易變鏈霉菌TRM 45540四氫嘧啶合成相關(guān)基因的克隆

張慧艷，劉芝瑾，徐 同，馬金福，梁 凱，羅曉霞

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán) 塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300)

易變鏈霉菌TRM 45540四氫嘧啶合成相關(guān)基因的克隆

張慧艷，劉芝瑾，徐 同，馬金福，梁 凱，羅曉霞

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán) 塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300)

為了探索嗜鹽放線菌對高鹽環(huán)境的適應(yīng)機(jī)理,以分離于羅布泊易變鏈霉菌TRM 45540為材料，利用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建四氫嘧啶異源生物合成工程菌(以E.coli為宿主)，對ectA、ectB、ectC與ectABC基因進(jìn)行異源表達(dá)，分析異源宿主菌的耐鹽能力。結(jié)果表明：TRM 45540四氫嘧啶合成相關(guān)基因ectA為 474 bp，預(yù)測編碼蛋白為19 ku；ectB為1 272 bp，預(yù)測編碼蛋白為44.6 ku；ectC為399 bp，預(yù)測編碼蛋白為19 ku；全長基因ectABC為2 403 bp，并且攜帶有ectABC基因工程菌的耐鹽能力顯著提高。

易變鏈霉菌；四氫嘧啶；基因克隆

極端微生物因其在極端環(huán)境中特殊的適應(yīng)能力，引起科學(xué)家的廣泛興趣并成為微生物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[1]。中度嗜鹽菌與極端嗜鹽菌相比，具有更寬的鹽適應(yīng)范圍。中度嗜鹽菌通常能夠在細(xì)胞內(nèi)高濃度累積小分子有機(jī)滲透溶質(zhì)，如糖、多元醇、甜菜堿及氨基酸等，使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓達(dá)到平衡[2-5]。Galinski通過HPLC和NMR的方法對不同鹽環(huán)境菌株細(xì)胞內(nèi)相容性溶質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在放線菌中的相容性物質(zhì)種類豐富，四氫嘧啶是一種主要的相容性溶質(zhì)存在于細(xì)胞質(zhì)中[6]，而中度嗜鹽菌為了在高鹽環(huán)境下求得生存，需要依賴這種相容性物質(zhì)，在以色列鹽單胞菌[7]、嗜鹽海球菌[8]、巴斯德氏鹽水芽孢桿菌[9]均有報(bào)道。

四氫嘧啶為N-乙酰化二氨基丁酸通過分子內(nèi)脫水形成的一種嘧啶衍生物，四氫嘧啶分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是高度水溶性、不帶靜電荷，在細(xì)胞內(nèi)高濃度積累可以提高細(xì)胞內(nèi)的滲透壓，但不會影響生物大分子的正常生理功能。以天冬氨酸為前體的四氫嘧啶合成途徑，是由 L-天冬氨酸-β-半醛(ASA)開始合成的，中間經(jīng)過3個(gè)步驟，第1個(gè)反應(yīng)：2,4-二氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(EctB)催化ASA生成L-2,4-二氨基丁酸(DABA)；第2個(gè)反應(yīng)：2,4-二氨基丁酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(EctA)將DABA乙?；蒒-乙酰-L-2,4-二氨基丁酸(ADABA)；最后，四氫嘧啶合成酶(EctC)催化ADABA環(huán)化成四氫嘧啶[10-11]。

菌株TRM 45540分離于新疆羅布泊土壤環(huán)境，NaCl適應(yīng)范圍廣，生長快，為典型的中度嗜鹽菌，是研究耐鹽放線菌耐鹽機(jī)制的良好材料。本研究通過分析已發(fā)表四氫嘧啶合成基因相關(guān)序列的保守結(jié)構(gòu)域，利用生物信息學(xué)技術(shù)，掃描TRM 45540菌株的全基因組序列[12]，找到與四氫嘧啶合成相關(guān)的序列，以此設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得四氫嘧啶合成相關(guān)基因ectABC，獲得ectABC重組子，檢測重組子對不同質(zhì)量濃度NaCl的耐受能力。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 易變鏈霉菌(Streptomycesmutabilis) TRM 45540 (與標(biāo)準(zhǔn)菌株StreptomycesmutabilisNBRC 12800T相似性為99.79%)。使用ISP-4培養(yǎng)基，添加0.05 g/mL NaCl，37 ℃培養(yǎng)5～7 d。

1.1.2 主要儀器和試劑 PCR儀:德國Senso Quest Labcycler；凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAD；高速離心機(jī)：德國Eppendorf；電泳儀：北京六一。

菌株或質(zhì)粒：表達(dá)載體pET-28a(+)和E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均來自塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微生物資源研究室。

PCR擴(kuò)增全套試劑購自廣州東盛生物科技有限公司；連接試劑盒，pMD18-T載體試劑盒，限制性內(nèi)切酶HindⅢ，BamH Ⅰ和EcoRⅠ，T4DNA Ligase購自寶生物工程有限公司(TaKaRa)；膠回收試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；一抗：抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體(Protein FindTMAnti-His Mouse Monoclonal antibody)，二抗：辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(Protein FindTMGoatAnti-Mouse IgG(H+L),HRP Conjugate)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司(TransGen)；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 四氫嘧啶合成相關(guān)基因克隆

四氫嘧啶合成過程中相關(guān)的基因有3個(gè)：ectA，ectB和ectC。在四氫嘧啶合成基因簇中，ectABC基因形成1個(gè)操縱子結(jié)構(gòu)，共用1個(gè)啟動子。通過GenBank中已發(fā)表的ectABC序列，找到每個(gè)基因的保守結(jié)構(gòu)域，利用生物信息學(xué)技術(shù)，掃描菌株的全基因組序列[12]，分別找到多條與四氫嘧啶合成基因相關(guān)的區(qū)域，選擇相鄰近的3段區(qū)域設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與四氫嘧啶合成相關(guān)的基因ectA，ectB和ectC及ectABC全長序列，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，將獲得的陽性轉(zhuǎn)化子送樣測序。

引物設(shè)計(jì)見表1(下劃線表示加入的酶切位點(diǎn))：下劃線堿基GGATCC為限制性內(nèi)切酶BamHⅠ，下劃線堿基AAGCTT為限制性內(nèi)切酶HindⅢ，下劃線堿基GAATTC為限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ。

表1 四氫嘧啶基因引物序列Table 1 Primer sequence of ectoine gene

1.3 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

用BamHⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ對目的PCR片段和表達(dá)載體pET 28a分別進(jìn)行雙酶切(ectA基因用BamHⅠ和HindⅢ，ectB基因用EcoRⅠ和HindⅢ，ectC基因用BamHⅠ和HindⅢ)，酶切后用T4DNA連接酶連接獲得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，PCR驗(yàn)證重組子，挑取陽性克隆子測序。

1.4 Western blot 檢測

將純化的EctA，EctB和EctC蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測，用Mini-Trans Blot 轉(zhuǎn)膜儀120 V 電壓轉(zhuǎn)膜1 h，用封閉液進(jìn)行過夜封閉后，分別用一抗二抗各孵育1 h后，用DAB顯色。

1.5 耐鹽度測定

配制不同NaCl質(zhì)量濃度的LB培養(yǎng)基，以載體和E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞為對照，觀察重組子的耐鹽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 四氫嘧啶合成基因的克隆

2.1.1ectC的克隆 通過全基因組掃描，在菌株TRM 45540基因組中篩選到1條與ectC基因相似的序列，以篩選的序列為模板設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增到與目的條帶一樣大小的片段(圖1)，大小為399 bp，將擴(kuò)增得到的片段克隆測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其具有Ectoin_synth保守結(jié)構(gòu)域，與四氫嘧啶合成相關(guān)，并且該片段與已發(fā)表的四氫嘧啶合酶(ectoine synthase)的一致性為98%。

ectABC基因形成一個(gè)操縱子結(jié)構(gòu)，通過保守結(jié)構(gòu)域的分析及預(yù)測，在TRM 45540菌株基因組中分別掃描預(yù)測到1條與ectA和ectB基因相關(guān)的序列(圖1-A)。以TRM 45540的總DNA為模板，以45540ectA-R，45540ectA-F和45540ectB-R，45540ectB-F為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。引物對45540ectA-F和45540ectA-R擴(kuò)增得到與預(yù)期大小相符的片段約500 bp(圖1-B)，引物對45540ectB-F和45540ectB-R擴(kuò)增得到與預(yù)期片段大小相符的約1 200 bp 的片段。引物對ectA-F和ectC-R擴(kuò)增得到四氫嘧啶合成基因簇ectABC的全長序列，ectABC全長約 2 403 bp(圖1)。將PCR擴(kuò)增的目標(biāo)片段進(jìn)行雙酶切后與載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化DH5α。用堿裂解法抽提重組菌的質(zhì)粒(圖1-C)，分別對重組質(zhì)粒ectA+T/DH5α (HindⅢ+BamHⅠ),ectB+T/DH5α(HindⅢ+EcoRⅠ)和ectC+T/DH5α(HindⅢ+BamHⅠ)進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。TRM 45540四氫嘧啶合成相關(guān)基因ectA為474 bp，ectB為1 272 bp，ectC為399 bp，全長基因ectABC為2 403 bp(圖1-D)。

A.四氫嘧啶合成基因的結(jié)構(gòu); ectA有474 bp,ectB有1 272 bp,ectC有399 bp,ectABC有2 403 bp。 B.四氫嘧啶合成基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果; M.DNA marker(DL2000),1.ectA(474 bp),2.ectB(1 272 bp),3.ectC(399 bp),4.ectABC(2 403 bp)。C.四氫嘧啶合成基因重組質(zhì)粒驗(yàn)證; 1.pUC19/DH5α,2.ectA+T/DH5α,3.pUC19/DH5α,4.ectB+T/DH5α,5.pUC19/DH5α,6.ectC+T/DH5α,7.pUC19/DH5α,8.ectABC+T/DH5α。 D.四氫嘧啶合成基因重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證; 1.ectA+T/DH5α(Hind Ⅲ+EcoRⅠ，2.ectA+T/DH5α，3.ectB+T/DH5α(Hind Ⅲ+EcoRⅠ)， 4.ectB+T/DH5α， 5.ectC+T/DH5α(Hind Ⅲ+EcoRⅠ)， 6.ectC+T/DH5α， 7.ectABC+T/DH5α (Hind Ⅲ+EcoRⅠ)， 8.ectABC+T/DH5α，9.pUC19(Hind Ⅲ+EcoRⅠ)，10.pUC19， M1.DNA Marker(plusⅡ)，M2.DNA Marker(λHind Ⅲ)

2.1.2ectA、ectB和ectC基因的分析及異源表達(dá) 通過與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析ectA、ectB、ectC基因的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示：TRM 45540中ectA基因含有1個(gè)與2，4-二氨基丁酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(2,4-diaminobutyric acid acetyltransferase)合成相關(guān)的保守結(jié)構(gòu)域NAT-SF(N-Acyltransferase superfamily)；將序列通過Blastx比對，發(fā)現(xiàn)TRM 45540ectA基因與Streptomycessp.TOR3209的2,4-diaminobutyric acid acetyltransferase一致性為97%，對ectA基因進(jìn)行異源表達(dá)，通過SDS-PAGE檢測EctA蛋白大小為19 ku，與預(yù)測大小一致(圖2-A)；ectB基因含有1個(gè)與2，4-二氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(L-2,4-diaminobutyric aminotransferase)合成相關(guān)的保守結(jié)構(gòu)域AAT-I superfamily(Aspartate aminotransferase superfamily)，將序列通過Blastx比對，ectB基因與StreptomycesbottropensisATCC 25435的L-2,4-diaminobutyric aminotransferase一致性為93%，對ectB基因進(jìn)行異源表達(dá)，通過SDS-PAGE檢測EctB大小為44.6 ku，與預(yù)測大小一致(圖2-B)；ectC基因含有1個(gè)與四氫嘧啶合成酶(ectoine synthase)合成相關(guān)的保守結(jié)構(gòu)域EctC(Ectoine-synth Superfamily)，將序列通過Blastx比對，TRM 45540ectC基因與Streptomycessp.TOR3209的ectoine synthase 一致性為98%,對ectC基因進(jìn)行異源表達(dá)，通過SDS-PAGE檢測EctC大小為19 ku，與預(yù)測大小一致(圖2-C)。

2.2 四氫嘧啶合成基因的耐鹽性鑒定

將攜帶有四氫嘧啶基因的重組菌分別接種于含NaCl 0、0.01、0.03、0.05 g/mL的LB培養(yǎng)基中，以pET32a/DH5α、puc19/DH5α和pET32a/ BL21(DE3) (載體)為陰性對照，以TRM 45540 為陽性對照，觀察重組子的耐鹽性(圖3)。

由圖3可以看出，重組菌能夠在0.01 g/mL含鹽培養(yǎng)基上生長，而在0.03 g/mL的培養(yǎng)基上生長較為微弱，在0.05 g/mL的含鹽培養(yǎng)基上不能生長，pET 28a/ DH5α、pET 28a/ DH5α和pET 28a/ BL21(DE3)均不能在0.03 g/mL和0.05 g/mL的含鹽培養(yǎng)基上生長。而包含有ect基因的重組菌ectABC+pET-28a/DH5α、ectABC+pET-28a/BL21(DE3)能夠在0.05 g/mL含鹽培養(yǎng)基中生長，由此證明ect基因能夠提高重組菌對NaCl的耐受性。

A: ectA基因的異源表達(dá)SDS-PAGE檢測, M.蛋白質(zhì)Marker(80 ku),1. pET-28a/BL21(DE3), 2. ectA+pET-28a/ BL21(DE3), 3.Ect5A(上樣量為5 μL) , 4. Ect5A(上樣量為10 μL); B: ectB基因的異源表達(dá)SDS-PAGE檢測, M.蛋白質(zhì)Marker(80 ku),1.ectB+pET-28a/BL21(DE3), 2.EctB(上樣量為5 μL), 3. EctB(上樣量為10 μL), 4. pET-28a/BL21(DE3); C: ectC基因的異源表達(dá)SDS-PAGE檢測, M. 蛋白質(zhì)Marker(80 ku), 1. EctC(上樣量為 5 μL), 2. ectC+pET-28a/BL21(DE3), 3. pET-28a/BL21, 4.EctC(上樣量為 10 μL); D: EctA、 EctB、EctC蛋白Western blot 檢測, M. 蛋白質(zhì)Marker(80 ku), 1. EctA, 2.EctB, 3.EctC,4.pET-28a/BL21

3 討 論

嗜鹽放線菌分布廣泛，不論是普通環(huán)境的低鹽土壤還是飽和鹽濃度的環(huán)境均能存在，他們包含幾乎所有的代謝類型，他們獨(dú)特的基因類型，特殊的生理機(jī)制及包括次級代謝產(chǎn)物在內(nèi)的新活性分子，使鹽環(huán)境，尤其是極端鹽環(huán)境成為發(fā)現(xiàn)新微生物資源及新活性分子的寶庫。羅布泊位于新疆塔里木盆地東部，若羌縣境內(nèi)，曾是中國第二大內(nèi)陸湖，在20世紀(jì)中后期因塔里木河流量減少，周圍沙漠化嚴(yán)重，使其迅速退化并干涸。羅布泊含有豐富的鉀鹽礦藏資源，是國內(nèi)為數(shù)不多超大型鉀鹽礦之一[13]。這為研究中度嗜鹽菌鹽適應(yīng)機(jī)制提供一個(gè)嶄新的平臺。

四氫嘧啶是一種廣泛存在于嗜鹽微生物中的相容性溶質(zhì)。在高滲透壓脅迫下，嗜鹽微生物會在細(xì)胞內(nèi)累積大量四氫嘧啶來平衡細(xì)胞內(nèi)外滲透壓；在低滲透壓下，微生物則會向細(xì)胞外釋放細(xì)胞內(nèi)的四氫嘧啶。通過這種方式，使許多嗜鹽微生物可以在高溫、干旱、鹽堿等極端環(huán)境存活。目前已從多種微生物中克隆到與四氫嘧啶合成相關(guān)的基因[14]。

本試驗(yàn)以一株完成全基因組測序的中度嗜鹽鏈霉菌為研究對象，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測除與四氫嘧啶合成基因簇相關(guān)的序列，以基因組序列作為模板設(shè)計(jì)四氫嘧啶合成基因簇的引物，擴(kuò)增得到目標(biāo)片段并進(jìn)行測序驗(yàn)證。TRM 45540四氫嘧啶合成相關(guān)的基因全長2 403 bp，由3個(gè)ORF組成，為一個(gè)操縱子結(jié)構(gòu)。通過BLAST比對分析，TRM 45540與Streptomycessp.TOR3209的ectABC基因親緣關(guān)系最相近，TRM 40136ectABC基因可能為一新基因。通過鹽耐受試驗(yàn)表明，TRM 45540 四氫嘧啶合成相關(guān)的基因能夠提高重組菌對NaCl的耐受能力。生理生化試驗(yàn)表明，TRM 45540可在0～0.08 g/mL的NaCl質(zhì)量濃度下生長，最適生長的NaCl質(zhì)量濃度為0.05 g/mL，通過重組菌鹽耐受試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TRM 45540的四氫嘧啶合成相關(guān)的基因明顯提高重組菌的鹽耐受能力，但是重組菌對NaCl的耐受能力僅為0.05 g/mL，而不同于野生菌TRM 45540可以耐受較高的NaCl質(zhì)量濃度，通過對TRM 45540的全基因組序列分析，還發(fā)現(xiàn)在TRM 45540中存在多個(gè)與耐鹽相關(guān)的相容性溶質(zhì)合成基因，如海藻糖合成相關(guān)基因(tps和tpp)、甘露醇合成相關(guān)基因(mtlD)和甜菜堿合成相關(guān)基因(betA和betB)等。因此推測：TRM 45540之所以能夠耐受較高的NaCl質(zhì)量濃度，可能與多個(gè)相容性溶質(zhì)協(xié)同作用有關(guān)。

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(責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Cloning of Biosynthetic Gene Cluster of Ectoine fromStreptomycesmutabilisTRM 45540

ZHANG Huiyan,LIU Zhijin,XU Tong,MA Jinfu,LIANG Kai and LUO Xiaoxia

(Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin of Xinjiang Production&Construction Corps/College of Life Science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China)

The aim of this study is to conduct research into adaptive mechanism of halophile actinomycetes in hypersaline environments.The wide type strainStreptomycesmutabilisTRM 45540 was used as material,we inserted theectA,ectB,ectCandectABCinto the expression vector pET28a to generate recombinant plasmidsectABC+pET-28a/BL21(DE3),then analyzed the salt tolerance of recombinants.The results showed thatectABCgene was 2 403 bp,including three subunits such asectA,ectBandectC.EctAgene was 474 bp,the encoding protein 19 ku,ectBgene 1 272 bp,the encoding protein 44.6 ku;ectCgene was 399 bp,the encoding protein was 19 ku.Moreover,the recombinant showed higher salt tolerance.

Streptomycesmutabilis；Ectoine；Gene clone

ZHANG Huiyan,female,undergraduate.Research area:application of biological science.E-mail: 1018630306@qq.com

LUO Xiaoxia,female,associate professor.Research area:extremophiles functional genes.E-mail：xxluo415@163.com

日期：2017-03-03

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0832.046.html

2016-01-24

2016-07-25

兵團(tuán)博士基金(2014BB008)；塔里木大學(xué)校長基金(TDZKBS201301)；塔里木大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(201410757012)。

張慧艷,女，本科生，研究方向?yàn)閼?yīng)用生物科學(xué)。E-mail：1018630306@qq.com

羅曉霞，女，副教授，研究方向?yàn)闃O端微生物功能基因。E-mail：xxluo415@163.com

Q786

A

1004-1389(2017)03-0471-06

Received 2016-01-24 Returned 2016-07-25

Foundation item Ph.D Foundation of Xinjiang Production & Construction Corps(No.2014BB008); the President Foundation of Tarim University (No.TDZKBS201301); National Innovative Project for College Students(No.201410757012).