梭梭14-3-3蛋白基因 HaFT-1和 HaFT-2克隆及表達分析

李亞婕，張 樺，蔣圓圓，麻 浩，姚正培，任燕萍，王 澤，馬 林

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.哈密職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆哈密 839000； 3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，南京 210095；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 干旱區(qū)荒漠研究所，烏魯木齊 830052)

梭梭14-3-3蛋白基因 HaFT-1和 HaFT-2克隆及表達分析

李亞婕1，張 樺1，蔣圓圓2，麻 浩3，4，姚正培1，任燕萍1，王 澤4，馬 林1

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.哈密職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆哈密 839000； 3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，南京 210095；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 干旱區(qū)荒漠研究所，烏魯木齊 830052)

根據(jù)前期梭梭干旱轉(zhuǎn)錄組測序得到的Unigene序列，成功克隆2個梭梭14-3-3蛋白基因，分別命名為 HaFT-1和 HaFT-2，并對其進行基因表達分析。結(jié)果表明： HaFT-1基因在梭梭的根、種子中均可表達，且根中表達最強； HaFT-2基因在梭梭同化枝中表達最強，根的表達量次之。干旱脅迫后 HaFT-1和 HaFT-2基因的表達量均下調(diào)。本研究初步分析 HaFT-1、 HaFT-2基因的表達模式，為進一步研究該基因功能奠定基礎(chǔ)。

梭梭；14-3-3蛋白；基因克?。槐磉_

梭梭(Haloxylonammodendron)為梭梭屬(Haloxylon Bunge)，藜科(Chenopodiaceae)超旱生小喬木，呈高大灌叢狀[1]。其主要生長在中國的西北部，是重要的固沙植物，在沙地、固定和半固定沙丘，荒漠上廣泛分布[2]。梭梭也是中國荒漠半荒漠區(qū)固沙造林面積最大的建群樹種。具有耐旱、耐高溫、耐鹽堿、耐風(fēng)蝕等優(yōu)良品性[3]。在防沙固沙、減緩荒漠化、維護生態(tài)安全方面有著不可或缺的作用。

14-3-3蛋白是一類高度保守且功能多樣的調(diào)節(jié)蛋白，其在真核生物中普遍存在，分子量為28～33 ku[4]。該蛋白是由Moore等[5]1967年首次從牛腦組織中發(fā)現(xiàn)的一種酸性、可溶異源二聚體蛋白，根據(jù)該蛋白層析后分離組分的片段數(shù)和在淀粉凝膠電泳中的遷移率，命名為14-3-3蛋白。目前，已有20多種植物的14-3-3蛋白基因被克隆和鑒定，在番茄中已有12個14-3-3蛋白基因被發(fā)現(xiàn)，分別命名為 TFT1-TFT12[6]。余梅等[7]在茶樹中發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白基因，且該基因在花蕾發(fā)育晚期起到調(diào)控作用。趙秀玲等[8]通過RT-PCR技術(shù)，首次從菠菜中發(fā)現(xiàn)并克隆14-3-3蛋白基因，且命名為 So14-3-3，對該基因半定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硝酸鹽處理后， So14-3-3基因在根和葉的表達增強。研究表明，14-3-3蛋白可調(diào)控基因的表達、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的核定位和參與多種酶活性的調(diào)控，并且在細胞信號傳導(dǎo)、細胞周期調(diào)節(jié)、細胞凋亡、脅迫應(yīng)答等多種細胞活動中起到重要作用[9]。不同的14-3-3蛋白具有不同的組織特異性，調(diào)控植物的發(fā)育、應(yīng)答不同外界環(huán)境的刺激[10]。14-3-3蛋白參與的各種代謝調(diào)控、物質(zhì)運輸和植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)等調(diào)控，是通過與其他蛋白相互作用而進行的[11]。因此，研究14-3-3蛋白在植物中的功能和調(diào)控機理對理解植物響應(yīng)外界信號的分子機制十分重要。但有關(guān)梭梭14-3-3蛋白基因克隆和功能特征鮮見報道，本研究采用RT-PCR方法從梭梭的同化枝中提取并克隆14-3-3蛋白基因 HaFT-1和 HaFT-2，并且對這2個基因在梭梭的不同部位的表達以及在干旱脅迫下梭梭同化枝的表達進行分析，為研究14-3-3蛋白在梭梭抗逆分子機制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗材料 以新疆吐魯番荒漠植物園采集的梭梭種子為試驗材料。種子用蒸餾水浸泡5 min用φ=75%酒精消毒30 s后轉(zhuǎn)入蒸餾水中沖洗3遍，待酒精洗凈后用次氯酸鈉溶液浸泡10 min，再用蒸餾水沖洗4遍，接種于MS培養(yǎng)基中待發(fā)芽后培養(yǎng)至3周左右，取其同化枝，提取RNA用于基因克隆。

1.1.2 試劑 總RNA提取試劑盒(Trizol法)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA marker、dNTPs、Buffer(Mg2+)、Taq酶分別購自Life Technologies Corporation、北京全式金生物技術(shù)有限公司、北京天根生化科技有限公司和TakaRa公司。氨芐青霉素(Amp+)和卡那霉素(Kan+)由植物分子生物學(xué)研究室提供。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 HaFT-1和 HaFT-2的克隆 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄操作方法參照Trizol說明書和First Srtand cDNA Synthesis kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒相關(guān)內(nèi)容。

根據(jù)前期梭梭干旱轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果拼接得到的18個類似14-3-3蛋白基因相關(guān)序列，挑選2個拼接出全部讀碼框的Unigene，并進行同源序列比對有較高相似性，推測可能屬于14-3-3蛋白。根據(jù)這2個序列設(shè)計2對特異性引物(見表1) HaFT-1基因引物為編號1和2， HaFT-2基因引物為編號3和4。以梭梭cDNA為模版，進行PCR反應(yīng)。其反應(yīng)體系為Buffer(Mg2+) 2.5 μL、dNTPs 1.0 μL、上下游引物各1.0 μL、cDNA模板1.0 μL、Taq酶0.5 μL、最后加入ddH2O至總體積25 μL，擴增程序為94 ℃ 預(yù)擴增5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取擴增產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳檢測PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物與Peasy-T1載體(全式金公司)連接，轉(zhuǎn)入DH5α中，驗證其中陽性克隆，送上海生工測序。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequence of PCR

1.2.2 HaFT-1和 HaFT-2的序列分析 分別利用Protparam在線軟件、ProtScale的Hphob./Kyte &Doolittle算法、TMHMM Server v.2.0軟件及SOPMA在線軟件，對 HaFT-1、 HaFT-2蛋白的一級結(jié)構(gòu)、氨基酸組成、分子量等理化性質(zhì)，編碼的氨基酸序列疏水性/親水性，蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析。通過NCBI網(wǎng)站Blast對氨基酸序列的同源性進行搜索，并進行同源序列比對， MEGA 4.0軟件對其進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

1.2.3 HaFT-1和 HaFT-2在梭梭不同組織中的表達分析 取野生梭梭的根、同化枝、花和種子，每個組織取3個平行樣，于液氮中速凍，于-80 ℃保存。提取野生梭梭的根、同化枝、花和種子的RNA，反轉(zhuǎn)錄，以18S rRNA (GenBank登錄號：AJ577394)為內(nèi)參基因，進行RT-PCR反應(yīng)。 HaFT-1和 HaFT-2半定量RT-PCR反應(yīng)引物見表1中的5、6、7和8編號。其反應(yīng)體系為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 8 min，28個循環(huán)。

1.2.3 HaFT-1和 HaFT-2干旱脅迫后表達分析 實時熒光定量PCR試驗采用熒光染料 SYBR Green I[Roche FastStart Univorsal SYBR Green Master(ROX)]，選取18S rRNA基因作為內(nèi)參基因，檢測 HaFT-1和 HaFT-2這2個14-3-3蛋白基因在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達水平。以正常生長的1 a生梭梭同化枝(土壤含水量20%)作為對照，以土壤含水量在15%、12%、9%、6%及3%時的梭梭同化枝為干旱脅迫樣品，比較編碼 HaFT-1和 HaFT-2這2個14-3-3蛋白基因的表達差異。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因的CT值，并采用Livak等的2-△△CT法[12]，對 HaFT-1和 HaFT-2這2個14-3-3蛋白基因進行相對定量分析。 HaFT-1和 HaFT-2實時熒光定量反應(yīng)引物見表1中的11、12、13和14編號 。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)45次。生成熔解曲線步驟為95 ℃ 0 s，20 ℃/s；65 ℃ 15 s，20 ℃/s；95 ℃ 0 s，0.1 ℃/s，40 ℃保存。每次試驗的每個反應(yīng)樣品均設(shè)置3個技術(shù)性重復(fù)，按上述反應(yīng)程序在ABI 7500型實時熒光定量PCR儀上進行試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 HaFT-1和 HaFT-2基因的RT-PCR反應(yīng)及目的基因獲得

以梭梭cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，得到與目的片段大小相符的特異性條帶如圖1中1、2泳道所示，分別為 HaFT-1、 HaFT-2片段大小為856 bp和1 003 bp。送上海生工測序后，獲得 HaFT-1及 HaFT-2基因序列。GenBank登錄號分別是KU565486和KU565487。

2.2 梭梭 HaFT-1和 HaFT-2基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 序列特征分析 通過NCBI的ORF finder分析表明， HaFT-1和 HaFT-2 基因的ORF為795 bp和792 bp，編碼氨基酸個數(shù)分別為264和263，通過Blastp分析得知該基因編碼的蛋白質(zhì)均屬于14-3-3家族(如圖2)。

M.DL 2 000 Marker；1. HaFT-1PCR擴增產(chǎn)物 HaFT-1 PCR amplification products；2. HaFT-2 PCR擴增產(chǎn)物 HaFT-2 PCR amplification products

通過Protparam、ProtScale、TMHMM Server v.2.0軟件分別對 HaFT-1和 HaFT-2基因編碼的蛋白質(zhì)序列進行預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白的分子量分別為29 985.5、29 762.3，等電點為4.79、4.84，分子式分別為C1310H2068N358O429S9、C1304H2067N353O426S8。不穩(wěn)定系數(shù)為41.89、51.43，均為不穩(wěn)定蛋白。應(yīng)用SignalP 3.0對 HaFT-1和 HaFT-2基因編碼的蛋白序列進行信號肽預(yù)測，未發(fā)現(xiàn)信號肽。

2.2.2 梭梭 HaFT-1和 HaFT-2基因系統(tǒng)進化分析 將 HaFT-1和 HaFT-2基因序列在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行在線分析和 BLAST 比對，通過與NCBI數(shù)據(jù)庫其他物種 14-3-3蛋白基因的編碼區(qū)全序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，梭梭 HaFT-1與甜菜(Betavulgaris)有較高的同源性(92%)，其次與蠶豆(Viciafaba)的同源性達86%，與陸地棉(Gossypiumhirsutum)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、大戟屬(Euphorbia)的氨基酸的同源性分別達85%、84%、82%。 HaFT-2與冰菜(Mesembryanthemumcrystallinum)和甜菜(Betavulgaris)有較高的同源性，達92%。其次是木薯(Manihotesculentacrantz)，同源性達88%，與虎眼萬年青(Ornithogalumcaudatum)、大豆(Glycinemax)、鷹嘴豆(Cicerarietinum)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)同源性分別達87%、84%、84%、83%。

A.基因 HaFT-1的保守結(jié)構(gòu)域 Conserved domains of HaFT-1 gene;B.基因 HaFT-2的保守結(jié)構(gòu)域 Conserved domains of HaFT-2 gene

采用DNAMAN軟件對甜菜(Betavulgaris)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、大戟屬(Euphorbia)、毛果楊(Populustrichocarpa)、木薯(Manihotesculentacrantz)、冰菜(Mesembryanthemumcrystallinum)、虎眼萬年青(Ornithogalumcaudatum)的14-3-3蛋白與梭梭的14-3-3蛋白進行多重序列比對結(jié)果見圖3。 HaFT-1 和 HaFT-2基因氨基酸序列與其他物種14-3-3蛋白序列在5個區(qū)域高度保守(標紅線區(qū)域)。除保守區(qū)域外，氨基末端和羧基末端有明顯差異，相似結(jié)構(gòu)證明14-3-3蛋白在功能上具有保守性，但是局部的差異結(jié)構(gòu)表明可能存在功能上的差異。

使用MEGA 5.0中鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進化樹中物種及其登錄號見表2，由圖4可知，植物14-3-3蛋白共聚為兩大類，其中， HaFT-1與甜菜(XP_010689898)聚為一類，說明 HaFT-1與甜菜的親緣關(guān)系較近。 HaFT-2編碼的氨基酸序列與甜菜(XP_010692757)和冰菜(P93259)聚為一類。

2.3 HaFT-1和 HaFT-2組織特異性分析

用野生梭梭的根、同化枝、花和種子的cDNA為模板，進行RT-PCR半定量。結(jié)果顯示， HaFT-1和 HaFT-2在不同組織中的表達水平不相同，其中 HaFT-1在根和種子中有明顯的表達，在根中表達量比種子的表達量高，而 HaFT-2在梭梭的根和同化枝中有明顯的表達，在同化枝中表達高于根的表達量。

2.4 梭梭 HaFT-1和 HaFT-2干旱脅迫后表達分析

以18S rRNA基因為內(nèi)參基因，特異性引物進行熒光定量PCR分析 HaFT-1和 HaFT-2基因在PEG6000模擬干旱脅迫下的表達量，采用的是相對定量2- △△Ct法計算2個基因在鹽脅迫下的表達量(圖6)。結(jié)果顯示， HaFT-1在模擬干旱脅迫處理土壤含水量為12%時，表達量明顯升高。到處理后含水量為9%時，基因的表達量達到處理前的5.9倍， HaFT-1基因在處理后含水量6%恢復(fù)至處理前的水平，在含水量為3%時恢復(fù)至處理前的1.5倍。 HaFT-2在處理后含水量為12%時，表達量達到處理前的1.5倍，之后略有下降，并達到處理前表達量水平。說明 HaFT-1基因受到干旱脅迫誘導(dǎo)。 HaFT-2在模擬干旱脅迫前后基本沒有變化，因而 HaFT-2與抗旱性關(guān)系不明顯。

圖3 HaFT-1和 HaFT-2氨基酸序列比對Fig.3 HaFT-1 and HaFT-2 amino acid sequence alignments

表2 相關(guān)物種 14-3-3蛋白基因及其登錄號Table 2 14-3-3 gene related species and their GenBank accession numbers

圖4 不同植物14-3-3蛋白( HaFT-1和 HaFT-2)序列系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogentic tree of 14-3-3 ( HaFT-1， HaFT-2) sequence based on different plant species

A.梭梭的根 Roots of Haloxylon ammodendron；B.梭梭的同化枝 Assimilation sticks of Haloxylon ammodendron；C.梭梭的種子 Seeds of Haloxylon ammodendron；D.梭梭的花 Flowers of Haloxylon ammodendron

3 討論與結(jié)論

14-3-3蛋白具有組織特異性，在調(diào)控植物的發(fā)育表達和應(yīng)答外界環(huán)境刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中處于中心地位[10]，在逆境生理反應(yīng)中起到重要作用[5]。目前，擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有13個成員[13]、煙草(Nicotianatabacum)中有11個成員[14]、大豆(Glycinemax)中有16個成員[15]、水稻(Oryzasativa)中有8個成員被成功鑒定[16]。本研究以梭梭為研究材料，通過RT-PCR方法從中克隆出2個與逆境相關(guān)的14-3-3蛋白基因，分別命名為 HaFT-1和 HaFT-2，并對其進行生物信息學(xué)分析。這2個14-3-3蛋白基因ORF大小為795 bp和792 bp，編碼的氨基酸個數(shù)分別為264和263。同時，分別對基因 HaFT-1和 HaFT-2編碼的氨基酸序列進行分析和預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個蛋白的理化性質(zhì)相似，二級結(jié)構(gòu)均是α螺旋所占比例最大，并且都是親水性、不穩(wěn)定蛋白，不具有跨膜結(jié)構(gòu)。氨基酸序列同源性比對發(fā)現(xiàn)，2個14-3-3蛋白均與甜菜同源性最高，均為92%。各個物種的14-3-3蛋白在保守區(qū)域外，氨基酸序列差異相對較大。分子進化樹顯示， HaFT-1與甜菜聚為一枝； HaFT-2與甜菜、冰菜聚為一枝，二者親緣關(guān)系最近。

圖6 梭梭14-3-3蛋白基因在干旱脅迫下的表達Fig.6 Expression patterns of Haloxylon ammodendron 14-3-3 protein gene under condition of drought stress

對14-3-3蛋白相關(guān)特異性表達研究表明，茶樹14-3-3蛋白基因在其他組織不表達，僅在晚期花蕾中特異性表達[7]。甘蔗14-3-3蛋白基因有較高并且較豐富的表達信號在其根、莖、葉中，其中葉具有最少含量，莖具有顯著上調(diào)的表達活性[4]。研究短柄草14-3-3基因家族表達模式發(fā)現(xiàn)，短柄草的7個14-3-3蛋白基因在根、莖、未成熟葉、成熟葉和葉鞘等組織中均有表達，暗示這7個14-3-3蛋白基因可能是組成型表達基因[17]。本研究明確14-3-3蛋白基因在梭梭根、同化枝、花和種子中的表達均不相同，其中基因 HaFT-1在根及種子中表達，在根中表達量比種子的表達量高，基因 HaFT-2在同化枝和根中表達明顯，在同化枝中表達高于根的表達量。綜合2個14-3-3蛋白基因在不同組織中的表達情況，可以看出，2個基因在花中的表達量均不明顯。梭梭14-3-3蛋白基因在不同組織中的表達說明其與不同組織的功能有密切關(guān)系，且表達具有特異性。

研究杉木14-3-3蛋白基因發(fā)現(xiàn)，杉木14-3-3蛋白基因可能參與杉木應(yīng)答干旱逆境反應(yīng)[18]。部分研究者通過研究14-3-3蛋白與質(zhì)膜H+-ATP酶的互作來探討14-3-3蛋白應(yīng)答干旱脅迫的分子機理[19-20]。梭梭是旱生植物中的典型代表，為深入研究梭梭14-3-3蛋白抵御干旱逆境的機理，利用熒光定量qRT-PCR方法探究 HaFT-1和 HaFT-2在干旱脅迫下的表達情況。在干旱脅迫下， HaFT-1和 HaFT-2表達量均有所上升，但變化趨勢卻有著明顯的不同。 HaFT-1在模擬干旱脅迫處理土壤含水量為12%時，表達量明顯升高，到處理后含水量為9%時，基因的表達量達到處理前的5.9倍， HaFT-1基因在處理后含水量6%恢復(fù)至處理前的水平，在含水量為3%時恢復(fù)至處理前的1.5倍。 HaFT-2在處理后含水量為12%時，表達量達到處理前的1.5倍，之后略有下降，并達到處理前表達量水平。說明 HaFT-1基因受到干旱脅迫誘導(dǎo)。 HaFT-2在模擬干旱脅迫前后基本沒有變化，因而 HaFT-2與抗旱性關(guān)系不明顯。這表示 HaFT-1和 HaFT-2 這2個基因?qū)?yīng)答干旱脅迫表現(xiàn)出不同的調(diào)控機制。目前，對于梭梭14-3-3蛋白的遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不清楚，有待于以后進一步深入研究。

Reference：

[1] 王成云.梭梭屬植物對大氣干旱的季節(jié)性生理生化響應(yīng)[D].烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

WANG CH Y,Seasonal physiological and biochemical response ofHaloxylonBunge to atmosphere drought[D].Urumqi: Xinjiang Agricultural University,2006(in Chinese with English abstract).

[2] 郭泉水,郭志華,閻 洪,等.我國以梭梭屬植物為優(yōu)勢的潛在荒漠植被分布[J].生態(tài)學(xué)報,2005,25(4):848-853.

GUO Q SH,GUO ZH H,YAN H,etal.Study on potential distribution ofHaloxylonplants dominated desert vegetation in China[J].ActaEcologicaSinica,2005,25(4):848-853(in Chinese with English abstract).

[3] 董占元,姚云峰,趙金仁,等.梭梭光合枝細胞組織學(xué)觀察及其抗逆性特征[J].干旱區(qū)資源與環(huán)境,2000,14(5):78-83.

DONG ZH Y,YAO Y F,ZHAO J R,etal.Anatomical observations on the plotosynthatic branch ofHaloxylonammodendrom(C.A.Mey) Bunge and it is the character of drought and salt resistance[J].JournalofAridLandResourcesandEnvironment,2000,14(5):78-83(in Chinese with English abstract).

[4] 羅煉芳,孔 冉,蘇俊波.甘蔗14-3-3基因克隆及表達分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2013,44(11):1757-1764.

LUO L F,KONG R,SU J B.Cloning and expression analysis of 14-3-3 gene fromSaccharumspp.Hybrids[J].JournalofSouthernAgriculture,2013,44(11):1757-1764(in Chinese with English abstract).

[5] MOORE B W,PEREZ V J.Specific acidic proteins of the nervous system[J].InPhysiologicalandBiochemicalAspectsofNervousIntegration,1967:343-359.

[6] XU W,SHI W.Expression profiling of the 14-3-3 gene family in response to salt stress and potassium and iron deficiencies in young tomato (Solanumlycopersicum) roots:analysis by real-time RT-PCR[J].AnnalsofBotany,2006,98(5):965-974.

[7] 余 梅,江昌俊,房婉萍,等.茶樹花蕾14-3-3蛋白基因的分子克隆及差異表達分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,41(10):2983-2991.

YU M,JIANG CH J,FANG W P,etal.Cloning and analysis of differential expression of a 14-3-3 protein gene from tea flower bud[J].ScientiaAgriculturaSinica,2008,41(10):2983-2991(in Chinese with English abstract).

[8] 趙秀玲,徐慧妮,郭傳龍,等.菠菜14-3-3蛋白基因的克隆及硝酸鹽脅迫下的表達分析[J].西北植物學(xué)報,2013,33(3):450-457.

ZHAO X L,XU H N,GUO CH L,etal.Cloning and expression analysis of 14-3-3 protein gene ofSpinachunder nitrate stress[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2013,33(3):450-457(in Chinese with English abstract).

[9] 周 穎,李冰櫻,李學(xué)寶.14-3-3蛋白對植物發(fā)育的調(diào)節(jié)作用[J].植物學(xué)報,2012,47(1):55-64.

ZHOU Y,LI B Y,LI X B.Roles of 14-3-3 proteins in regulating plant development[J].ChineseBulletinofBotany,2012,47(1):55-64(in Chinese with English abstract).

[10] OKSVOLD M P,HUITFELDT H S,LANGDON W Y.Identification of 14-3-3 zeta as an EGF receptor interacting protein[J].FebsLetters,2004,569 (1-3):207-210.

[11] 崔 娜,于志海,韓明利,等.植物14-3-3蛋白研究進展[J].西北植物學(xué)報,2012,32 (4):843-845.

CUI N,YU ZH H,HAN M L,etal.Research advancement of 14-3-3 proteins in plant[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2012,32(4):843-845(in Chinese with English abstract).

[12] LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C(T)) method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[13] ROSENQUIST M,ALSTERFJORD M,LARSSON C,etal.Data mining theArabidopsisgenome reveals fifteen 14-3-3 genes.Expression is demonstrated for two out of five novel genes[J].PlantPhysiology,2001,127(1):142-149.

[14] COTELLE V,MEEK S E,PROVAN F,etal.14-3-3s regulate global cleavage of their diverse binding partners in sugar-starvedArabidopsiscells[J].EmboJournal,2001,19(12):2869-2876.

[15] LI X,DHAUBHADEL S.Soybean 14-3-3 gene family:identification and molecular characterization[J].Planta,2010,233(3):569-582.

[16] WANG C,MA Q H,LIN Z B,etal.Cloning and characterization of a cDNA encoding 14-3-3 protein with leaf and stem-specific expression from wheat[J].DnaSequencetheJournalofDnaSequencing&Mapping,2008,19(2):130-136.

[17] 唐振鑫,楊海靈.短柄草14-3-3基因家族的生物信息學(xué)及表達模式研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2013(7):139-142.

TANG ZH X,YANG H L.Bioinformatic and expression pattern analysis ofBrachypodium14-3-3 gene family[J].GuangdongAgriculturalSciences,2013(7):139-142(in Chinese with English abstract).

[18] 倪點樂.杉木14-3-3蛋白基因的克隆和表達分析[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2013.

NI D L.Cloing and expression analysis of 14-3-3 protein genes inCunninghamialanceolate(Lamb.) Hook[D].Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University,2013(in Chinese with English abstract).

[19] 周 冰.蠶豆14-3-3蛋白與質(zhì)膜H+-ATP酶應(yīng)答干旱脅迫的分子機理研究[D].昆明:昆明理工大學(xué),2013.

ZHOU B.Molecular mechanisms of response to drought stress for broad bean 14-3-3 proteins and plasma membrane H+-ATPase[D].Kunming: Kunming University of Science and Technology,2013(in Chinese with English abstract).

[20] 李 松.玉米14-3-3蛋白和質(zhì)膜H+-ATP酶應(yīng)答干旱脅迫的分子機制研究[D].昆明:昆明理工大學(xué),2013.

LI S.Molecular mechanisms of 14-3-3 proteins and plasma membrane H+-ATPase enzyme of maize response to drought stress[D].Kunming: Kunming University of Science and Technology,2013(in Chinese with English abstract).

(責任編輯：史亞歌 Responsible editor:SHI Yage)

Cloning and Expression Analysis of HaFT-1 and HaFT-2 Genes inHaloxylonammodendron

LI Yajie1,ZHANG Hua1,JIANG Yuanyuan2,MA Hao3,4,YAO Zhengpei1,REN Yanping1,WANG Ze4and MA Lin1

(1.College of Agronomy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China; 2.Hami Vocational Technical College,Hami Xinjiang 839000,China; 3.College of Agronomy,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China; 4.Desert Institute in Drought Areas,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China )

Based on Unigene sequences fromHaloxylonammodendronarid transcriptome database,twoHaloxylonammodendrongenes HaFT-1 and HaFT-2 of 14-3-3 protein were successfully cloned,and it was analyzed and gene was expressed.The results showed that the HaFT-1 gene expression was both in roots and seeds ofHaloxylonammodendron,and showed the strongest expression in root;the HaFT-2 gene showed the highest expression in assimilation sticks ofH.ammodendron,and then in the roots.After drought stress,HaloxylonHaFT-1 and HaFT-2 gene expressions were adjusted downward.This study preliminarily analyzed the expression pattern of HaFT-2 and HaFT-1 gene,and laid foundation for further research on function of this gene.

Haloxylonammodendron；14-3-3 protein；Gene clone；Expression

LI Yajie,female,master student.Research area:resistance of plant breeding.E-mail:631680263@qq.com

MA Lin,male,professor.Research area:agriculture in arid areas and conservation tillage.E-mail: malin5738@126.com

日期：2017-03-03

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0833.050.html

2016-03-02

2016-03-31

國家自然科學(xué)基金(31260181)。

李亞婕，女，碩士生，研究方向為抗逆植物育種學(xué)。E-mail：631680263@qq.com

馬 林，男，教授，研究方向為干旱區(qū)農(nóng)業(yè)和保護性耕作。E-mail:malin5738@126.com

Q943.2

A

1004-1389(2017)03-0455-08

Received 2016-03-02 Returned 2016-03-31

Foundation item The National Natural Science Foundation of China (No.31260181).