）易位病例分子病理特點(diǎn)及治療情況；探討熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)在肺癌ROS1基因檢測(cè)中的價(jià)值。方法采用熒光原位雜交方法檢測(cè)613例肺癌患者ROS1基因。ROS1易位樣本行手工ROS1免疫組化（IHC）、ALK Ventana全自動(dòng)免疫組化及EGFR突變檢測(cè)。結(jié)果采用ROS1 FISH法檢出19例陽性病例，檢出率為3.1%（19/613）。陽性細(xì)胞平均比例為60%，范圍35%～78%。陽性病例顯示兩種信號(hào)模式，其中63.2%（12/19）為經(jīng)典紅綠分離，36.8%（7/19）為單獨(dú)綠色。19例陽性病例ROS1蛋白表達(dá)為：1例（5%）0+，2例（11%）1+，7例（37%）2+，9例（47%）3+。陽性病例均無ALK基因易位，除1例同時(shí)具EGFR 19外顯子突變外，其余病例均為EGFR野生型。ROS1易位患者年齡略??；女性、非吸煙患者比例較高；大多為晚期病人。組織學(xué)類型以實(shí)體、腺泡及乳頭型腺癌為主。易位病例中，3例患者死亡，7例患者接受克唑替尼治療。結(jié)論ROS1易位更易發(fā)生在年輕、女性、不吸煙的腺癌患者中。FISH方法可有效地檢測(cè)肺癌ROS1基因易位，對(duì)確診ROS1陽性肺癌具有重要意義。

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）；ROS1易位；熒光原位雜交（FISH）

肺癌是目前發(fā)病率和死亡率居首位的惡性腫瘤，是癌癥死亡的主要原因之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non?smallcell lung cancer，NSCLC）約占全部肺癌的85%，在NSCLC中，主要的類型為腺癌（ade?nocarcinoma，AC）、鱗狀細(xì)胞癌（squamouscell carci?noma，SqCC）。晚期NSCLC患者的預(yù)后極差，5年生存率＜15%［1］。近年來肺癌分子驅(qū)動(dòng)基因的檢測(cè)越來越受到關(guān)注，尤其是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域突變、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lym?phoma kinase，ALK）易位以及KRAS突變等基因的檢測(cè)。而ROS1基因易位是新近發(fā)現(xiàn)的NSCLC另一驅(qū)動(dòng)基因［2］，ROS1易位是NSCLC中獨(dú)立的分子亞型，在NSCLC中的發(fā)生率約為1%～2%［3］，在EGFR與ALK雙陰性肺腺癌患者中的陽性比例更高［4］。前期臨床研究顯示，ALK酪氨酸激酶抑制劑克唑替尼（Crizotinib）對(duì)ROS1易位的NSCLC有較好的活性［5］。檢測(cè)ROS1基因易位的方法有免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase poly?merase chain reaction，RT?PCR）和二代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）。

目前國內(nèi)對(duì)ROS1研究的報(bào)道中，綜述較多，大宗的臨床病例及靶向治療方面的報(bào)道較少。因此，本研究采用FISH技術(shù)檢測(cè)613例肺癌ROS1基因易位，總結(jié)易位陽性病例臨床病理特點(diǎn)并探討FISH技術(shù)在ROS1基因易位檢測(cè)中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例收集

2014年1月至2016年1月間四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科完成ROS1基因FISH檢測(cè)的613例石蠟組織標(biāo)本。記錄所有患者的臨床資料包括：性別、年齡、吸煙史、臨床分期、治療及隨訪情況。組織病理分型和臨床分期參考2015版世界衛(wèi)生組織的肺癌組織學(xué)分類［6］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 IHC檢測(cè)及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

所有標(biāo)本均為10%中性緩沖福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm。ROS1 IHC采用手工方法。ROS1抗體（D4D6）購自Cell Signaling Technology（Danvers，MA，美國），并按1∶100稀釋。用pH=9.0的EDTA抗原修復(fù)液，修復(fù)條件為97℃，40 min。一抗孵育過夜，于一抗之后使用增強(qiáng)劑（Dako，美國），室溫孵育10 min，并用增強(qiáng)顯色試劑盒檢測(cè)。ALK IHC采用VentanaBench?Mark XT全自動(dòng)染色。

ROS1 IHC結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：0+（陰性）：腫瘤細(xì)胞無明確著色；1+：＞5%腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)微弱或模糊的胞漿著色；2+：＞5%腫瘤細(xì)胞中等強(qiáng)度胞漿著色；3+：＞5%腫瘤細(xì)胞胞漿強(qiáng)陽性著色［6］。ALK IHC結(jié)果判讀采用試劑盒推薦的二元化標(biāo)準(zhǔn)，即：在空白對(duì)照及陽性對(duì)照均正常的情況下，檢測(cè)樣本評(píng)價(jià)為陽性或者陰性。

1.2.2 FISH檢測(cè)及判讀標(biāo)準(zhǔn)

采用ROS1雙色分離探針（Vysis LSI ROS1 Du?al Color，Break Apart Rearrangement Probe，Abbott Molecular），將613例肺癌患者病理組織樣本石蠟切片按照常規(guī)FISH實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理。雜交過程嚴(yán)格按照ROS1探針試劑盒說明書操作。

FISH結(jié)果判定：在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，正常ROS1基因呈現(xiàn)紅綠重合的黃色信號(hào)，當(dāng)紅綠信號(hào)分開且兩信號(hào)之間距離大于2個(gè)信號(hào)點(diǎn)大小或出現(xiàn)單獨(dú)的綠色信號(hào)時(shí)判定為該細(xì)胞ROS1易位基因陽性［8］。選擇染色明亮、細(xì)胞核完整且雜交信號(hào)強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，至少計(jì)數(shù)50個(gè)腫瘤細(xì)胞，閾值設(shè)定為15%。

1.2.3 EGFR突變PCR檢測(cè)

采用DNeasy試劑盒（Qiagen，德國）提取石蠟包埋組織中DNA。EGFR突變采用ARMS法檢測(cè)29位點(diǎn)突變（AmoyDx，艾德，中國廈門）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

研究數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行分析處理。組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ROS1易位患者臨床病理特征

613例肺癌患者平均發(fā)病年齡為58.47歲，中位年齡59歲（20～94歲）。男：女=1.30∶1。613例肺癌患者中共檢出19例ROS1基因易位，陽性率為3.1%，均為肺腺癌。陽性患者年齡略輕（平均56.1歲），與陰性組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。陽性患者中男性8例，女性11例，男∶女=0.73∶1，女性患者更多見（P＞0.05）。19例中6人有吸煙史，13例無吸煙史（P＞0.05）。陽性病例臨床分期多為晚期，其中Ⅲ期8例、Ⅳ期9例，組織學(xué)亞型以實(shí)體與腺泡型為主（圖1）。其分化程度為：低分化13例（68%）、低～中分化5例（26%）、中分化1例（5%），無高分化病例。ROS1易位患者臨床病理特征見表1。

表1 ROS1陽性患者臨床病理特征（n=19）Table 1 The major clinicopathological features for ROS1 positive cases（n=19）

2.2 ROS1易位患者IHC及分子檢測(cè)結(jié)果

19例陽性病例ROS1蛋白表達(dá)為：1例（5%）0+，2例（11%）1+，7例（37%）2+，9例（47%）3+。ROS1易位病例陽性細(xì)胞平均比例為60%，范圍為35%～78%。其中12例（63.16%）為經(jīng)典紅綠分離，7例（36.84%）為單獨(dú)綠色（圖2）。ROS1易位病例ALK Ventana染色均為陰性，1例同時(shí)具EGFR 19外顯子突變，余18例均為EGFR野生型。

2.3 治療情況

19例易位病例全部獲得隨訪，截止到2016年6月，有3例病人死亡。1例為44歲女性患者（生存時(shí)間17個(gè)月），形態(tài)為微乳頭狀；1例為25歲女性患者（生存時(shí)間1個(gè)月），形態(tài)為實(shí)體和腺泡結(jié)構(gòu)為主；另1例為20歲男性患者（生存時(shí)間3個(gè)月），形態(tài)為實(shí)體性。此3位病人平均生存時(shí)間為7個(gè)月。有7例患者行克唑替尼靶向治療，一日兩次，每次口服劑量250 mg。治療時(shí)間為1～14個(gè)月，平均治療時(shí)間為8.3個(gè)月。7例患者均無疾病進(jìn)展。1例生物治療；1例未行治療。其中部分病人同時(shí)行放化療。

圖1 ROS1陽性病例形態(tài)學(xué)特點(diǎn)Figrue 1 Histologic features of ROS1 positive cases

圖2 熒光原位雜交檢測(cè)ROS1易位信號(hào)模式（×1 000倍）Figure 2 The ROS1 translocation signals by FISH（×1 000）

3 討論

肺癌因其高發(fā)病率及死亡率成為研究的熱點(diǎn)，其分子靶向治療也引起極大的關(guān)注。ROS1易位NSCLC為NSCLC中一個(gè)獨(dú)特的分子亞型。ROS1基因定位于6號(hào)染色體，屬于受體酪氨酸激酶家族，迄今已發(fā)現(xiàn)至少9種ROS1易位基因。本研究采用FISH法檢測(cè)613例肺癌患者ROS1基因，共檢出19例陽性病例，陽性率3.1%，比文獻(xiàn)報(bào)道NSCLC中ROS1易位整體1%～2%的陽性率略高［8］，可能與本研究的部分病例為EGFR和ALK基因雙陰性有關(guān)，從而間接提高了ROS1的檢出率。本研究與武莎菲等［9］報(bào)道的EGRF/KRAS/ALK三陰肺癌患者中ROS1易位3.7%的陽性率接近。ROS1易位陽性患者與陰性患者相比，年齡較小、女性非吸煙患者稍多、分化程度低、臨床分期高，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［10?11］。組織學(xué)類型集中在實(shí)體、腺泡和乳頭狀亞型，并伴有印戒細(xì)胞、粘液、篩狀、貼壁等成分。同一病例各不同組織學(xué)亞型之間ROS1基因結(jié)果無差異，ROS1基因表達(dá)無異質(zhì)性。國內(nèi)程弘夏［12］與劉盡國［13］分別報(bào)道了53例和16例ROS1易位病例，均發(fā)現(xiàn)ROS1易位在青年、非吸煙患者中較為多見。

研究認(rèn)為NSCLC中驅(qū)動(dòng)基因改變是相互排斥的。本研究檢測(cè)到1例無吸煙史的女性患者存在ROS1易位與EGFR 19外顯子突變。此病例ROS1 IHC 1+，ROS1 FISH檢測(cè)為經(jīng)典紅綠分離信號(hào)。組織學(xué)類型以實(shí)體和腺泡為主，未行克唑替尼靶向治療，截止隨訪，仍存活。目前有一些文獻(xiàn)陸續(xù)報(bào)道ROS1易位與EGFR突變共存的現(xiàn)象。Rimkunas等［1］報(bào)道9例ROS1重排患者中，有2例患者同時(shí)存在EGFR不同位點(diǎn)突變。劉盡國等［13］通過PCR方法從369例肺腺癌組織中檢測(cè)到3例ROS1易位與EGFR突變共存病例。說明ROS1易位可與EGFR突變共存，但ROS1易位本身陽性率低，ROS1易位與EGFR突變共存的病例更少。目前關(guān)于這類雙陽性病例的臨床病理及治療情況有限，有待進(jìn)一步研究。

ROS1與ALK受體酪氨酸激酶（receptor tyro?sine kinase，RTK）結(jié)構(gòu)域有49%的氨基酸同源序列。多種ALK抑制劑在體外均可抑制ROS1的活性。ALK抑制劑克唑替尼通過抑制ROS1的磷酸化從而抑制ROS1的激酶活性。在本組ROS1陽性病例中，采用IHC檢測(cè)ALK蛋白的表達(dá)，19例病例全部為陰性，未檢測(cè)到ROS1與ALK雙陽病例。ALK基因易位發(fā)生率在3%～7%。在我國間變性淋巴瘤激酶（ALK）陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識(shí)中［14］，ALK?Ventana、ALK?FISH和ALK?PCR 3種檢測(cè)ALK易位的方法都得到了認(rèn)可。全自動(dòng)ALK免疫組織化學(xué)（Ventana IHC）與Vysis ALK雙色分離探針檢測(cè)間的符合率在97%，Ven?tana IHC的特異性能達(dá)到100%，敏感性也在95%以上［15］。

本研究中7例ROS1易位患者行克唑替尼靶向治療，治療時(shí)間為1～14個(gè)月，平均治療時(shí)間為8.3個(gè)月，均無疾病進(jìn)展。2014年新英格蘭雜志報(bào)道50例ROS1陽性NSCLC患者行克唑替尼靶向治療，其療效優(yōu)于ALK易位患者［16］。因此如何準(zhǔn)確有效地篩選出ROS1易位肺腺癌患者，讓更多的患者從靶向治療中獲益就顯得尤為重要。

檢測(cè)ROS1基因易位有多種方法［17］，包括FISH、PCR、IHC和二代測(cè)序技術(shù)。PCR技術(shù)對(duì)樣本RNA質(zhì)量要求較高，且不能檢測(cè)未知的斷裂點(diǎn)。有研究認(rèn)為IHC快速、簡(jiǎn)便且價(jià)格低廉，可用于初步篩查ROS1基因易位［18］。但在ROS1易位基因的IHC檢測(cè)中，暫無統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)流程及判讀標(biāo)準(zhǔn)，也未實(shí)行自動(dòng)化操作。本研究中，1例ROS1易位FISH陽性病例其ROS1 IHC結(jié)果為陰性。此病例為胸水細(xì)胞塊，可能與腫瘤細(xì)胞在保存、運(yùn)輸過程中樣本質(zhì)量或抗原丟失有關(guān)，提示IHC染色可能會(huì)出現(xiàn)少數(shù)病例漏診的現(xiàn)象。近年NGS研究較多，而臨床應(yīng)用較少。本研究中FISH檢測(cè)在各種類型的石蠟包埋組織樣本中均取得成功，易位信號(hào)明確，易于判讀。

本研究通過FISH技術(shù)檢測(cè)613例肺癌石蠟包埋組織中ROS1基因易位，檢出19例陽性病例，陽性率為3.1%。ROS1易位作為NSCLC中獨(dú)立的分子亞型，其更易發(fā)生在年輕、女性、不吸煙的腺癌患者中。組織學(xué)類型以實(shí)體和腺泡狀成分為主。ROS1易位可與EGFR突變共存，本研究未檢測(cè)到ROS1易位與ALK易位共存病例。FISH方法可有效的檢測(cè)肺癌ROS1基因易位。與IHC相比，F(xiàn)ISH檢測(cè)ROS1基因易位特異性更高，從而為患者靶向治療提供可靠的依據(jù)。

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Detection of ROS1 gene rearrangement by FISH in lung cancer and analysis of its clinicopathological features

CHEN Min,LIU Xiaoyu,LV Lixia,YANG Jieliang,WANG Weiya★
(Department of Pathology,West China Hospital of Sichuan University,Chengdu,Sichuan,China,610041)

ObjectiveTo analyze the molecular,pathological,and therapeutic features of ROS1?translocation positive lung cancer cases,and to investigate the value of fluorescence in situ hybridization(FISH) in screening for and confirming the ROS1 translocation.MethodsIn this study,ROS1?translocation detection was performed in 613 cases with FISH.For ROS1?FISH positive samples,manual ROS1 immunohistochemistry (IHC),ALK IHC using a Ventana auto?stainer and EGFR mutation status were analyzed.Results19 ROS1?translocation positive cases were detected by FISH and with a positive incidence of 3.1%.The average percentage of positive tumor cells was 60%,ranging from 35%to 78%.Among these positive cases,63.2%(12/ 19)cases displayed classical break apart signals,whereas 36.8%(7/19)showed isolated green signals.In the ROS1?translocation group,the expression of ROS1 protein are as follows:1 case was not stained 0+（5%）;2 cases had weak expression 1+(11%);7 cases had moderate expression 2+(37%)and 9 cases had strong expression 3+(47%).With the exception of one patient with an EGFR deletion mutation in exon19,ROS1?translocation positive adenocarcinomas in all patients revealed no alterations in ALK or EGFR genes.The ROS1?translocationpositive patients were slightly younger than the negative patients,and were predominantly female, non?smokers.Most of the ROS1?translocation tumors showed solid,acinar and papillary patterns with a moreadvanced clinical stage.Furthermore,the positive cases all survived except 3 patients,and 7 patients were treated with crizotinib.ConclusionROS1 rearrangement tends to occur in younger,female,non?smoking lung adenocarcinoma patients.To make a definite positive diagnosis of ROS1?translocationin lung cancer,FISH is a relevant detection method.

Non?small cell lung cancer(NSCLC);ROS1 translocation;Fluorescence in situ hybridization(FISH)

國家自然科學(xué)基金（81302027）

四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科，四川，成都 610041

★通訊作者：王威亞，E?mail：151422303@qq.com