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    黃連解毒湯提取物對(duì)原代神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注損傷后5-脂氧酶活性的影響*

    2017-03-29 07:54:00黃竹燕葉夷露劉丹丹潘蓓蓓俞月萍
    浙江中醫(yī)雜志 2017年3期
    關(guān)鍵詞:指標(biāo)性原代黃芩

    徐 靜 黃竹燕 葉夷露 劉丹丹 潘蓓蓓 俞月萍 張 琦#

    1 溫州醫(yī)科大學(xué) 浙江 溫州 325035

    2 杭州醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

    3 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310009

    黃連解毒湯提取物對(duì)原代神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注損傷后5-脂氧酶活性的影響*

    徐 靜1,2黃竹燕3葉夷露2劉丹丹2潘蓓蓓3俞月萍2張 琦1,2#

    1 溫州醫(yī)科大學(xué) 浙江 溫州 325035

    2 杭州醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

    3 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310009

    黃連解毒湯 原代神經(jīng)元氧糖剝奪 再灌注損傷 5-脂氧酶 半胱氨酰白三烯 大鼠

    腦缺血是嚴(yán)重危害人類健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。5-脂氧酶(5-LOX)是催化花生四烯酸生成白三烯(LTs)的關(guān)鍵酶。大量研究證實(shí),5-LOX及其代謝產(chǎn)物半胱氨酰白三烯(CysLTs)介導(dǎo)腦缺血后炎癥反應(yīng),5-LOX抑制劑和CysLTs受體拮抗劑對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用[1-2],表明5-LOX/CysLTs通路參與腦缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程。

    黃連解毒湯(HJD)是清熱解毒的經(jīng)典方劑。國(guó)內(nèi)外研究表明HJD傳統(tǒng)水煎劑對(duì)體內(nèi)、外腦缺血損傷均具有保護(hù)作用[3]。本研究采用大孔樹(shù)脂吸附法分離制備獲得50%乙醇提取物HJDEE50,觀察HJDEE50對(duì)大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元糖氧剝奪(OGD)再灌注損傷的保護(hù)作用及對(duì)5-LOX活性的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)新生SD大鼠(24h內(nèi))由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)2012-0002]。

    1.2 主要試劑與儀器:梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;漢黃芩素、漢黃芩苷和黃芩素對(duì)照品購(gòu)自上海澤衡生物技術(shù)有限公司。連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)和四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自Sigma公司;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;兔抗多克隆5-LOX抗體購(gòu)自Santa cruz公司;CysLTs酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cayman公司。高效液相色譜儀(Lumtech K501雙泵,德國(guó)),紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器(Lumtech K2501,德國(guó)),CO2培養(yǎng)箱(HF151,香港力康),酶標(biāo)儀(Mul tiskan MK3,美國(guó)),流式細(xì)胞檢測(cè)儀(Beckman,美國(guó))。

    1.3 藥物制備和含量測(cè)定:黃連、黃芩、黃柏、梔子由華東醫(yī)藥股份有限公司提供并經(jīng)鑒定,按3∶3∶2∶3的比例組方,蒸餾水浸泡2h,分別用水、50%乙醇、80%乙醇煎制,過(guò)濾后合并濾液,減壓濃縮至生藥含量為1.0g/ml的HJD浸膏。浸膏稀釋1倍后上D101型大孔樹(shù)脂柱,50%乙醇洗脫,洗脫液減壓濃縮干燥得到HJDEE50。采用本實(shí)驗(yàn)室建立的RP-HPLC法,測(cè)定HJDEE50中7個(gè)指標(biāo)性成分的含量[4]。

    1.4 原代皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng):新生24h內(nèi)SD大鼠,分離剪碎大腦皮質(zhì),0.027%胰蛋白酶液37℃消化20min,含血清培養(yǎng)液終止消化,吹打后過(guò)200目篩網(wǎng)。離心后用種植液(DMEM-HG+10%FBS+10%HS)重懸,以1×106個(gè)/ml接種于96孔板內(nèi)。24h后換維持培養(yǎng)液(NB+2%B-27+1% L-Glutamine),第3d加入5μg/ml阿糖胞苷。每隔2~3d換液,培養(yǎng)至7~9d后隨機(jī)分組實(shí)驗(yàn)。

    1.5 原代皮質(zhì)神經(jīng)元OGD模型制備和實(shí)驗(yàn)分組:正常對(duì)照組用DMEM-HG孵育。OGD模型組神經(jīng)元用無(wú)糖DMEMHG+10mmol/L Na2S2O4孵育20min后,換正常培養(yǎng)液再灌注 1h。齊留通組(10μmol/L)、HJD組(10mg/L)和HJDEE50組(1、10和100mg/L)分別于神經(jīng)元OGD損傷前30min開(kāi)始孵育,并維持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

    1.6 細(xì)胞存活率檢測(cè):棄去孔板中培養(yǎng)液,加入終濃度為0.5mg/ml的MTT溶液,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后棄上液,每孔加入150μl DMSO振蕩10min。在490nm處測(cè)定吸光度(OD值),細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(正常對(duì)照組OD值-空白組OD值)× 100%。篩選出HJDEE50作用的最佳劑量。

    1.7 流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù):細(xì)胞消化5min后,吹打細(xì)胞,收集細(xì)胞懸液,離心10min(1000rpm),棄上清,加0.5ml結(jié)合緩沖液重懸后,加入10μl PI與5μl Annexin VFITC,室溫下避光孵育5~10min,之后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

    1.8 免疫細(xì)胞化學(xué)法:準(zhǔn)備好細(xì)胞爬片。采用兔抗5-LOX多克隆抗體(1∶50)和兔IgG-兩步法免疫組化試劑盒(即用型),按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,DAB顯色,乙醇梯度脫水,中性樹(shù)脂和二甲苯(1∶1)封片。

    1.9 酶聯(lián)免疫吸附法:各組參照1.5中的方法進(jìn)行OGD建模。結(jié)束后,培養(yǎng)基中取細(xì)胞樣本200μl,離心后取上清備用。根據(jù)酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟,測(cè)定CysLTs的含量。

    1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,以單因素方差分析進(jìn)行多組間差異的比較,以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 HJDEE50中指標(biāo)性成分的含量:RP-HPLC結(jié)果顯示,在本色譜條件下7種標(biāo)準(zhǔn)品能達(dá)到較好分離。HJD主要含有7種指標(biāo)性成分,含量分別為:梔子苷(1.46±0.02)%、黃芩苷(5.57±0.05)%、巴馬?。?.80±0.01)%、小檗堿(5.18± 0.04)%、漢黃芩苷(0.98±0.01)%、黃芩素(1.36±0.02)%、漢黃芩素(0.45±0.02)%,總含量為15.8%。HJDEE50主要含有4種指標(biāo)性成分,其含量分別為:黃芩苷(23.99± 0.38)%、小檗堿(22.13±0.37)%、漢黃芩苷(5.19± 0.03)%、巴馬?。?.93±0.00)%,總含量為55.24%。

    2.2 HJDEE50對(duì)原代神經(jīng)元OGD再灌注損傷后存活率的影響:MTT法結(jié)果表明,OGD再灌注損傷使神經(jīng)元存活率顯著降低。與模型組比較,HJDEE50(1、10、100mg/L)均可提高神經(jīng)元存活率(P<0.05或P<0.01),有效劑量范圍較廣,最佳有效劑量為1mg/L,后續(xù)實(shí)驗(yàn)將采用該劑量。與HJD(10mg/L)相比,HJDEE50(1mg/L)顯著提高神經(jīng)元存活率(P<0.01)。詳見(jiàn)表1。

    表1 HJDEE50對(duì)神經(jīng)元存活率的影響(±s)

    表1 HJDEE50對(duì)神經(jīng)元存活率的影響(±s)

    注:與正常對(duì)照組比較,**P<0.01;與OGD模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與HJD組比較,△△P<0.01。

    分組正常對(duì)照組OGD模型組HJD HJDEE50藥物濃度(mg/L)--1 011 0 100神經(jīng)元存活率(%)100.00±0.00 64.80±5.53**72.41±2.51##80.73±5.00##△△75.29±8.50#73.11±2.06##

    2.3 HJDEE50對(duì)神經(jīng)元凋亡情況的影響:正常對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)量約為95%;OGD模型組早期與中晚期凋亡細(xì)胞數(shù)量均顯著增加,活細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.01)。與模型組比較,HJDEE50(1mg/L)組早期和中晚期凋亡細(xì)胞均顯著減少(P<0.01)。與HJD相比,HJDEE50對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用稍弱(P<0.01)。詳見(jiàn)圖1。

    圖1 HJDEE50對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響

    2.4 HJDEE50對(duì)原代神經(jīng)元OGD再灌注損傷后5-LOX分布的影響:正常對(duì)照組原代皮質(zhì)神經(jīng)元處于靜息狀態(tài)時(shí),5-LOX均勻分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)與突起上。OGD模型組約30%神經(jīng)元中的5-LOX轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核膜上,核染色加深,胞漿中有顆粒聚集。與模型組比較,HJDEE50組顯著抑制了5-LOX核膜轉(zhuǎn)移,使核膜轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)目下降約17%,胞漿中顆粒減少(P<0.01)。但與HJD組相比,無(wú)顯著性差異(P>0.05)。詳見(jiàn)圖2。

    圖2 HJDEE50對(duì)5-LOX核膜轉(zhuǎn)移的影響

    2.5 HJDEE50對(duì)原代神經(jīng)元OGD再灌注損傷后CysLTs含量的影響:正常對(duì)照組CysLTs含量為423.1± 9.15pg/ml,OGD模型組CysLTs含量顯著增加,達(dá)531.7±21.71pg/ml(P<0.01)。與模型組比較,齊留通組、HJD組和HJDEE50組均顯著減少,CysLTs含量分別降至455.7±22.31pg/ml、444.0±17.47pg/ml和464.2± 44.67pg/ml(P<0.05或P<0.01)。與HJD組比較,HJDEE50組CysLTs含量無(wú)顯著差異。詳見(jiàn)圖3。

    圖3 HJDEE50對(duì)CysLTs含量的影響

    3 討論

    本研究發(fā)現(xiàn),HJDEE50中指標(biāo)性成分含量顯著高于HJD,可顯著提高OGD再灌注損傷后神經(jīng)元存活率、抑制神經(jīng)元凋亡。其作用機(jī)制可能與抑制神經(jīng)元5-LOX核膜轉(zhuǎn)移、減少花生四烯酸代謝產(chǎn)物CysLTs含量,從而減輕炎癥反應(yīng)相關(guān)。

    5-LOX/CysLTs通路介導(dǎo)腦缺血損傷。Ciceri等[5]發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血后,大鼠腦內(nèi)CysLTs顯著增加。通過(guò)檢查腦缺血死亡病人的腦組織,發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)5-LOX表達(dá)增加,并被激活[6]。靜息狀態(tài)時(shí),5-LOX主要分布在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)被激活時(shí)5-LOX向核膜移位,代謝產(chǎn)物白三烯釋放增加。因此,5-LOX發(fā)生核膜轉(zhuǎn)移是其被激活的表現(xiàn)方式,并常作為藥物抗炎作用的靶點(diǎn)[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),原代皮質(zhì)神經(jīng)元OGD再灌注損傷后,約30%神經(jīng)元的5-LOX發(fā)生了核膜移位,CysLTs釋放增加,同時(shí)神經(jīng)元活性下降,凋亡細(xì)胞增多。HJD和HJDEE50顯著抑制神經(jīng)元5-LOX核膜移位和CysLTs釋放,增加神經(jīng)元活性,減少神經(jīng)元凋亡。上述結(jié)果提示,HJD和HJDEE50可能通過(guò)抑制5-LOX激活發(fā)揮抗神經(jīng)元OGD損傷作用。

    RP-HPLC結(jié)果顯示,HJD含有7種指標(biāo)性成分,HJDEE50僅含有4種,缺少梔子苷、黃芩素和漢黃芩素,這可能與各成分在不同溶劑中的溶解度不同有關(guān)。但就指標(biāo)性成分的含量而言,HJDEE50中4種成分總含量達(dá)到55.24%,顯著高于HJD中的7種成分的總含量,表明HJDEE50具有開(kāi)發(fā)新藥的潛力。因此,研究HJDEE50對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元OGD再灌注損傷的作用,對(duì)于HJD經(jīng)典方的二次開(kāi)發(fā)工作具有重要意義。

    研究發(fā)現(xiàn),黃連解毒湯全方對(duì)缺血性腦損傷作用的強(qiáng)弱與方中主要指標(biāo)性成分小檗堿、黃芩苷、梔子苷的含量相關(guān)[8]。HJD和HJDEE50抑制神經(jīng)元OGD損傷后5-LOX激活可能與指標(biāo)性成分的作用有關(guān)。已有研究表明,黃芩苷可抑制5-LOX核膜移位、減少炎癥產(chǎn)物CysLTs生成,發(fā)揮抗腦缺血作用[9-10]。然而,HJDEE50抑制5-LOX核膜移位的具體成分和作用機(jī)制尚不清楚,需要后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

    總之,本研究結(jié)果表明HJDEE50對(duì)大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元OGD再灌注損傷具有較好的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與5-LOX/CysLTs通路有關(guān)。

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    2016-11-18

    浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目黃連解毒湯活性部位對(duì)體內(nèi)外神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,編號(hào):2012ZA025

    # 通訊作者:張 琦,E-mail:zhangqiwzh@163.com

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