• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    內(nèi)源性氧化脅迫促進(jìn)釀酒酵母合成谷胱甘肽的潛在機(jī)制分析

    2017-03-27 06:50:25王立梅任清華鄭麗雪朱益波
    食品科學(xué) 2017年4期
    關(guān)鍵詞:戊糖胞內(nèi)丙酮酸

    王立梅,任清華,鄭麗雪,孫 姜,齊 斌,朱益波,*

    (1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇 常熟 215500;2.煙臺(tái)啤酒青島朝日有限公司,山東 煙臺(tái) 264000;3.中海海洋無錫海洋工程裝備有限公司,江蘇 無錫 214000)

    內(nèi)源性氧化脅迫促進(jìn)釀酒酵母合成谷胱甘肽的潛在機(jī)制分析

    王立梅1,任清華2,鄭麗雪1,孫 姜3,齊 斌1,朱益波1,*

    (1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇 常熟 215500;2.煙臺(tái)啤酒青島朝日有限公司,山東 煙臺(tái) 264000;3.中海海洋無錫海洋工程裝備有限公司,江蘇 無錫 214000)

    利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析手段結(jié)合生理生化特性來研究釀酒酵母突變株高產(chǎn)谷胱甘肽的潛在機(jī)制。結(jié)果表明:突變株谷胱甘肽合成限速酶、抗氧化酶活力及其編碼基因表達(dá)量、過氧化氫和還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)含量顯著提高;丙酮酸激酶活力、丙酮酸、檸檬酸和琥珀酸含量顯著降低;此外,三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑的基因表達(dá)量分別顯著下調(diào)和上調(diào)。因此,突變株可能在遭受內(nèi)源性活性氧過氧化氫的脅迫下,通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽合成限速酶活力加強(qiáng)了谷胱甘肽的合成,與抗氧化酶共同抵御氧化脅迫;丙酮酸激酶活力減弱降低了丙酮酸的合成,減少了三羧酸循環(huán)的通量,使得磷酸戊糖途徑通量增加,從而提高了NADPH含量,為谷胱甘肽的合成提供了充足的還原力。

    谷胱甘肽;氧化脅迫;釀酒酵母;還原型輔酶Ⅱ

    谷胱甘肽(glutathione,GSH)是一類普遍存在于生物體內(nèi)的活性小肽化合物[1-3],具有解毒[4]、抗氧化[5]和增強(qiáng)免疫力[6]等多種生物學(xué)功能,能夠清除外源異物[7],抵御由活性氧造成的氧化性損傷[8]以及增強(qiáng)白細(xì)胞的免疫功能[9]。隨著各種生物活性功能的不斷揭曉,GSH的應(yīng)用范圍也越來越廣泛[10-12],國(guó)內(nèi)外的需求量日益增大,其中存在的巨大商業(yè)價(jià)值推動(dòng)了GSH的工業(yè)化生產(chǎn)。

    GSH主要的生產(chǎn)方法包括溶劑萃取法[13]、化學(xué)合成法[14]、酶轉(zhuǎn)化法[15]和微生物發(fā)酵法[16]。其中微生物發(fā)酵法是最高效最經(jīng)濟(jì)的GSH工業(yè)化生產(chǎn)方法。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是目前最常用的一種GSH微生物發(fā)酵菌株,胞內(nèi)GSH合成能力強(qiáng),安全無毒。然而,普通的S. cerevisiae菌株GSH產(chǎn)量一般不足細(xì)胞干質(zhì)量的1%[17],因此研究者不斷地通過一些物理和化學(xué)方法(紫外[18]、亞硝基胍[19]和γ-射線[20]等)對(duì)S. cerevisiae進(jìn)行誘變處理從而篩選高產(chǎn)GSH的突變菌株。

    轉(zhuǎn)錄組學(xué)是指一門從整體層面上研究特定細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科,主要建立在測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上。RNA高通量測(cè)序(RNA-Seq)是一種新的測(cè)序技術(shù),能夠提供全面的轉(zhuǎn)錄組方面的信息,檢測(cè)靈敏,重復(fù)性好,準(zhǔn)確率高,樣品用量少,操作簡(jiǎn)便[21]。從而為研究生物體在不同條件下的基因轉(zhuǎn)錄情況提供了便利、高效和功能強(qiáng)大的技術(shù)平臺(tái)。

    在之前的研究中,以保藏的S. cerevisiae 2-10515為出發(fā)菌株,利用化學(xué)誘變劑亞硝基胍誘變篩選得到一株高產(chǎn)GSH的S. cerevisiae突變株Y518,本研究在此基礎(chǔ)上,通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析手段結(jié)合生理生化特性來進(jìn)一步研究突變株Y518高產(chǎn)GSH的潛在機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌種

    S. cerevisiae 2-10515(出發(fā)菌株)和S. cerevisiae Y518(突變株)由蘇州食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

    1.1.2 試劑

    檸檬酸和琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司;GSH和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)檢測(cè)試劑盒、過氧化氫檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測(cè)試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase,GPX)檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)測(cè)試盒、丙酮酸測(cè)試盒、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS)測(cè)試盒、丙酮酸激酶測(cè)試盒 蘇州科銘生物技術(shù)有限公司;總RNA提取試劑盒 德國(guó)Qiagen公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    S. cerevisiae培養(yǎng)基[22]:酵母膏5 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀6 g/L、硫酸鉀3 g/L、硫酸銨5 g/L、硫酸鎂1.5 g/L,pH 6.0。

    1.2 儀器與設(shè)備

    UV-2450分光光度計(jì)、LC-20A高效液相色譜儀、Shim-pack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 日本島津公司;酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司;TissueLyserⅡ高通量組織破碎儀 德國(guó)Qiagen公司;2100生物分析儀 美國(guó)Agilent公司;HiSeq 2000測(cè)序儀美國(guó)Illumina公司。

    1.3 方法

    1.3.1 發(fā)酵

    分別將活化好的出發(fā)菌株和突變株單菌落接種到種子培養(yǎng)基中,于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)18 h,再將種子液等量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,于相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h。

    1.3.2 GSH和GSSG含量測(cè)定

    取發(fā)酵液于12 000 r/min、4 ℃離心5 min,收集菌體細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖液洗滌一次后按照GSH和GSSG檢測(cè)試劑盒說明書的要求利用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果用mg/g細(xì)胞干質(zhì)量表示。細(xì)胞干質(zhì)量于105 ℃條件下烘干測(cè)定。

    1.3.3 總RNA提取和高通量測(cè)序

    菌體細(xì)胞用冷的DEPC水洗滌2 次并用液氮猝滅2 min,按照總RNA提取試劑盒說明書要求用高通量組織破碎儀破壁后提取總RNA。RNA高通量測(cè)序委托深圳華大基因研究院進(jìn)行,原始數(shù)據(jù)已上傳GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc. cgi?acc=GSE47787)。具體步驟如下:總RNA樣品質(zhì)量經(jīng)生物分析儀檢測(cè)合格后進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建;cDNA文庫構(gòu)建合格后利用測(cè)序儀進(jìn)行序列鑒定,測(cè)序儀產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)(raw reads)經(jīng)過去雜處理轉(zhuǎn)換成clean reads用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析;利用SOAP2序列比對(duì)軟件將獲得的clean reads與S. cerevisiae S288c參考基因序列進(jìn)行比對(duì)計(jì)算基因表達(dá)量并篩選出差異表達(dá)基因(上調(diào)或下調(diào)的倍數(shù)不小于1),后續(xù)分析中Gene Ontology(GO)和KEGG Pathway顯著性富集分析都是基于差異表達(dá)基因進(jìn)行的;GO功能顯著性富集分析能夠篩選出差異表達(dá)基因顯著富集的GO功能條目,并鑒定出這些差異表達(dá)基因參與哪些生物學(xué)功能;KEGG Pathway顯著性富集分析能夠篩選出差異表達(dá)基因顯著性富集的通路,從而了解這些差異表達(dá)基因主要參與的生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

    1.3.4 過氧化氫和抗氧化酶活力測(cè)定

    過氧化氫和抗氧化酶(SOD、CAT和GPX)活力分別參照各自的檢測(cè)試劑盒說明書在酶標(biāo)儀上進(jìn)行測(cè)定。1.3.5 γ-GCS活力、丙酮酸激酶活力、NADPH和丙酮酸含量測(cè)定

    γ-GCS活力、丙酮酸激酶活力、NADPH和丙酮酸含量按照各自測(cè)試盒說明書的要求在分光光度計(jì)上進(jìn)行測(cè)定。

    1.3.6 檸檬酸和琥珀酸含量測(cè)定

    利用高效液相色譜法測(cè)定檸檬酸和琥珀酸的含量[23],分析條件為:分離柱Shim-pack VP-ODS C18、流動(dòng)相0.5%磷酸氫二銨、流速0.8 mL/min,進(jìn)樣量20 μL、柱溫25 ℃、檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 GSH產(chǎn)量

    圖1 Y518和2-10515胞內(nèi)GSH(A)和GSSG(B)含量Fig.1 Intracellular GSH (A) and GSSG (B) contents of the mutant Y518 and the parent strain 2-10515

    Y518 GSH含量在前48 h逐漸增加,48~60 h有所降低(圖1A),GSSG含量逐漸減少(圖1B),說明隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)有部分GSSG逐漸轉(zhuǎn)化成GSH;2-10515 GSH和GSSG含量均逐漸降低(圖1),說明兩者之間的轉(zhuǎn)化保持平衡;而在一個(gè)完整的發(fā)酵周期內(nèi),Y518 GSH產(chǎn)量比2-10515提高了約55%,表明突變株胞內(nèi)積累GSH的能力比出發(fā)菌株強(qiáng)。為了進(jìn)一步揭示突變株Y518胞內(nèi)GSH合成增強(qiáng)的機(jī)制,進(jìn)行了以RNA-Seq為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。

    2.2 GO功能顯著性富集分析

    RNA-Seq共鑒定篩選出1 628 個(gè)差異表達(dá)基因,對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)在分子功能類群下有6 個(gè)差異表達(dá)基因參與抗氧化活性功能(圖2)。GPX2/HYR1編碼GPX,CTT1編碼CAT,TRR1/TRR2編碼硫氧還蛋白還原酶,它們能夠催化清除過氧化氫;而SOD1編碼Cu/Zn SOD,能夠催化清除超氧陰離子自由基。Y518的這6 個(gè)基因中除了TRR1下調(diào)外其余均顯著上調(diào)(表1),表明Y518胞內(nèi)可能存在氧化脅迫。

    圖2 GO功能顯著性富集分析Fig.2 GO functional enrichment analysis

    表1 Y518參與抗氧化活性功能的差異表達(dá)基因Table1 Up- or down-regulated expression of antioxidant enzyme gens in Y518 relative to 2-10515

    2.3 KEGG Pathway顯著性富集分析

    表2 Y518上調(diào)的磷酸戊糖途徑基因表達(dá)量Table2 Up-regulated expression of genes involved in the pentose phosphate pathway in Y518 relative to 2-10515

    表3 Y518下調(diào)的三羧酸循環(huán)基因表達(dá)量Table3 Down-regulated expression of genes involved the citrate cycle pathway in Y518 relative to 2-10515

    為了進(jìn)一步了解這些差異表達(dá)基因在代謝途徑里的變化情況,對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG Pathway分析,結(jié)果顯示磷酸戊糖通路基因顯著上調(diào)(上調(diào)倍數(shù)不小于2)(表2),而三羧酸循環(huán)通路基因顯著下調(diào)(下調(diào)倍數(shù)不小于2)(表3),表明磷酸戊糖途徑的通量可能加強(qiáng)而三羧酸循環(huán)的通量可能減弱。GO和KEGG Pathway顯著性富集分析都是基于基因?qū)用孢M(jìn)行的分析,并不能完全說明突變株高產(chǎn)GSH的表觀現(xiàn)象,所以進(jìn)行了一些生理生化特性方面的研究。

    2.4 GSH合成限速酶活力變化

    圖3 Y518和2-10515 GSH合成限速酶活力變化Fig.3 The activities of rate-limiting enzymes for GSH synthesis of Y518 and 2-10515

    γ-GCS是催化合成GSH反應(yīng)的限速酶[24],其活力強(qiáng)弱直接影響GSH的產(chǎn)量。如圖3所示,在發(fā)酵過程中,Y518和2-10515的γ-GCS活力均呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì),6~24 h,Y518的γ-GCS活力高于2-10515,48 h略低于2-10515。整體而言,Y518的γ-GCS活力顯著高于2-10515,說明Y518 GSH產(chǎn)量的提高和γ-GCS活力的增強(qiáng)有關(guān)。

    2.5 抗氧化酶活力和過氧化氫含量變化

    圖4 Y518和2-10515抗氧化酶活力和胞內(nèi)過氧化氫含量變化Fig.4 Antioxidant enzymes activities and intracellular hydrogen peroxide contents of Y518 and 2-10515

    SOD[25]、CAT[26]和GPX[27]是細(xì)胞防御體系重要的抗氧化酶,能夠催化氧化還原反應(yīng)清除活性氧,抵御氧化性損傷。Y518 SOD活力在6~24 h逐漸增加,24~48 h下降,而2-10515 SOD活力則變化很小(圖4A);兩者CAT的活力變化趨勢(shì)一致,都是從6~12 h增加,12~48 h逐漸下降(圖4B);兩株菌GPX的活力在6~48 h都呈下降趨勢(shì)(圖4C)。在整個(gè)發(fā)酵過程中,Y518的3 種酶活力均顯著高于2-10515,而之前的研究中發(fā)現(xiàn)Y518胞內(nèi)活性氧水平顯著高于出發(fā)菌株2-10515[28],表明Y518胞內(nèi)存在由活性氧引起的氧化脅迫,GO功能顯著性富集分析顯示,參與抗氧化活性功能的6 個(gè)差異表達(dá)基因中有5 個(gè)基因的主要功能是清除活性氧過氧化氫,因此繼續(xù)測(cè)定突變株和出發(fā)菌株胞內(nèi)過氧化氫的含量,結(jié)果顯示,Y518胞內(nèi)過氧化氫含量幾乎是2-10515的兩倍多(圖4D),因此,Y518可能遭受由活性氧過氧化氫引起的內(nèi)源性氧化脅迫,從而啟動(dòng)抗氧化酶和提高GSH含量來抵御氧化性損傷[29]。

    2.6 NADPH含量變化

    圖5 Y518和2-10515胞內(nèi)NADPH含量變化Fig.5 Intracellular NADPH contents of Y518 and 2-10515

    如圖5所示,Y518胞內(nèi)NADPH顯著高于2-10515,能夠?yàn)閅518轉(zhuǎn)化GSSG生成GSH提供充足的還原力[30]。而NADPH主要產(chǎn)生于磷酸戊糖途徑,通過KEGG Pathway顯著性富集分析發(fā)現(xiàn),相對(duì)于2-10515,Y518磷酸戊糖途徑整體基因表達(dá)量顯著上調(diào)(表2),通量增加,因此,Y518胞內(nèi)NADPH含量的提高可能是由于磷酸戊糖途徑通量增加導(dǎo)致的。

    2.7 丙酮酸激酶活力和丙酮酸含量變化

    圖6 Y518和2-10515丙酮酸激酶活力(A)和胞內(nèi)丙酮酸含量(B)變化Fig.6 Pyruvatekinase activities (A) and intracellular pyruvate contents (B) of Y518 and 2-10515

    丙酮酸激酶催化糖酵解途徑最后一步將磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸,而丙酮酸又是進(jìn)入三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵代謝物,Y518丙酮酸激酶活力和胞內(nèi)丙酮酸含量均顯著低于2-10515(圖6),說明Y518減弱了丙酮酸激酶活力從而減少了丙酮酸的生成,這有可能會(huì)降低三羧酸循環(huán)的通量[31]。

    2.8 檸檬酸和琥珀酸含量變化

    圖7 Y518和2-10515胞內(nèi)檸檬酸(A)和琥珀酸(B)含量變化Fig.7 Intracellular contents of citrate (A) and succinate (B) of Y518 and 2-10515

    KEGG Pathway顯著性富集分析發(fā)現(xiàn),Y518三羧酸循環(huán)整體基因表達(dá)量顯著下調(diào)(表3),而重要中間產(chǎn)物檸檬酸和琥珀酸含量也顯著減少(圖7),說明三羧酸循環(huán)的通量的確降低,而糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑是互補(bǔ)的兩個(gè)通路,所以磷酸戊糖途徑通量的增加可能是三羧酸循環(huán)通量降低導(dǎo)致的[31]。

    2.9 突變株Y518高產(chǎn)GSH的機(jī)制

    圖8 Y518高產(chǎn)GSH的機(jī)制Fig.8 Mechanism underlying glutathione oversynthesis in Y518

    從圖8可以看出,過氧化氫含量的提高產(chǎn)生了氧化脅迫,Y518增強(qiáng)了抗氧化酶的活力,提高了胞內(nèi)還原力,增加了GSH的含量,共同抵御氧化脅迫。

    3 結(jié) 論

    以亞硝基胍誘變篩選出的一株高產(chǎn)G S H的Saccharomyces cerevisiae突變株Y518為研究對(duì)象,通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析手段結(jié)合生理生化特性初步探索了突變株高產(chǎn)GSH的潛在機(jī)制。研究表明突變株Y518胞內(nèi)可能存在由活性氧過氧化氫引起的氧化脅迫,從而啟動(dòng)了一系列的防御機(jī)制來維持胞內(nèi)氧化還原環(huán)境的平衡。一方面通過增強(qiáng)GSH合成限速酶的活力促進(jìn)GSH合成來抵御氧化脅迫;另一方面通過增加磷酸戊糖途徑的通量加強(qiáng)NADPH的產(chǎn)生為GSSG轉(zhuǎn)化成GSH提供充足的還原力。

    [1] 陳志穎, 張子健, 焦瑞杰, 等. 利用啤酒廢酵母擴(kuò)培物制備富含谷胱甘肽酵母抽提物[J]. 中國(guó)釀造, 2015, 34(11): 61-65. DOI:10.11882/ j.issn.0254-5071.2015.11.014.

    [2] 姚晨陽, 劉敬, 張啟美, 等. 谷胱甘肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 山東科學(xué), 2016, 29(1): 105-109. DOI:10.3976/ j.issn.1002-4026.2016.01.018.

    [3] 鄭麗雪, 謝群凡, 王立梅, 等. 不同pH值釀酒酵母分批發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽數(shù)學(xué)模型建立[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(13): 162-164. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201313035.

    [4] RECIO L, SHEPARD K G, HERNáNDEZ L G, et al. Dose-response assessment of naphthalene-induced genotoxicity and glutathione detoxication in human TK6 lymphoblasts[J]. Toxicological Sciences, 2012, 126(2): 405-412. DOI:10.1093/toxsci/kfs012.

    [5] SAFONOVA O A, POPOVA T N, KRYL’SKII E D, et al. Synthesis and estimation of the inf l uence of 2,4-dimethoxyphenylbiguanide on the glutathione antioxidant system activity in heart and blood serum of rats with experimental rheumatoid arthritis[J]. Pharmaceutical Chemistry Journal, 2016, 49(11): 749-752. DOI:10.1007/s11094-016-1364-7.

    [6] KEI H, SATOSHI F, PAWEL B, et al. Glutathione and tryptophan metabolism are required for Arabidopsis immunity during the hypersensitive response to hemibiotrophs[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2013, 110(23): 9585-9594. DOI:10.1073/pnas.1305745110.

    [7] CAROLE M, CHARLOTTE J, JEAN-FRAN?OIS M, et al. The utilization of sulfur amino acid in the mercapturate pathway to detoxify maximal therapeutic dose of acetaminophen is associated with glutathione and protein homeosteny in adult rats[J]. Faseb Journal, 2013, 27(7): 295-310.

    [8] SULLIVAN L, MARTINEZ-GARCIA E, NGUYEN H, et al. The proto-oncometabolite fumarate binds glutathione to amplify ROS-dependent signaling[J]. Molecular Cell, 2013, 51(2): 236-248. DOI:10.1016/j.molcel.2013.05.003.

    [9] MING J H, YE J Y, ZHANG Y X, et al. Effects of dietary reduced glutathione on growth performance, non-specif i c immunity, antioxidant capacity and expression levels of IGF-I and HSP70 mRNA of grass carp (Ctenopharyngodon idella)[J]. Aquaculture, 2015, 438: 39-46. DOI:10.1016/j.aquaculture.2014.12.038.

    [10] 李純偉. 還原型谷胱甘肽在肝硬化治療中的應(yīng)用[J]. 中外醫(yī)學(xué)研究, 2015(31): 46-47. DOI:10.14033/j.cnki.cfmr.2015.31.022.

    [11] 冮潔, 單立峰. 谷胱甘肽的生產(chǎn)及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)調(diào)味品, 2009, 34(2): 40-44. DOI:10.3969/ j.issn.1000-9973.2009.02.006.

    [12] 李曉玲, 馬志敏, 郝秀玲, 等. 香煙提取物對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的影響及還原型谷胱甘肽的干預(yù)作用[J]. 臨床薈萃, 2015, 30(8): 875-879. DOI:10.3969/j.issn.1004-583X.2015.08.009.

    [13] 劉千, 陳黎, 胡用軍, 等. 麥胚谷胱甘肽提取與含量測(cè)定方法研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2012, 27(10): 104-108. DOI:10.3969/ j.issn.1003-0174.2012.10.021.

    [14] 周佳棟, 曹飛, 張小龍, 等. 一種基于共保護(hù)策略合成谷胱甘肽的新方法[J]. 有機(jī)化學(xué), 2009, 29(8): 1272-1277.

    [15] 李鑫. HPLC法檢測(cè)酶法合成中還原型/氧化型谷胱甘肽[J]. 廣東化工, 2014, 41(5): 158-159. DOI:10.3969/j.issn.1007-1865.2014.05.082.

    [16] 孫姜, 朱益波, 王立梅, 等. 原生質(zhì)體誘變選育高產(chǎn)GSH菌株及基因表達(dá)分析[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(23): 176-179. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201323037.

    [17] PENNINCKX M J, JASPERS C J, LEGRAIN M J. The glutathionedependent glyoxalase pathway in the yeast Saccharomyces cerevisiae[J]. Journal of Biological Chemistry, 1983, 258(10): 6030-6036.

    [18] 胡林華, 譚天偉. 高產(chǎn)谷胱甘肽酵母菌株的選育和培養(yǎng)條件的初探[J]. 高校化學(xué)工程學(xué)報(bào), 2005, 19(2): 273-276. DOI:10.3321/ j.issn:1003-9015.2005.02.025.

    [19] 王雅楠, 梅艷珍, 鄭麗雪, 等. 高產(chǎn)GSH酵母突變株Y518谷胱甘肽合成酶結(jié)構(gòu)分析[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(17): 258-261. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2009.17.059.

    [20] 邵娜, 衛(wèi)功元, 葛曉光, 等. 紫外線γ-射線復(fù)合誘變篩選S-腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵菌株[J]. 輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào), 2010, 28(2): 107-113.

    [21] TRAPNELL C, ROBERTS A, GOFF L, et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cuff l inks[J]. Psychopharmacology, 2012, 7(5): 562-578. DOI:10.1038/nprot.2012.016.

    [22] 冮潔, 卜紅宇. 釀酒酵母菌產(chǎn)谷胱甘肽的發(fā)酵條件研究[J]. 中國(guó)釀造, 2009, 28(1): 59-61. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2009.01.018.

    [23] 張利, 成建國(guó), 張善飛, 等. 不同代數(shù)釀酒酵母對(duì)有機(jī)酸代謝的影響[J].食品工業(yè)科技, 2012, 33(9): 202-204.

    [24] GAVIN F, WALLACE B. Glutamate cysteine ligase and the agerelated decline in cellular glutathione: the therapeutic potential of γ-glutamylcysteine[J]. Archives of Biochemistry & Biophysics, 2016, 593(5): 12-23. DOI:10.1016/j.abb.2016.01.017.

    [25] GAJERA H P, KATAKPARA Z A, PATEL S V, et al. Antioxidant defense response induced by Trichoderma viride against Aspergillus niger Van Tieghem causing collar rot in groundnut (Arachis hypogaea L.)[J]. Microbial Pathogenesis, 2016, 91(1): 26-34. DOI:10.1016/ j.micpath.2015.11.010.

    [26] SANI M, SEBAI H, REFINETTI R, et al. Effects of sodium nitroprusside on mouse erythrocyte catalase activity and malondialdehyde status[J]. Drug & Chemical Toxicology, 2016, 39(3): 350-356. DOI:10.3109/01480545.2015.1122032.

    [27] WIRTH T. Kleine Organoselenverbindungen: mehr als nur mimetika der glutathion-peroxidase[J]. Angewandte Chemie, 2015, 127(35): 10212-10214. DOI:10.1002/ange.201505056.

    [28] ZHU Y Y, SUN J, ZHU Y Y, et al. Endogenic oxidative stress response contributes to glutathione over-accumulation in mutant Saccharomyces cerevisiae Y518[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2015, 99(17): 7069-7078. DOI:10.1007/s00253-015-6629-7.

    [29] LI L, DU J, LIAN Y, et al. Protective effects of coenzyme Q10 against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in PC12 cell: the role of Nrf2 and antioxidant enzymes[J]. Cellular & Molecular Neurobiology, 2016, 36(1): 103-111. DOI:10.1007/s10571-015-0224-4.

    [30] DONG L H, LI L, SONG Y, et al. TRAF6-mediated SM22α K21 ubiquitination promotes G6PD activation and NADPH production, contributing to GSH homeostasis and VSMC survival in vitro and in vivo[J]. Circulation Research, 2015, 117(8): 684-694. DOI:10.1161/ CIRCRESAHA.115.306233.

    [31] GRüNING N M, RINNERTHALER M, BLUEMLEIN K, et al. Pyruvate kinase triggers a metabolic feedback loop that controls redox metabolism in respiring cells[J]. Cell Metabolism, 2011, 14(3): 415-427. DOI:10.1016/j.cmet.2011.06.017.

    Elucidation of the Underlying Mechanism by Which Endogenous Oxidative Stress Promotes Glutathione Synthesis of Saccharomyces cerevisiae

    WANG Limei1, REN Qinghua2, ZHENG Lixue1, SUN Jiang3, QI Bin1, ZHU Yibo1,*
    (1. College of Biological and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China; 2. Yantai Beer Tsingtao Asahi Co. Ltd., Yantai 264000, China; 3. Wuxi Ocean Engineering Equipment Co. Ltd. of Zhonghai Ocean, Wuxi 214000, China)

    The potential mechanism for glutathione oversynthesis in the Saccharomyces cerevisiae mutant Y518 was researched using transcriptome analysis combined with physiological and biochemical characteristics. The results indicated that the rate-limiting enzyme of glutathione synthesis, antioxidant enzymes activities and the expression levels of their encoding genes, and the contents of hydrogen peroxide and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) were signif i cantly increased in the mutant whereas pyruvatekinase activity, the contents of pyruvate, citrate and succinate were markedly decreased. Besides, the expression levels of genes involved in the citrate cycle were significantly down-regulated while those involved in the pentose phosphate pathway were signif i cantly up-regulated. Therefore, under endogenous oxidative stress, the mutant might strengthen the synthesis of glutathione by adjusting the activities of rate-limiting enzymes of glutathione synthesis to defend against oxidative stress together with the antioxidant enzymes. Meanwhile, weakened pyruvatekinase activity decreased pyruvate generation, which led to declined citrate cycle fl ux and increased NADPH production by the pentose phosphate pathway and consequently provided appropriate reducing power for glutathione biosynthesis.

    glutathione; oxidative stress; Saccharomyces cerevisiae; NADPH

    10.7506/spkx1002-6630-201704005

    Q815

    A

    1002-6630(2017)04-0026-06

    王立梅, 任清華, 鄭麗雪, 等. 內(nèi)源性氧化脅迫促進(jìn)釀酒酵母合成谷胱甘肽的潛在機(jī)制分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 26-31. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704005. http://www.spkx.net.cn

    WANG Limei, REN Qinghua, ZHENG Lixue, et al. Elucidation of the underlying mechanism by which endogenous oxidative stress promotes glutathione synthesis of Saccharomyces cerevisiae[J]. Food Science, 2017, 38(4): 26-31. (in Chinese with English abstract)

    10.7506/spkx1002-6630-201704005. http://www.spkx.net.cn

    2016-03-28

    國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31171758)

    王立梅(1964—),女,教授,博士,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:wlmqb@126.com

    *通信作者:朱益波(1980—)男,副教授,博士,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:centuryrain@cslg.edu.cn

    猜你喜歡
    戊糖胞內(nèi)丙酮酸
    丙酮酸的微生物發(fā)酵生產(chǎn)中的菌種篩選與改良
    優(yōu)化穩(wěn)定劑提高丙酮酸氧化酶穩(wěn)定性的研究
    丙酮酸鈉藥理作用及其臨床應(yīng)用前景研究進(jìn)展
    HIV/AIDS患者繼發(fā)鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群感染診療進(jìn)展
    傳染病信息(2021年6期)2021-02-12 01:52:08
    尿感方清除受感染膀胱上皮細(xì)胞胞內(nèi)尿道致病性大腸桿菌的作用
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:27
    姬松茸胞內(nèi)多糖和胞外多糖的抗氧化活性研究
    福建輕紡(2017年12期)2017-04-10 12:56:39
    戊糖乳桿菌制劑防治仔豬腹瀉效果初探
    不同非氧化磷酸戊糖途徑基因的過表達(dá)對(duì)釀酒酵母木糖發(fā)酵性能的影響
    粉防己堿對(duì)β-葡聚糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)、胞內(nèi)游離鈣及cAMP表達(dá)的影響
    無籽西瓜種子萌發(fā)與磷酸戊糖途徑關(guān)系的研究
    欧美日韩视频精品一区| 青春草国产在线视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲成色77777| 亚洲自拍偷在线| 久久久精品94久久精品| 插阴视频在线观看视频| 亚洲色图综合在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 成人国产麻豆网| 九九在线视频观看精品| 亚洲欧美日韩东京热| 天堂中文最新版在线下载 | 婷婷色综合大香蕉| 黄片wwwwww| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产午夜精品一二区理论片| a级一级毛片免费在线观看| 欧美高清成人免费视频www| a级一级毛片免费在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产高清不卡午夜福利| av福利片在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 51国产日韩欧美| 国产乱人偷精品视频| 午夜视频国产福利| 一个人看的www免费观看视频| 91久久精品电影网| 亚洲av日韩在线播放| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产永久视频网站| 国产极品天堂在线| 久久99蜜桃精品久久| 少妇人妻 视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 国产成人aa在线观看| 久久精品夜色国产| 51国产日韩欧美| 国产v大片淫在线免费观看| 丝袜喷水一区| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲国产精品999| 伦理电影大哥的女人| 熟女电影av网| 久久热精品热| 美女主播在线视频| 亚洲伊人久久精品综合| 久久久久久国产a免费观看| 视频中文字幕在线观看| av在线天堂中文字幕| 国产免费一区二区三区四区乱码| 老司机影院成人| 国产精品一区www在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 成人二区视频| av线在线观看网站| 免费黄频网站在线观看国产| kizo精华| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 日韩欧美精品v在线| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品av视频在线免费观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲内射少妇av| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲av免费高清在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲人与动物交配视频| 一级av片app| 亚洲在线观看片| 免费av观看视频| www.av在线官网国产| 久久久久久九九精品二区国产| 日本午夜av视频| 精品一区二区免费观看| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美性感艳星| 国产精品久久久久久av不卡| 熟女人妻精品中文字幕| 18禁动态无遮挡网站| 联通29元200g的流量卡| 国产毛片a区久久久久| av.在线天堂| 国产精品国产三级专区第一集| 99热国产这里只有精品6| 久久久久久久久大av| 欧美精品国产亚洲| 欧美性感艳星| 色婷婷久久久亚洲欧美| 18禁动态无遮挡网站| 欧美变态另类bdsm刘玥| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 精品午夜福利在线看| 少妇的逼好多水| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲国产色片| 特大巨黑吊av在线直播| av专区在线播放| 少妇高潮的动态图| 亚洲成人av在线免费| 2022亚洲国产成人精品| 视频区图区小说| 一边亲一边摸免费视频| 六月丁香七月| 美女cb高潮喷水在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产成人精品婷婷| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 精品人妻熟女av久视频| 免费看av在线观看网站| 伊人久久国产一区二区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 两个人的视频大全免费| 日韩中字成人| a级一级毛片免费在线观看| av福利片在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 免费电影在线观看免费观看| 欧美性感艳星| 久久人人爽人人爽人人片va| av国产精品久久久久影院| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美极品一区二区三区四区| 日韩一区二区视频免费看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 交换朋友夫妻互换小说| 精品久久久久久久久亚洲| 男女国产视频网站| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 狂野欧美激情性bbbbbb| 高清毛片免费看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产av码专区亚洲av| 亚洲精品成人久久久久久| 日韩大片免费观看网站| 久久精品综合一区二区三区| 日韩 亚洲 欧美在线| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 免费av观看视频| 人体艺术视频欧美日本| 2021天堂中文幕一二区在线观| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产片特级美女逼逼视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产精品99久久久久久久久| 欧美xxⅹ黑人| 一区二区三区精品91| 精品久久久久久久久av| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 久久久久精品性色| 丝袜喷水一区| 成年版毛片免费区| 午夜日本视频在线| 久久99热这里只有精品18| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美成人午夜免费资源| 欧美97在线视频| 大陆偷拍与自拍| av免费观看日本| 2018国产大陆天天弄谢| 国产成人a∨麻豆精品| 成人二区视频| 国产免费又黄又爽又色| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 午夜福利高清视频| 日韩伦理黄色片| 精品久久久久久久久av| 免费观看无遮挡的男女| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久鲁丝午夜福利片| 男的添女的下面高潮视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 午夜视频国产福利| 身体一侧抽搐| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美一区二区亚洲| 国产乱来视频区| 日韩视频在线欧美| 亚洲成人av在线免费| 美女主播在线视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产精品久久久久久av不卡| 色视频www国产| 国产探花在线观看一区二区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 91精品国产九色| 国产探花在线观看一区二区| 夫妻性生交免费视频一级片| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久精品欧美日韩精品| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产久久久一区二区三区| 国产成人freesex在线| 欧美xxⅹ黑人| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久久久久久大av| 国产成年人精品一区二区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 男女国产视频网站| 99热全是精品| 久久久久久久亚洲中文字幕| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲精品色激情综合| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品99久久99久久久不卡 | 毛片一级片免费看久久久久| 国产一级毛片在线| 亚洲人成网站在线观看播放| 午夜日本视频在线| 高清av免费在线| 日本欧美国产在线视频| 男女那种视频在线观看| 黄色日韩在线| 久久久久精品久久久久真实原创| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲欧美清纯卡通| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲无线观看免费| 久久久久网色| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 真实男女啪啪啪动态图| 国产男女超爽视频在线观看| www.色视频.com| 丰满少妇做爰视频| 伊人久久国产一区二区| 夫妻性生交免费视频一级片| 日韩制服骚丝袜av| av国产久精品久网站免费入址| 免费人成在线观看视频色| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一级片'在线观看视频| 日韩免费高清中文字幕av| 久久久久久久大尺度免费视频| 不卡视频在线观看欧美| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 97热精品久久久久久| 高清毛片免费看| h日本视频在线播放| 日本色播在线视频| 亚洲精品国产成人久久av| 久久国内精品自在自线图片| av线在线观看网站| 国产毛片a区久久久久| av国产免费在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 在线免费观看不下载黄p国产| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美最新免费一区二区三区| 深夜a级毛片| 激情 狠狠 欧美| 国产黄色视频一区二区在线观看| 中文字幕久久专区| 九九在线视频观看精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 日韩强制内射视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 真实男女啪啪啪动态图| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲精品亚洲一区二区| 视频区图区小说| 嫩草影院入口| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久女婷五月综合色啪小说 | 一边亲一边摸免费视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产成人午夜福利电影在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产精品爽爽va在线观看网站| 2021少妇久久久久久久久久久| av在线老鸭窝| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 天堂中文最新版在线下载 | 午夜福利视频1000在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 免费观看在线日韩| 在线观看三级黄色| 国产精品99久久99久久久不卡 | 婷婷色av中文字幕| 伦精品一区二区三区| 日韩伦理黄色片| 男插女下体视频免费在线播放| 日本一本二区三区精品| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产视频首页在线观看| 欧美3d第一页| 少妇高潮的动态图| 久久99热这里只有精品18| 亚洲欧美清纯卡通| 午夜免费观看性视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 精品少妇久久久久久888优播| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美xxⅹ黑人| 91久久精品国产一区二区三区| 人妻系列 视频| 麻豆成人av视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 成人无遮挡网站| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 一级二级三级毛片免费看| 成年av动漫网址| 欧美区成人在线视频| 亚洲自偷自拍三级| av黄色大香蕉| 网址你懂的国产日韩在线| 我的女老师完整版在线观看| 日本欧美国产在线视频| 秋霞伦理黄片| 街头女战士在线观看网站| 我要看日韩黄色一级片| 三级国产精品片| 五月开心婷婷网| 亚洲av免费在线观看| 99久国产av精品国产电影| 精品久久久噜噜| 国产成人精品久久久久久| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久久网色| 久久久欧美国产精品| 国产一区二区三区av在线| 久久韩国三级中文字幕| 久久久久久久亚洲中文字幕| 寂寞人妻少妇视频99o| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产91av在线免费观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲伊人久久精品综合| 久久久色成人| 熟女av电影| 婷婷色综合大香蕉| 一区二区三区乱码不卡18| 波多野结衣巨乳人妻| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲va在线va天堂va国产| 美女被艹到高潮喷水动态| av在线观看视频网站免费| 久久久久久久精品精品| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产精品人妻久久久久久| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产69精品久久久久777片| 搞女人的毛片| av国产免费在线观看| 在线观看免费高清a一片| 免费少妇av软件| 日日啪夜夜撸| 亚洲av一区综合| 高清在线视频一区二区三区| 国产欧美亚洲国产| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 乱码一卡2卡4卡精品| 91久久精品电影网| av国产精品久久久久影院| 观看免费一级毛片| 国产精品国产三级专区第一集| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 七月丁香在线播放| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美人与善性xxx| 大码成人一级视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久久久久久久久久免费av| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲四区av| 国产成人freesex在线| 一级毛片 在线播放| 精品人妻熟女av久视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 中文欧美无线码| 欧美激情在线99| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产爽快片一区二区三区| 特级一级黄色大片| 亚洲精品,欧美精品| 性色avwww在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久久久久伊人网av| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美变态另类bdsm刘玥| 美女主播在线视频| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩国内少妇激情av| 精品午夜福利在线看| 欧美3d第一页| 国产av码专区亚洲av| 97在线视频观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产成人精品久久久久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 成人美女网站在线观看视频| 国产黄色免费在线视频| 国产成人a∨麻豆精品| 国产成人精品一,二区| 午夜福利在线在线| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产伦精品一区二区三区四那| 日本午夜av视频| 久久久色成人| 十八禁网站网址无遮挡 | 国产乱人偷精品视频| 交换朋友夫妻互换小说| 黄色怎么调成土黄色| 老女人水多毛片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久这里有精品视频免费| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲欧美成人精品一区二区| 视频区图区小说| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品99久久久久久久久| 国产男人的电影天堂91| 免费看日本二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美另类一区| 如何舔出高潮| 欧美精品一区二区大全| 观看美女的网站| 国产综合懂色| 日韩欧美精品v在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产伦在线观看视频一区| 亚州av有码| 国产精品久久久久久久久免| 免费观看av网站的网址| 九色成人免费人妻av| 色视频www国产| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一级毛片电影观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日韩av不卡免费在线播放| 欧美成人a在线观看| av专区在线播放| 国产精品av视频在线免费观看| 精品一区二区三区视频在线| 国产毛片在线视频| 免费av毛片视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久精品欧美日韩精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 内射极品少妇av片p| 精品国产三级普通话版| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久久a久久爽久久v久久| 麻豆久久精品国产亚洲av| 午夜福利视频精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| 99久久精品热视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久久国产一区二区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 插逼视频在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 青春草视频在线免费观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品国产三级普通话版| 在线免费观看不下载黄p国产| 精品酒店卫生间| av一本久久久久| 在线观看人妻少妇| 国产一区二区在线观看日韩| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲成色77777| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲伊人久久精品综合| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲av二区三区四区| 国产精品三级大全| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产毛片在线视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 欧美日韩综合久久久久久| 久久综合国产亚洲精品| 天堂网av新在线| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美3d第一页| 国产免费福利视频在线观看| av国产精品久久久久影院| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 中文字幕av成人在线电影| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产探花极品一区二区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲精品成人久久久久久| 韩国av在线不卡| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 麻豆成人av视频| 激情五月婷婷亚洲| 中文字幕久久专区| 日韩制服骚丝袜av| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久久亚洲精品成人影院| 一本一本综合久久| 色网站视频免费| 国精品久久久久久国模美| 国产精品国产av在线观看| 少妇的逼好多水| 亚洲图色成人| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 在线免费十八禁| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲无线观看免费| 亚洲国产欧美人成| 免费少妇av软件| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲国产成人一精品久久久| 午夜日本视频在线| 久久久久精品性色| 国产女主播在线喷水免费视频网站| videossex国产| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产成人免费观看mmmm| 18禁动态无遮挡网站| 久久国产乱子免费精品| 51国产日韩欧美| 人妻夜夜爽99麻豆av| 午夜福利视频1000在线观看| 成年版毛片免费区| 偷拍熟女少妇极品色| 日韩一区二区视频免费看| 国产一区亚洲一区在线观看| videos熟女内射| 久久久久久久久大av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 成人国产麻豆网| 亚洲图色成人| 久久久久精品久久久久真实原创| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 久久久欧美国产精品| 欧美日韩视频精品一区| 免费看日本二区| 一区二区三区精品91| 激情五月婷婷亚洲| 欧美日韩亚洲高清精品| 日韩精品有码人妻一区| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 最近的中文字幕免费完整| 精品国产露脸久久av麻豆| 午夜福利视频精品| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美性感艳星| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲人成网站在线观看播放| 高清av免费在线| 联通29元200g的流量卡| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国国产精品蜜臀av免费| 成人美女网站在线观看视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 精品人妻视频免费看| 成人鲁丝片一二三区免费| 免费看a级黄色片| 国产精品99久久99久久久不卡 | 欧美成人a在线观看| 国产成人freesex在线| 欧美一区二区亚洲| 看黄色毛片网站| 偷拍熟女少妇极品色| 特级一级黄色大片| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产精品久久久久久久电影| 亚洲综合精品二区| 欧美最新免费一区二区三区| 成人无遮挡网站| 免费观看av网站的网址| 老司机影院成人| 国产成人精品久久久久久| 插阴视频在线观看视频| 老司机影院毛片| 亚洲国产精品成人综合色| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲最大成人av| 中国美白少妇内射xxxbb| 激情 狠狠 欧美|