流行性造血器官壞死病病毒抗原捕獲ELISA建立

劉寧，高志強(qiáng)，谷強(qiáng)，張旻，景宏麗，江育林，張利峰，劉金華

(1．中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193;2．北京市東城區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，北京東城100027;3．北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京朝陽(yáng)100026; 4．中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所，北京朝陽(yáng)100029)

流行性造血器官壞死病病毒抗原捕獲ELISA建立

劉寧1，2，高志強(qiáng)3，谷強(qiáng)3，張旻4，景宏麗4，江育林4，張利峰3，劉金華1

(1．中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193;2．北京市東城區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，北京東城100027;3．北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京朝陽(yáng)100026; 4．中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所，北京朝陽(yáng)100029)

使用差速離心濃縮的病毒免疫山羊，獲得高免血清并提取IgG，即為抗流行性造血器官壞死病病毒(EHNV)多克隆抗體。利用純化的EHNV免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)有限稀釋法亞克隆，獲得雜交瘤細(xì)胞株。將雜交瘤接種小鼠誘生腹水獲得單抗3A4。以抗EHNV多克隆抗體為捕獲抗體，單抗3A4為檢測(cè)抗體，使用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為酶標(biāo)二抗，建立了EHNV的抗原捕獲ELISA方法。該方法可檢出103TCID50的病毒液上清和0.0056!g的MCP重組蛋白。對(duì)純化的GCRV、IHNV、IPNV、VHSV及SVCV病毒液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。本研究建立的EHNV抗原捕獲ELISA方法，具有敏感、特異和重復(fù)性好的特點(diǎn)。通過(guò)應(yīng)用于人工感染樣品和臨床樣品的檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了本檢測(cè)方法的實(shí)用性。

流行性造血器官壞死病;抗原捕獲ELISA

流行性造血器官壞死病是我國(guó)二類(lèi)動(dòng)物疫病，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定必須申報(bào)的疫病。該病主要流行于歐洲和澳大利亞，由流行性造血器官壞死病毒(EHNV)引起的有鰭魚(yú)類(lèi)的系統(tǒng)性臨床或亞臨床感染，主要感染河鱸、虹鱒、歐鲇和鮰，能夠引起這些魚(yú)類(lèi)出現(xiàn)內(nèi)臟壞死乃至死亡［1－2］。

隨著進(jìn)出口貿(mào)易增多，EHNV傳入風(fēng)險(xiǎn)增加［3］。尤其是EHNV對(duì)一般消毒劑具有一定耐受性［4］，可在環(huán)境中長(zhǎng)期存在，且對(duì)此病毒的傳播規(guī)律不完全掌握，這些因素增加了本病的防控難度［5］。迄今為止，國(guó)內(nèi)有關(guān)本病抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法的研究很少。研制用于EHNV檢測(cè)的抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法作為技術(shù)儲(chǔ)備具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒EHNV，草魚(yú)呼腸孤病病毒(GCRV)、流行性造血器官壞死病病毒(EHNV)、傳染性胰腺壞死病病毒(IPNV)、病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)、本實(shí)驗(yàn)室保存。

1．2 主要試劑EHNV重組MCP，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1．3 主要儀器AB7900，AB公司;酶標(biāo)儀，賽默飛公司。

1．4 動(dòng)物BALB/c小鼠，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1．5 EHNV病毒增殖與純化將EHNV接種于單層的EPC細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)繁，用差速離心方法純化和濃縮病毒。每200 mL病毒液濃縮到1 mL。

1．6 EHNV多克隆抗體的制備選擇成年雄性山羊，用純化的EHNV乳化好后作為抗原，使用FCA乳化的抗原頸部和背部皮下多點(diǎn)注射免疫山羊。前3次免疫間隔7 d，4～6次免疫間隔14 d，每次接種1 mL。第6次免疫接種后，收集血清。用飽和硫酸銨鹽析方法粗提IgG。

1．7 EHNV單抗的制備按照常規(guī)方法用濃縮的EHNV抗原與弗氏佐劑乳化后免疫小鼠，取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，經(jīng)多輪篩選和亞克隆獲得陽(yáng)性雜交瘤，將雜交瘤接種小鼠腹腔誘生腹水，獲得單克隆抗體。

1．8 抗原捕獲ELISA方法的建立本研究采用羊抗EHNV IgG作為捕獲抗體，單抗3A4作為檢測(cè)抗體。固定抗原量104TCID50/0.05mL。建立抗原捕獲ELISA方法。

1．9 判定標(biāo)準(zhǔn)確定用建立的ELISA對(duì)經(jīng)熒光PCR檢測(cè)EHNV陰性的魚(yú)臟器研磨液上清30份檢測(cè)，將測(cè)定平均值+3×標(biāo)準(zhǔn)差作為臨界值。

1.10 特異性阻斷試驗(yàn)將104TCID50/0.05 mL病毒液50 μL和陰性對(duì)照分別與1∶2稀釋后山羊抗EHNV陽(yáng)性血清和1∶2稀釋EHNV陰性山羊血清等量混合，4℃過(guò)夜，12 000 r/min離心30 min，取上清進(jìn)行ELISA測(cè)定，根據(jù)阻斷前后樣品的OD值及P/ N值變化觀察本方法的特異性。

1.11 靈敏度測(cè)定對(duì)105TCID50～10TCID50的病毒液，進(jìn)行抗原捕獲ELISA測(cè)定，確定檢測(cè)極限，同時(shí)對(duì)105TCID50～100.1TCID50病毒液進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，比較靈敏度差異。此外，對(duì)5．6 μg/50 μL～0.00056 μg/50 μL的重組MCP抗原進(jìn)行ELISA測(cè)定。

1.12 特異性試驗(yàn)對(duì)經(jīng)差速離心純化的GCRV、IHNV、IPNV、VHSV及SVCV抗原應(yīng)用建立的抗原捕獲ELISA方法進(jìn)行測(cè)定。

1.13 重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定方法的板內(nèi)和板間重復(fù)性。

1.14 對(duì)人工感染虹鱒魚(yú)臟器的檢測(cè)結(jié)果對(duì)保存的EHNV感染虹鱒魚(yú)的肝、脾、腦、腎和腸道組織10倍懸液應(yīng)用建立的ELISA進(jìn)行檢測(cè)，并與熒光PCR方法進(jìn)行比較。

1.15 EHNV對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果用建立的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室收集的監(jiān)測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，這些監(jiān)測(cè)樣品包括臟器懸液280份，魚(yú)卵98份，并與熒光PCR方法進(jìn)行了比較。

2 結(jié)果

2.1 病毒增殖結(jié)果病毒接種EPC細(xì)胞24 h開(kāi)始出現(xiàn)CPE，細(xì)胞出現(xiàn)固縮和聚集現(xiàn)象。96 h可見(jiàn)細(xì)胞固縮并大量聚集，拉網(wǎng)和折光性改變，大量細(xì)胞崩解，從細(xì)胞瓶上脫落(見(jiàn)后插彩版圖1)。

2．2 羊抗EHNV IgG和腹水單抗ELISA效價(jià)的測(cè)定對(duì)制備的抗血清進(jìn)行ELISA測(cè)定。羊抗EHNV IgG ELISA效價(jià)為1∶2×104。腹水單抗3A4的效價(jià)為1∶6.4×105。

2．3 抗原捕獲ELISA方法的建立和優(yōu)化用羊抗EHNV IgG作捕獲抗體，單抗3A4作檢測(cè)抗體建立了檢測(cè)EHNV的抗原捕獲ELISA方法。結(jié)果顯示，IgG最佳的包被濃度為1∶800，檢測(cè)單抗最佳稀釋度為1∶6 000。酶標(biāo)抗體最佳使用濃度為1∶2×104。

2．4 臨界值確定結(jié)果顯示，OD450nm平均值為0.214，標(biāo)準(zhǔn)差為0.053。臨界值確定為0.4。

2．5 特異性阻斷試驗(yàn)結(jié)果顯示，陽(yáng)性血清處理組，OD450nm值為0.334小于0.4，呈陰性;對(duì)照組的陽(yáng)性抗原經(jīng)陰性血清處理后，OD450nm值為0.986，仍為陽(yáng)性結(jié)果，證明處理后阻斷作用明顯。

2．6 靈敏度測(cè)定結(jié)果顯示，檢測(cè)病毒液靈敏度為103TCID50/0.05 mL。檢測(cè)重組蛋白抗原靈敏度為0.0056 μg，見(jiàn)表1。熒光PCR檢測(cè)靈敏度為1 TCID50/0.05 mL(見(jiàn)后插彩版圖2)，高于抗原捕獲ELISA方法，與預(yù)期一致。

2．7 特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，建立的方法與其他病毒抗原無(wú)交叉反應(yīng)。

2．8 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，板內(nèi)變異系數(shù)最大為4．30%。板間變異系數(shù)最大為9．87%。

2．9 人工感染樣品的檢測(cè)結(jié)果結(jié)果顯示，肝、脾、腦、腎和腸道均能檢出病毒抗原和核酸，且OD450nm值與Ct值呈負(fù)相關(guān)，即抗原捕獲ELISA的P/N值越大，熒光PCR的Ct值越小。其中脾臟和腎臟含毒量最高，肝臟和腸道組織次之，腦組織含毒量較低(見(jiàn)后插彩版圖3)。

表1 靈敏度測(cè)定結(jié)果

2.10 EHNV對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果結(jié)果顯示，378份臨床樣品經(jīng)建立的抗原捕獲ELISA和熒光PCR檢測(cè)結(jié)果一致，均為陰性。

3 討論

在10多年里，國(guó)內(nèi)外學(xué)者建立了許多EHNV的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，分為病毒檢測(cè)與核酸檢測(cè)兩大類(lèi)。病毒分離是診斷該病最為確切的方法，這種方法診斷本病需要很長(zhǎng)的時(shí)間和繁重的人工，且不能保證成功分離到病毒。PCR技術(shù)是近年來(lái)建立起來(lái)的檢測(cè)EHNV核酸的方法，但受人員技術(shù)、儀器、環(huán)境等限制，使PCR技術(shù)在基層推廣困難。

ELISA具有特異、靈敏、重復(fù)性好、成本低廉、操作簡(jiǎn)單，適合大規(guī)模檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，已成為水生動(dòng)物漁場(chǎng)監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查最常用的方法，其中抗原捕獲ELISA又是檢測(cè)抗原最常用的方法。在抗原捕獲ELISA中，如都采用單抗，即使是針對(duì)抗原上的兩個(gè)不同位點(diǎn)，建立的方法靈敏度經(jīng)常不理想，這也是限制用夾心法檢測(cè)一些微量抗原的主要障礙。而用多抗捕獲，單抗檢測(cè)這一思路可解決這個(gè)問(wèn)題，用多抗包被保證捕獲的抗原比較充分，單抗的特異性可避免出現(xiàn)假陽(yáng)性。

通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)制備EHNV抗原對(duì)照的方法不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高、易散毒而且獲得的抗原常有被污染的可能，因此本研究選用重組MCP蛋白用于單抗篩選，并且可用作本方法的質(zhì)控抗原，我們的試驗(yàn)也證實(shí)0.056 μg MCP重組蛋白與104TCID50/0.05 mL EHNV病毒液檢測(cè)結(jié)果基本一致，可用于替代病毒液作為質(zhì)控抗原。

本試驗(yàn)建立的方法在檢測(cè)人工感染EHNV各種組織，結(jié)果與熒光PCR檢測(cè)結(jié)果基本一致，且測(cè)定的P/N值與Ct值呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)了方法的特異性和實(shí)用性。由于國(guó)內(nèi)目前沒(méi)有EHNV的發(fā)生，限制了陽(yáng)性臨床樣品的采集，只能用人工感染樣品作為替代陽(yáng)性樣品。進(jìn)一步加大臨床樣品驗(yàn)證數(shù)量，推廣建立的抗原捕獲ELISA方法將是我們今后的重要工作。

［1］Langdon J S，Humphrey J D．Epizootic hematopoietic necrosis a new viral disease in redfin perch，Perca fluviatilis L in Australia［J］．Journal of Fish Diseases，1987，10(4):289-298．

［2］Langdon J S．Experimental transmission and pathogenicity of epizootic haematopoietic necrosis virus(EHNV)in redfin perch，Perca fluviatilis L and 11 other teleosts［J］．Journal of Fish Diseases，1989，12(4):295-310．

［3］Reddacliff L A，Whittington R J．Pathology of epizootic haematopoietic necrosis virus infection in rainbow trout(oncorhynchus mykiss Walbaum)and redfin perch(Perca fluviatilis L)［J］．J Comp Pathol，1996，115(2):103-115．

［4］陳愛(ài)平，江育林，錢(qián)冬，等．流行性造血器官壞死?。跩］．中國(guó)水產(chǎn)雜志，2010，12(12):57-58．

［5］黃輝三，李明玉，母伊楠，等．流行性造血器官壞死病毒(EHNV)PCR快速檢測(cè)試劑盒的研制［J］．臺(tái)灣海峽雜志，2011，30 (1):128-131．

Development and Application of Antigen Capture ELISA for the detection of Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus

LIU Ning1，2，GAO Zhi-qiang3，GU Qiang3，ZHANG Min4，JING Hong-li4，JIANG Yu-lin4，
ZHANG Li-feng3，LIU Jin-hua1
(1．College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China;2．Animal Health Inspection Institute of Dong Cheng District Beijing，Beijing 100027，China;3．Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China;4．Institute of Animal Quarantine，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029，China)

The hyperimmune antiserum against EHNV was obtained from goats which were repeatedly inoculated with purified EHNV virus by differential centrifugation．Then the anti-EHNV IgG，was prepared by the salting out method．Furthermore，the Balb/c mice were immunized with purified EHNV by intraperitoneal injection．When the valence of antibody was high enough，the spleen cells of mouse and myeloma cells were fused．Then the positive hybridoma cells were subcloned by limiting dilution．Finally the hybridoma cell line 3A4 that could stably secrete antibody against MCP protein of EHNV was obtained．A AC-ELISA for detection of EHNV was developed with goat anti-EHNV polyclonal antibody，3A4 and HRP-labeled anti-mouse IgG as coating antibody，detection antibody and conjugate respectively．The detection limit was 103TCID50 virus in supernatant or 0.0056mg recombinant MCP．The results were negative when the purified GCRV，IHNV，IPNV，VHSV and SVCV were detected with developed AC-ELISA．These results showed the AC-ELISA was sensitive，specific and repeatable．The applicability of AC-ELISA was confirmed by the detection of artificial infected samples and clinical samples．

Epizootic haematopoietic necrosis disease;Antigen capture ELISA

s:LIU Jin-hua;ZHANG Li-feng

S852．65

A

0529-6005(2017)01-0010-03

2016-03-25

十二五科技支撐課題“重大外來(lái)與新發(fā)水生動(dòng)物疫病識(shí)別與監(jiān)測(cè)技術(shù)研究及示范”(2013BAD12B02)

劉寧(1978-)，女，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物檢疫工作，E-mail:liuning1016@sina．com

劉金華，E-mail:ljh@cau．edu．cn;張利峰E-mail: zlf1973@163．com