漿水中細(xì)菌多樣性分析及乳酸菌的分離鑒定

張曉輝，楊靖鵬，王少軍，王 靜，樊明濤，魏新元

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

漿水中細(xì)菌多樣性分析及乳酸菌的分離鑒定

張曉輝，楊靖鵬，王少軍，王 靜，樊明濤，魏新元*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

為研究自然發(fā)酵漿水中細(xì)菌的多樣性并分離可以用于批量生產(chǎn)漿水的乳酸菌菌株，分析從3 個不同地方采集的漿水中的細(xì)菌多樣性，分離和鑒定漿水中對常見食源性致病菌抑菌效果好的優(yōu)勢菌乳酸菌。提取漿水總DNA，采用MiSeq技術(shù)對細(xì)菌16S rRNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行測序分析，獲得漿水中的細(xì)菌多樣性。結(jié)果顯示，乳桿菌在3 種漿水中為優(yōu)勢菌，3 種漿水中的細(xì)菌多樣性存在差異，TS_taian和XA_changan 2 種漿水中的細(xì)菌多樣性組成比較相近，而XA_yanta則與前面2 種漿水差異性比較大，在3 種漿水中檢測到致腐菌和可能的致病菌（或條件致病菌）。利用改良的MRS培養(yǎng)基從3 種漿水中分離獲得35 株產(chǎn)生溶鈣圈的菌株，挑選其中10 株對4 種常見食源性致病菌抑制效果好的菌株進(jìn)行16S rRNA測序鑒定，其中8 株為植物乳桿菌，2 株為鼠李糖乳桿菌，說明該2 種菌在漿水中為優(yōu)勢菌，為今后利用此兩株菌進(jìn)行單菌發(fā)酵或混合發(fā)酵生產(chǎn)漿水提供一定的理論和實踐的依據(jù)。

漿水；細(xì)菌多樣性；乳酸菌

漿水是一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，其味酸醇、清香、爽口。在我國北方地區(qū)食用歷史悠久，多被用于夏季制湯或下面，具有很強(qiáng)的保健功效。近年來，南方一些地區(qū)的人們也開始制作漿水菜，并用酸漿水點制豆腐，制成的豆腐微酸，鮮嫩，口感好，沒有異味，深受人們的喜愛[1]。

漿水的傳統(tǒng)制作過程是將時令綠色蔬菜焯水后，加入制備好的面湯或米湯裝入缸或罐中，再加入用老漿水做的引子，并在缸口或罐口加蓋紗布，借助于蔬菜表面和原始漿水中的有益微生物，利用蔬菜原料初加工處理時流出的汁液，讓其自然發(fā)酵，最終獲得成品[2]。其發(fā)酵過程一般經(jīng)過3 個階段，即初期、中期和后期。每個階段的微生物群系都很復(fù)雜，但乳酸菌為其中主要的發(fā)酵菌群[3]。近年來不少學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌不僅可以調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道菌群穩(wěn)定[4]、保持胃腸道微生態(tài)平衡，提高食物消化率[5]，還可以降低人體腸道內(nèi)膽固醇[6-7]，抑制腸道內(nèi)致病菌生長繁殖[5]，制造營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)機(jī)體吸收利用，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的營養(yǎng)狀態(tài)和生理功能，作用于細(xì)胞感染、藥物效應(yīng)、毒性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生和應(yīng)急反應(yīng)等過程[8-10]，對人體有很強(qiáng)的益生作用。

漿水自然發(fā)酵周期長，發(fā)酵過程受很多因素影響，不同的蔬菜及老漿水中微生物菌群復(fù)雜，在漿水中極有可能存在腐敗菌甚至致病菌污染的情況[11-12]。因此，本研究擬對漿水中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，揭示漿水中的優(yōu)勢菌及可能存在的腐敗菌或致病菌；然后對漿水中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，獲得漿水中的優(yōu)勢菌種并鑒定，為今后漿水的純種發(fā)酵以及工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定、健康安全的漿水產(chǎn)品提供基本理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

所用的3 種漿水樣品皆以芹菜為材料，分別采自3 個不同地方：樣品1采自陜西省西安市雁塔區(qū)大寨路與丈八北路十字新樂城小區(qū)，編號為XA_yanta；樣品2采自陜西省西安市長安區(qū)韋曲街道西韋村二組64號，編號為XA_ changan；樣品3采自甘肅省天水市泰安縣西川工業(yè)園區(qū)天水新世紀(jì)工貿(mào)有限公司，編號為TS_taian。

1.1.2 試劑

溶菌酶、蛋白酶K、酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）溶液、氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）溶液、Tris、乙二胺四乙酸二鈉（eathylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、TE緩沖液、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、NaCl 北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖 美國Invitrogen公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS（de Man Rogosa and Sharp）瓊脂培養(yǎng)基：每1 000 mL培養(yǎng)基中含有蛋白胨12 g、牛肉膏10 g、酵母浸膏5 g、無水醋酸鈉5 g、吐溫-80 1 mL、磷酸氫二鉀2 g、七水硫酸鎂0.5 g、四水硫酸錳0.25 g、檸檬酸二銨2 g、葡萄糖20 g、瓊脂14～18 g，pH 7.0～7.2[13]。

改良MRS瓊脂培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中添加0.75% CaCO3，pH 7.0～7.2[13]。

LB培養(yǎng)基：每1 000 mL培養(yǎng)基中含有蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g，pH 7.0～7.2。

1.2 儀器與設(shè)備

移液器 Eppendorf（中國）股份公司；PHS-3C雷磁pH計 上海精科儀器儀表公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；HC3018型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DYCP-31DN型瓊脂糖水平電泳儀（槽） 北京六一儀器廠；GEL DOC XR型凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；MDF-3286S型-80 ℃超低溫冰箱 三洋電機(jī)（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

使用無菌密封袋采集漿水樣品，置于低溫保溫容器中帶回實驗室，振蕩后靜置3 min，將上清液分裝入50 mL無菌離心管中，每個樣品留下1 管進(jìn)行乳酸菌分離，其余樣品于4 ℃條件下，5 000×g離心10 min，收集沉淀備用。

1.3.2 漿水中細(xì)菌多樣性分析

1.3.2.1 漿水中微生物基因組DNA提取

漿水中微生物基因組DNA提取采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法[14]：將1.3.1節(jié)中于貯存?zhèn)溆玫臐{水沉淀采用CTAB法進(jìn)行基因組DNA的提取，提取的DNA經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用紫外分光光度計測定OD260nm進(jìn)行定量，并考察OD260nm/OD280nm。

1.3.2.2 漿水中細(xì)菌多樣性分析

漿水中細(xì)菌多樣性分析采用MiSeq技術(shù)，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成[15-18]。

1.3.3 漿水中乳酸菌的分離、純化與初步篩選

1.3.3.1 漿水中乳酸菌的分離

乳酸菌的分離采用稀釋平板法[19]：取1 mL漿水菌懸液，置于9 mL滅菌生理鹽水中，混勻后從中取1 mL加入另一只9 mL滅菌生理鹽水中，以此類推，將漿水稀釋至原液的10-9。然后，取各稀釋度菌懸液各1 mL分別注入無菌培養(yǎng)皿中，接著向培養(yǎng)皿中加入融化并50 ℃保溫的改良MRS瓊脂培養(yǎng)基，在培養(yǎng)皿中將培養(yǎng)基與菌懸液快速混勻，靜置，待培養(yǎng)基凝固后，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h。

1.3.3.2 漿水中乳酸菌的純化與初步鑒定

乳酸菌的純化采樣劃線分離法[19]：選取在上述改良MRS瓊脂培養(yǎng)基中生長并產(chǎn)溶鈣圈的單菌落，在改良MRS固體培養(yǎng)基的平皿中進(jìn)行劃線分離，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后。從中選取產(chǎn)溶鈣圈的單菌落。然后對疑似菌株進(jìn)行革蘭氏染色，選取革蘭氏染色陽性，菌株形態(tài)單一的進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

1.3.4 疑似乳酸菌對腸道致病菌的抑制作用

疑似乳酸菌的抑菌作用采用牛津杯法[20]。以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和痢疾志賀氏菌4 種食源性致病菌為指示菌，將培養(yǎng)好的致病菌菌懸液加入無菌培養(yǎng)皿中，隨后向平皿中注入約20 mL溶化后50 ℃水浴保溫的LB固體培養(yǎng)基，搖動混勻，靜置凝固后將無菌牛津杯放于培養(yǎng)基表面，使其與培養(yǎng)基無縫接觸，然后將乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)物濾液注入牛津杯中，平皿放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，測量抑菌圈直徑大小。每組實驗做4 個重復(fù)1 個對照。

1.3.5 疑似乳酸菌的鑒定

1.3.5.1 乳酸菌的DNA提取

菌株DNA的提取采用CTAB法[21]。將待鑒定菌株在液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后收集菌體，然后采用CTAB法對疑似乳酸菌基因組DNA進(jìn)行抽提與純化，提取的DNA通過0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA溶液置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.2 乳酸菌的16S rDNA的PCR擴(kuò)增與測序

以乳酸菌基因組DNA為模板，采用通用引物27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1495r（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）進(jìn)行乳酸菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增[21-22]。PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR結(jié)束后，以1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。對于電泳結(jié)果顯示條帶大小與理論值相符者，用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，然后送至上海立菲生物技術(shù)有限公司（北京）測序。

1.3.5.3 乳酸菌的16S rDNA序列分析與菌株鑒定

16S rDNA序列分析采用在線BLASTN法，將雙向測序并拼接得到的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中采用BLASTN比對，進(jìn)行同源性分析鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 漿水中細(xì)菌多樣性分析

2.1.1 漿水中DNA提取預(yù)定量

3 種不同來源漿水中總DNA的質(zhì)量濃度分別為：XA_yanta 104.50 ng/μL、XA_changan 204.11 ng/μL、TS_taian 71.59 ng/μL。瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA處理效果比較理想（數(shù)據(jù)未展示），且OD260nm/OD280nm均介于1.8～2.0之間，可進(jìn)行下一步工作。

2.1.2 漿水中細(xì)菌多樣性分析

2.1.2.1 Shannon-Wiener曲線

圖1 Shannon-Wiener曲線Fig.1 Shannon-Wiener curve

Shannon-Wiener是反映樣本中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣本的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性[23]。當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。本次細(xì)菌多樣性分析的測序深度曲線見圖1，各樣品的微生物多樣性指數(shù)很快便達(dá)到一定數(shù)值，并不再隨測序量增大而增大，曲線趨向平坦，故說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。

2.1.2.2 操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析與不同樣品間細(xì)菌多樣性比較

Venn圖可用于統(tǒng)計多個樣本中所共有和獨有的OTU數(shù)目，可以比較直觀地表現(xiàn)樣本的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況[24]。通常情況下，分析時選用相似水平為97%的OTU樣本表，按照97%相似性對非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，共得到OTU的代表序列43 個（數(shù)據(jù)未展示），并通過作Venn圖來比較樣品間細(xì)菌多樣性的異同（圖2）。由圖2可知，3 個樣品之間既有共存細(xì)菌，也有獨自存在的細(xì)菌。

圖2 OTU比較Venn圖Fig.2 Venn chart of OTU comparison among three samples

2.1.2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

圖3 各樣品的菌種分布扇形圖Fig.3 Sector diagram for the distribution of bacterial species in three samples

圖4 樣品菌種分布柱狀圖Fig.4 Bar graph showing the distribution of bacterial species in three samples

采用核糖體數(shù)據(jù)庫工程分類貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在種屬水平統(tǒng)計了每個樣品的群落組成。由圖3、4可知，3 種漿水中主要菌群為乳桿菌（Lactobacillus），尤其是漿水XA_ changan和漿水TS_taian中乳桿菌達(dá)到98%以上，兩種漿水在細(xì)菌多樣性組成上比較接近，漿水XA_yanta中乳桿菌也達(dá)到70%以上。此外，漿水XA_changan中還存在極少量的醋酸桿菌（Acetobacter，0.04%）和鏈球菌（Streptococcus，0.03%）；漿水TS_taian中還存在少量醋酸桿菌（1.07%）和魏斯氏菌（Weissella，0.01%）；而漿水XA_yanta還含有14.71%的魏斯氏菌、5.70%的鏈球菌、4.94%的乳球菌（Lactococcus）及4.43%的其他細(xì)菌。通過比較分析，來自西安長安區(qū)和來自天水泰安的漿水細(xì)菌多樣性比較相似，而且多樣性很簡單，但是西安雁塔區(qū)的漿水與它們相比，多樣性存在較大差異，而且西安雁塔區(qū)漿水中的細(xì)菌多樣性比較復(fù)雜。

2.1.2.4 漿水樣品中群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

為檢測不同漿水細(xì)菌多樣性種類的異同，通過熱圖（Heatmap）分析了不同樣品中的細(xì)菌多樣性信息，如圖5所示，不同顏色代表菌種OTU數(shù)目占總體OTU數(shù)目的百分比，縱軸顯示菌種的種類，該圖更清晰地展示了3 種漿水樣品中的細(xì)菌組成。其中，TS_taian漿水中的有乳桿菌屬、醋酸桿菌屬、嗜熱菌屬及假單胞菌屬等。XA_changan漿水中有乳桿菌屬、鏈球菌屬、克雷伯氏菌屬、索氏菌屬、假單胞菌及不動桿菌屬等。而XA_yanta漿水細(xì)菌多樣性最豐富，有乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬、微小桿菌屬、克雷伯氏菌屬、不動桿菌屬、氣單胞菌屬、梭狀芽孢桿菌、明串珠菌屬、固氮菌、月形單胞菌屬、擬桿菌屬、庫特氏菌屬及醋酸桿菌屬等。

圖5 常規(guī)群落結(jié)構(gòu)Heatmap圖Fig.5 Heatmap for the structure of bacterial communities in three samples

2.2 乳酸菌的分離與純化

圖6 菌株WZS_013的革蘭氏染色（×1 000）Fig.6 Microscopic observation of strain WZS_013 after Gram staining (× 1 000)

將梯度稀釋的漿水菌懸液采用傾注法進(jìn)行分離后，選取在改良MRS培養(yǎng)基產(chǎn)生溶鈣圈的單菌落進(jìn)一步在改良MRS進(jìn)行劃線分離，優(yōu)先選擇稀釋度高和菌落形態(tài)有差異的。然后，將劃線分離后依然產(chǎn)生溶鈣圈的單菌落進(jìn)行斜面劃線培養(yǎng)后保藏，共得到35 株疑似乳酸菌。同時進(jìn)行革蘭氏染色，染色結(jié)果顯示菌體均呈革蘭氏染色陽性，且菌體形態(tài)單一，菌株之一WZS_013的顯微圖像見圖6。

2.3 疑似乳酸菌對腸道致病菌的抑制作用

表1 疑似乳酸菌對食源性致病菌的抑菌圈Table1 Inhibitory effects of possible lactic acid bacteria against foodborne pathogens

通過牛津杯法測定35 株疑似乳酸菌對4 種食源性致病菌的抑菌圈大小，如表1所示，對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析后發(fā)現(xiàn)菌株WZS_001、WZS_002、WZS_003、WZS_005、WZS_007、WZS_012、WZS_013、WZS_025、WZS_026、WZS_029對4 種致病菌抑制能力較強(qiáng)，因此，挑選出來對其進(jìn)行菌種鑒定。

2.4 疑似乳酸菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增及菌種鑒定

2.4.1 疑似乳酸菌基因組DNA提取

由圖7可知，8 株疑似乳酸菌的基因組DNA條帶單一，大小比較理想，質(zhì)量較好（另外2株菌DNA電泳效果和此8 株相似，未提供圖譜），可以作為模板用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

圖7 疑似乳酸菌基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.7 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA of possible lactic acid bacteria

2.4.2 疑似乳酸菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增

圖8 疑似乳酸菌16S rDNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.8 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR products of possible lactic acid bacteria

以CTAB法提取的基因組DNA為模板，利用擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的通用引物27f和1495r進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。由圖8可知，PCR擴(kuò)增片段大小約在1 500 bp位置，與理論值接近。

2.4.3 疑似乳酸菌的16S rDNA序列比較分析與鑒定

將疑似乳酸菌的16S rDNA測序所得序列（數(shù)據(jù)未展示）在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行在線BLASTN比對，比對結(jié)果顯示菌株WZS_001、WZS_002、WZS_003、WZS_005、WZS_007、WZS_025、WZS_026、WZS_029這8 株菌與植物乳桿菌WCFS1相似度達(dá)100%，被鑒定為植物乳桿菌；菌株WZS_012和WZS_013與鼠李糖乳桿菌有大于94%的相似水平，被鑒定為鼠李糖乳桿菌。

3 討論與結(jié)論

當(dāng)前對漿水的研究依然主要集中在發(fā)酵制作工藝[25]與對其中益生菌乳酸菌分離、篩選及功能性研究方面[26-29]，乳酸菌新的功能及代謝活性被繼續(xù)挖掘，如降膽固醇[26]、γ-氨基丁酸[28]、亞硝酸[29]等。但是，對于漿水中微生物的復(fù)雜性的分析及安全性的評價尚少。

對于漿水中細(xì)菌多樣性的測定，本研究通過測定細(xì)菌16S rDNA的可變區(qū)的核苷酸序列，比較分析結(jié)果顯示，漿水中的細(xì)菌以乳桿菌為主，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相符[27-29]，但是不同的采集地的漿水中的細(xì)菌多樣性并不一致。由圖3～5可知，TS_taian漿水和XA_changan漿水中乳桿菌占絕大多數(shù)（98%以上），其他雜菌無論是種類還是所占比例均非常?。籜A_yanta漿水相對前兩種漿水，乳桿菌所占比例較低（70.22%）。而且除了乳桿菌，其他菌在種類上也存在較大差異，TS_taian漿水（含乳桿菌和醋酸桿菌）和XA_changan（含乳桿菌和魏斯氏菌）除了兩類尚無有害報道的細(xì)菌外，都含有一種可能的致病菌（或者條件致病菌）或者其他暫時無法確定是否有害的菌；而XA_yanta漿水中除了含有的乳桿菌和魏斯氏菌，其他的可能致病菌較前兩種漿水種類更多，在菌數(shù)上所占比例也較大，這可能因為其所處的發(fā)酵時期不一樣，XA_yanta漿水的發(fā)酵時間較另外兩種要短。盡管3 種漿水中具有益生功能的乳酸菌都占了絕大多數(shù)，但是其中依然有其他腐敗菌及致病菌（或條件致病菌）的存在，如克雷伯氏菌屬、不動桿菌屬、氣單胞菌屬等。李雪萍等[12,26-27]研究也發(fā)現(xiàn)漿水中還存在霉菌和腸道菌等有害菌的污染，不利于漿水的發(fā)酵和保存，對食品的安全性存在風(fēng)險，因此很有必要對漿水進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化生產(chǎn)。

對乳酸菌的分離，本研究通過半選擇性的改良MRS培養(yǎng)基進(jìn)行初步篩選，這樣，具有產(chǎn)酸能力并且酸性強(qiáng)于碳酸的菌株就會溶解培養(yǎng)基中的碳酸鈣而形成溶鈣圈，然后對其進(jìn)行抑菌實驗，篩選出抑菌能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行測序鑒定。由于乳酸菌分離采用梯度稀釋法從高稀釋度中選出，抑菌效果佳，而且測序比對結(jié)果顯示，篩選出的菌均為植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌，為漿水優(yōu)勢菌，該2 種菌當(dāng)前公認(rèn)為安全，因此可以用于漿水及相關(guān)食品的發(fā)酵生產(chǎn)。

本研究中對漿水中細(xì)菌多樣性的檢測是針對16S rDNA的V3～V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增后測序得到，采用的是二代測序技術(shù)，因此，能對細(xì)菌多樣性的分析尚未鑒定到種，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，測序精度和深度不斷進(jìn)步，對序列分析的軟件也將不斷地發(fā)展，這必將會大大地推動對不同樣品中微生物多樣性分析的深度和廣度。

本研究從漿水中細(xì)菌的多樣性方面揭示了漿水樣品中存在著不同類群的細(xì)菌，盡管傳統(tǒng)的自然發(fā)酵食品已經(jīng)盛行很久，并且由于發(fā)酵過程中參與的微生物比較多，會增加一些特異性的風(fēng)味，但是由于自然發(fā)酵食品不可避免的可能被污染，基于食品安全的考慮，自然發(fā)酵食品在食用前應(yīng)盡量進(jìn)行安全性的檢測與評估，或者選用已知的益生乳酸菌純種發(fā)酵或多種混合發(fā)酵進(jìn)行漿水生產(chǎn)，將會大大減少食品安全風(fēng)險，也必將成為一種發(fā)展趨勢。因此，今后研究將分別考察不同的乳酸菌在漿水發(fā)酵中的風(fēng)味的影響，篩選出合適的乳酸菌進(jìn)行純種發(fā)酵或混合菌發(fā)酵。

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Bacterial Diversity Analysis and Isolation and Identi fi cation of Lactic Acid Bacteria from Jiangshui, a Traditional Chinese Fermented Vegetable Product

ZHANG Xiaohui, YANG Jingpeng, WANG Shaojun, WANG Jing, FAN Mingtao, WEI Xinyuan*
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

In this study, the bacterial diversities in three Jiangshui (a traditional Chinese fermented vegetable product) samples collected from three different locations were analyzed in order to isolate lactic acid bacteria for massive production of Jiangshui. The dominant lactic acid bacteria with a significant bacteriostatic effect against four common foodborne pathogens were isolated and identif i ed from the Jiangshui samples. Total bacterial DNA was extracted from Jiangshui for sequencing of the 16S rRNA V3–V4 region using the MiSeq sequencing technique to understand the bacterial diversity. The results showed that Lactobacillus was dominant in all three Jiangshui samples, showing differences in their bacterial diversity. The compositions of bacterial communities in Jiangshui samples from Chang’an district of Xi’an and Taian county of Tianshui were similar, but significantly different from that of the sample from Yanta district of Xi’an. Both spoilage bacteria and potential pathogens (or opportunistic pathogens) were detected in each sample. A total of 35 stains able to form calcium dissolution circle, were isolated using a modified MRS medium. Ten strains were selected for their outstanding inhibitory activity against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis and Shigella dysenteriae, which were identified through 16S rDNA sequencing as 8 strains of Lactobacillus plantarum and 2 strains of Lactobacillus rhamnosus, indicating that Lactobacillus plantarum and Lactobacillus rhamnosus are the dominant bacteria in Jiangshui. This study can provide some theoretical and practical bases for the production of Jiangshui by applying both lactic acid bacteria or one of them in the future.

Jiangshui; bacterial diversity; lactic acid bacteria

10.7506/spkx1002-6630-201704012

Q935

A

1002-6630（2017）04-0070-07

2016-04-10

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201503142-10）；陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項目（2016NY-148）；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費專項（QN2011138）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201410712078）

張曉輝（1993—），本科生，研究方向為食品安全與食品高新技術(shù)。E-mail：zhangxiaohui9641@163.com

*通信作者：魏新元（1971—），副教授，博士，研究方向為食品安全與食品高新技術(shù)。E-mail：wheixinyuan@126.com

張曉輝, 楊靖鵬, 王少軍, 等. 漿水中細(xì)菌多樣性分析及乳酸菌的分離鑒定[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 70-76.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704012. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Xiaohui, YANG Jingpeng, WANG Shaojun, et al. Bacterial diversity analysis and isolation and identif i cation of lactic acid bacteria from Jiangshui, a traditional Chinese fermented vegetable product[J]. Food Science, 2017, 38(4): 70-76. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704012. http://www.spkx.net.cn