抑制劑去除對冷凍草莓中諾如病毒RT-PCR檢測的影響

徐文斐，房保海，林 超，王宮璞，王 群，鄭小龍，梁成珠，岳志芹

（山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，山東 青島 266002）

抑制劑去除對冷凍草莓中諾如病毒RT-PCR檢測的影響

徐文斐，房保海，林 超，王宮璞，王 群，鄭小龍，梁成珠，岳志芹*

（山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，山東 青島 266002）

目的：設(shè)計對比實驗，以冷凍草莓為材料，研究樣品中所含抑制劑對諾如病毒熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測結(jié)果的影響，優(yōu)化提高檢測靈敏度與準(zhǔn)確率。方法：GⅡ型諾如病毒便懸液的制備與RNA提取，已知陰性冷凍草莓樣品進(jìn)行前處理、病毒富集、病毒RNA提取純化，分組（對照組、實驗組），抑制劑去除，熒光定量RT-PCR檢測。結(jié)果：隨著病毒濃度的梯度遞減，抑制劑影響作用呈明顯增強趨勢，導(dǎo)致在高于正常檢測最低限度兩個數(shù)量級的水平，即出現(xiàn)假陰性結(jié)果；抑制劑去除的實驗組檢測結(jié)果，隨著病毒濃度梯度的遞減明顯優(yōu)于未經(jīng)處理的對照組；抑制劑去除的實驗組穩(wěn)定檢出限為10-6（Ct值小于40），最低檢出限為10-7（諾如病毒（norovirus，NoV）濃度梯度檢測最低檢出限為10-5）。結(jié)論：抑制劑去除可明顯優(yōu)化冷凍草莓中NoV熒光定量RT-PCR檢測，提高檢測方法的靈敏度，且操作簡便快捷，檢測成本浮動不大，期望應(yīng)用于日常檢測工作中。

冷凍草莓；諾如病毒；熒光定量RT-PCR；抑制劑

諾如病毒（norovirus，NoV），是一種引起非細(xì)菌性急性胃腸炎的病毒，基因組為單股正鏈RNA，屬杯狀病毒[1]，具GⅠ～GⅤ 5 種基因組，29 種基因型[2]，1968年科學(xué)家最早在美國諾瓦克市暴發(fā)的一次急性腹瀉的患者糞便中分離發(fā)現(xiàn)?？筛腥救撕蛣游飳?dǎo)致急性腸胃炎，其中對人類具有高感染性的NoV主要基因型為GⅠ、GⅡ型，少于等于102拷貝數(shù)/mL的NoV顆粒即可以致病，1972年由Kapikian首次檢出[3]，傳播途徑以食物和水為載體的“糞→口”傳播為主[4]。2012年，德國發(fā)生了10 952人次感染NoV的大面積急性腸胃炎事件，伴隨著腹瀉、嘔吐、高熱等癥狀[5]，此后2013—2014年，歐盟連續(xù)兩次頒布相關(guān)法令，提高對進(jìn)出口冷凍草莓的官方監(jiān)控水平[6]。目前食品中NoV檢測的報道多見于貝類[7]，但最新研究表明，冷凍草莓、酸性漿果類和蔬菜類食品同樣是NoV感染高發(fā)的重要載體[8-10]。NoV可從急性胃腸炎病人的糞便中分離獲得，尚不能在細(xì)胞或組織中培養(yǎng)，也沒有合適的動物模型，因此檢測工作目前多通過分子生物學(xué)的熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）實驗方法[11-13]。水果類食品基質(zhì)中，草莓及其他酸性軟果樣品中存在著大量的RT-PCR抑制劑，包括復(fù)雜多糖、酚類物質(zhì)和腐植酸等[14]，以及病毒RNA提取過程中有機、無機試劑成分的殘留同樣會對RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用[15]，影響熒光定量檢測的靈敏度，加之該類食品基質(zhì)中NoV污染水平往往很低[16-18]，一旦出現(xiàn)假陰性的檢測結(jié)果，所造成的經(jīng)濟與大面積腹瀉爆發(fā)，將造成不可挽回的負(fù)面影響。因此，檢出限越低的方法越能更好地保障食品安全。

因此本實驗為分析草莓等酸性軟果類釋放的大量PCR抑制劑的影響作用，實驗設(shè)計以國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）公布的食品中NoV檢測方法為基礎(chǔ)[19]，經(jīng)過特定的PCR抑制劑去除實驗，對不同梯度濃度GⅡ型NoV RNA含量的條件下，常規(guī)檢測方法效果進(jìn)行評估。對比分析抑制劑的影響作用及最佳檢測方法，以期為建立國內(nèi)相關(guān)食品中NoV檢測標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與病毒

冷凍草莓樣品均來自于實驗室常規(guī)檢測樣品，-20 ℃保存，1 周內(nèi)檢測。

NoV GⅡ型病毒原液：由實驗室檢測獲得NoV糞便懸液，使用1×磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）10 倍稀釋，旋渦振蕩混勻，8 000×g離心20 min，上清液分裝至1.5 mL離心管，-80 ℃貯存?zhèn)溆肹20]。

1.1.2 試劑與儀器

果膠酶（Sigma p2401） 美國Sigma公司；Tris/Glycine/Beef extract（TGBE）緩沖液（Tris base 12.1 g、甘氨酸3.8 g、牛肉浸出粉10 g、雙蒸水補充至1 L，pH值調(diào)節(jié)至9.5，高壓滅菌）、PBS（5×PEG，50 g/100 mL PEG 8000，1.5 mol/L NaCl，高壓滅菌）、1 mol/L鹽酸、氫氧化鈉溶液、氯仿、正丁醇等化學(xué)試劑（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；RNEASY Mini Kit（74104） 德國Qiagen公司；One-StepTMPCR Inhibitor Removal Kit 美國Genemed Synthesis公司；Ambion AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit（AM1005） 美國ABI公司。

7500熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司；5804R高速低溫離心機（50 mL） 德國Eppendorf公司；BagPageR無菌勻質(zhì)袋 法國Interscience公司；MLS-3750高壓滅菌鍋、WDF-U4186S超低溫冰箱 松下健康醫(yī)療器械（上海）有限公司。

1.1.3 引物和探針

參照ISO/TS 15216-2:2013[19]合成引物與探針，Norovirus GⅡ正向引物：ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA；反向引物：TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA；探針：FAM-AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG-BHQ。引物加無RNase超純水配制成10 μmol/L溶液，探針加無RNase超純水配制成5 μmol/L溶液。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

稱取冷凍草莓樣品25 g或6～8 枚果粒置于帶濾網(wǎng)的勻質(zhì)袋中，加入40 mL已混30 U果膠酶的TGBE緩沖液，調(diào)節(jié)pH值至9.5，60 r/min勻速振搖20 min。每隔10 min檢測樣品pH值，若pH值小于9.0，則使用NaOH調(diào)節(jié)至pH 9.5，孵育時間延長10 min。結(jié)束后將過濾樣品液倒入離心管中，4 ℃、10 000×g離心30 min，取上清液至新離心管。

1.2.2 病毒富集

使用HCl溶液調(diào)節(jié)樣品液pH值至7.0，加入1/4體積的PEG充分混勻后4 ℃振搖4 h或靜置過夜。4 ℃、10 000×g離心30 min，棄上清液，4 ℃、10 000×g離心5 min，壓實沉淀。移液槍移去廢液后加500 μL PBS振蕩重懸，室溫靜置5 min，4 ℃、10 000×g離心10 min，吸上清液至離心管，加入等體積氯仿-正丁醇（1∶1，V/V），振蕩混合后靜置5 min。4 ℃、10 000×g離心15 min，將上層水相小心移至新離心管中，-20 ℃保存。

1.2.3 病毒RNA提取

按照Qiagen RNEASY Mini Kit （74104）試劑盒說明書，提取NoV GⅡ病毒10 倍梯度稀釋懸液RNA和樣品中病毒提取液RNA，最終溶于100 μL RNase水，-80 ℃保存。

1.2.4 PCR抑制劑的去除

采用One-StepTMPCR Inhibitor Removal Kit[21]，將離心柱下端去除，放入離心管中，8 000 r/min離心3 min，棄離心液；加入50 μL提取獲得的RNA溶液至離心柱中心，8 000 r/min離心1 min，收集過柱病毒RNA用于熒光定量RT-PCR檢測。

1.2.5 最低檢出限的確定及對照組的設(shè)定

目前NoV尚未能體外培養(yǎng)，對其難以準(zhǔn)確定量。本實驗中將已確定為陽性樣品的病毒便懸液進(jìn)行梯度稀釋后，分別提取病毒RNA，使用熒光定量RT-PCR方法確定穩(wěn)定檢測出最高稀釋倍數(shù)10-x（x＞0）。Linear線性圖中具有指數(shù)期起峰和相應(yīng)Ct數(shù)值的檢測結(jié)果，即判定為陽性檢出。

實驗設(shè)計2 組實驗組與2 組對照組：對照組A為原倍樣品RNA溶液；對照組B為10 倍稀釋的樣品RNA溶液；實驗組A為去除抑制劑樣品的RNA溶液；實驗組A為10 倍稀釋的去除抑制劑樣品RNA溶液。具體步驟：取不同批次經(jīng)檢測確定為陰性的冷凍草莓樣品，每組5 個重復(fù)平行，按照1.2.1～1.2.3節(jié)的方法步驟進(jìn)行樣品前處理與RNA提取，最終獲得100 μL樣品RNA溶液，取50 μL進(jìn)行PCR抑制劑去除實驗，分別將常規(guī)與去除抑制劑后樣品RNA溶液進(jìn)行10 倍稀釋。

1.2.6 熒光定量RT-PCR檢測

采用Ambion AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit（AM1005）試劑盒，擴增體系：包含5 μL待測樣品RNA，12.5 μL 2×PCR Master Mix、增強劑1.67 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，熒光探針1 μL，0.25 μL不同濃度的NoV RNA作為內(nèi)參照，補充水至25 μL。以水代替模板作為空白對照。反應(yīng)參數(shù)：反轉(zhuǎn)錄45 ℃ 10 min；酶活性熱啟動95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s 反應(yīng)45 個循環(huán)。實驗結(jié)果采用雙因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 梯度濃度及檢出限的確定

NoV GⅡ型病毒原液進(jìn)行10 倍梯度稀釋至10-8，按照1.2.3節(jié)步驟提取病毒RNA，每個樣品3個平行，熒光定量PCR進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1。原倍至稀釋1 0-8倍的平均C t值分別為2 5.0 3 9±0.3 2 6、28.151±0.378、31.784±0.720、34.744±0.543、37.648±0.779、39.560±0.921、0、0、0，本實驗方法最低檢出數(shù)量級為10-5，Ct值為39.560±0.921。

圖1 NoV GⅡ型病毒濃度梯度檢測結(jié)果Fig.1 PCR amplif i cation curves of NoVGⅡconcentration gradients

2.2 不同濃度內(nèi)參RNA條件下熒光定量PCR結(jié)果

不同濃度內(nèi)參RNA（NoV GⅡ病毒RNA）條件下，實驗組A、B與對照組A、B實驗結(jié)果數(shù)據(jù)見表4。對比內(nèi)參RNA常規(guī)梯度濃度檢測結(jié)果，并進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果顯示：在高濃度100倍NoV病毒內(nèi)參RNA條件下，酸性軟果類所含有的抑制劑成分對熒光定量RTPCT檢測結(jié)果的影響極?。≒＞0.05）見圖2；隨著NoV內(nèi)參RNA濃度的降低，10-1～10-3倍NoV內(nèi)參RNA條件下對照組A中，PCR抑制劑影響作用極顯著（P＜0.01）見圖3、4；10-4倍內(nèi)參RNA條件下開始出現(xiàn)假陰性結(jié)果，見圖5。

結(jié)果顯示：隨著內(nèi)參RNA濃度的降低，10-3倍稀釋濃度之后，抑制劑去除后的實驗組A/B與對應(yīng)的內(nèi)參RNA梯度濃度檢測結(jié)果差異不顯著（P＞0.05）；最低檢出數(shù)量級為10-7，實驗組A Ct值為40.298±1.027，實驗組B Ct值為39.061±0.839，兩組檢測結(jié)果差異不顯著（P＞0.05）。

表4 不同濃度內(nèi)參RNA條件下熒光定量PCR結(jié)果（Ct值）Table4 Results of PCR detection of internal reference RNA at different concentrations

圖2 10倍內(nèi)參RNA條件下實驗組與對照組PCR結(jié)果Fig.2 PCR Amplif i cation curves of internal reference RNA at initial concentration of 100

圖3 稀釋至10－1倍內(nèi)參RNA條件下實驗組與對照組PCR結(jié)果Fig.3 PCR Amplif i cation curves of internal reference RNA diluted to 10-1

圖4 稀釋至10－3倍內(nèi)參RNA條件下實驗組與對照組PCR結(jié)果Fig.4 PCR Amplif i cation curves of internal reference RNA diluted to 10-3

圖5 稀釋至10倍內(nèi)參RNA條件下實驗組與對照組PCR結(jié)果Fig.5 PCR Amplifi cation curves of internal reference RNA diluted to 10-4

3 討 論

截至目前NoV的培養(yǎng)和分離，缺乏合適的動物模型和細(xì)胞系，尚不能人工培養(yǎng)，但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光定量RT-PCR檢測技術(shù)的應(yīng)用[22-24]，著實提供了一種高靈敏度、低檢出限、步驟簡便、節(jié)省時間的檢測方法[11-13]。但冷凍草莓食品樣品所含有的大量復(fù)雜多糖、酚類物質(zhì)和腐植酸等PCR抑制劑成分[14]，在某些條件下可直接影響到檢測結(jié)果。周陽等[25]研究建議，在冷凍草莓的前處理階段，選擇在冷凍草莓樣品未完全解凍前進(jìn)行取樣處理，甘氨酸緩沖液洗脫冷凍草莓樣品時，振蕩的時間和強度都需要嚴(yán)格控制，目的是為了防止果皮破裂，減少草莓中所含有的大量糖類成分、酸性成分與果膠流出[25]。此類酚類、多糖等物質(zhì)屬RT-PCR強干擾物質(zhì)，卻可隨病毒RNA的提取共同提取出[26]。

本實驗使用One-StepTMPCR Inhibitor Removal Kit試劑盒[21]，去除檢測樣品病毒RNA提取溶液中的抑制劑成分，方法簡便快捷。為準(zhǔn)確反映PCR抑制劑的去除對檢測結(jié)果的影響作用，本實驗設(shè)計將不同數(shù)量級濃度的NoV RNA作為內(nèi)參病毒RNA，添加至陰性樣品PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，直觀準(zhǔn)確地反映出冷凍草莓樣品所釋放出的大量抑制劑成分對檢測結(jié)果的影響規(guī)律，為下一步優(yōu)化冷凍軟果類食品中NoV檢測方法，提高檢測靈敏度與準(zhǔn)確率提供不可或缺的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

根據(jù)不同濃度NoV內(nèi)參RNA條件下實驗結(jié)果顯示：在原倍樣品提取液（對照組A）環(huán)境下，高濃度NoV RNA（Ct值為25.039）含量下，抑制劑對檢測結(jié)果的影響較?。坏S著病毒濃度的遞減，抑制劑影響作用呈明顯增強趨勢；實驗結(jié)果表明冷凍草莓樣品中的抑制劑成分在NoV稀釋至10-4倍濃度時，檢測結(jié)果即出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，造成標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的靈敏度低至10-3，其對正常檢測工作的阻礙影響高達(dá)兩個數(shù)量級。本實驗通過專用試劑盒去除正常檢測樣品中的抑制劑，實驗結(jié)果分析表明：除了在原倍高濃度NoV RNA含量條件下，實驗組A、B與對照組A、B無明顯差異之外，抑制劑去除的實驗組隨著病毒濃度的遞減，檢測結(jié)果的效果明顯優(yōu)于未經(jīng)處理的原倍樣品病毒RNA提取液（對照組A）。10 倍稀釋的對照組B與10 倍稀釋的實驗組B，檢測結(jié)果分別不同程度的優(yōu)于各自的原倍組，其原因李楠等[21]在研究中推測是因為隨著10 倍稀釋，所含抑制劑的濃度也隨之降低；抑制劑去除的實驗組A與10 倍稀釋的實驗組B穩(wěn)定檢出限為10-6（Ct值小于40）；實驗組最低檢出限為10-7，此時實驗組A檢測Ct值為40.298，在日常檢測中此結(jié)果應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步復(fù)驗。通過實驗結(jié)果分析得出，抑制劑去除可明顯優(yōu)化冷凍草莓等冷凍軟果類食品基質(zhì)中NoV的熒光定量RT-PCR檢測效果，提高檢測方法的靈敏度，對此類病毒污染水平較低的樣品，具有重要意義。本實驗所采取的抑制劑去除方法為One-StepTMPCR Inhibitor Removal Kit試劑盒，操作簡便快捷，單個樣品檢測成本浮動不大。期望在日常檢測工作中，從以往的原倍樣品提取液檢測與10 倍稀釋提取液檢測，增加去除抑制劑樣品提取液檢測，3 種檢測體系，多重檢測保障，確保檢測結(jié)果的可靠性，更好的保障食品安全性。

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Inf l uence of PCR Inhibitor Removal on Detection of Norovirus GⅡ in Frozen Strawberry by Real-Time Fluorescent RT-PCR

XU Wenfei, FANG Baohai, LIN Chao, WANG Gongpu, WANG Qun, ZHENG Xiaolong, LIANG Chengzhu, YUE Zhiqin*
(Technique Center of Inspection and Quarantine, Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266002, China)

Objective: Comparative experiments were designed to address the inf l uence of the presence of PCR inhibitor on the results of detection of norovirus GⅡ in frozen strawberry by real-time fl uorescent RT-PCR (RT-qPCR), aiming to improve the detection sensitivity and accuracy. Methods: After pretreatment of fecal suspensions containing norovirus GⅡand known negative strawberry samples, the virus was enriched for the extraction and purif i cation of RNA and a control group and an experimental group were established. After removal of the PCR inhibitor, the samples were determined by RT-qPCR. Results: The effect of the inhibitor tended to increase obviously with decreasing concentration gradient of virus, thus giving false negative results which were two orders of magnitude higher than the lowest level detected without the presence of the inhibitor. Better detection results were obtained by removal of the inhibitor compared with the control untreated group, as the virus concentration gradient decreased. The stable detection limit (LOD) for the experimental group without PCR inhibitor was 10-6(Ct value ＜ 40), and the minimum LOD were 10-7. Conclusion: The detection of norovirus in frozen strawberries by fl uorescence quantitative RT-PCR could be improved in terms of sensitivity by removal of the inhibitor. In addition, the improved method was quick, easy to operate, economic and practical.

frozen strawberry; norovirus G Ⅱ; RT-PCR; inhibitors

10.7506/spkx1002-6630-201704048

X954

A

1002-6630（2017）04-0296-05

徐文斐, 房保海, 林超, 等. 抑制劑去除對冷凍草莓中諾如病毒RT-PCR檢測的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 296-300.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704048. http://www.spkx.net.cn

XU Wenfei, FANG Baohai, LIN Chao, et al. Inf l uence of PCR inhibitor removal on detection of norovirus GⅡ in frozen strawberry by real-time fluorescent RT-PCR[J]. Food Science, 2017, 38(4): 296-300. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704048. http://www.spkx.net.cn

2016-05-29

青島市民生科技計劃項目（14-2-3-60-nsh）；科技部質(zhì)檢公益項目（201410080-2）

徐文斐（1987—），女，碩士研究生，研究方向為食源性病毒檢測食品安全。E-mail：34660104@qq.com

*通信作者：岳志芹（1975—），女，研究員，博士，研究方向為水生動物疫病病原生物學(xué)。E-mail：yuezhiqin@126.com