副干酪乳桿菌Q-1-4的篩選鑒定及抗菌物質(zhì)特性分析

林曉龍，佳木泰，郭海燕，王全喜，芒 來(lái)，賀銀鳳，吳 敬,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

副干酪乳桿菌Q-1-4的篩選鑒定及抗菌物質(zhì)特性分析

林曉龍1，佳木泰2，郭海燕1，王全喜2，芒 來(lái)2，賀銀鳳1，吳 敬1,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

為獲得應(yīng)用潛力較高的抗菌菌株，對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中分離的8 株乳酸桿菌進(jìn)行抗菌菌株篩選，獲得了一株具有廣譜抗菌活性的菌株（編號(hào)為Q-1-4）。經(jīng)常規(guī)生理生化及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，鑒定該菌為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）。通過(guò)實(shí)驗(yàn)排除有機(jī)酸和過(guò)氧化氫干擾后，L. paracasei Q-1-4發(fā)酵離心后的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液（cell-free fermentation supernatant，CFS）對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌Salmonella typhimurium CMCC50115仍具有抑制作用，且經(jīng)蛋白酶處理后抗菌活性下降，說(shuō)明L. paracasei Q-1-4所產(chǎn)抗菌物質(zhì)中含有蛋白類(lèi)物質(zhì)。其在pH 2.0～5.5范圍內(nèi)對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌有抑制作用，且在此pH值范圍內(nèi)該抗菌物質(zhì)對(duì)熱穩(wěn)定，對(duì)紫外線(xiàn)不敏感；與十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸共同作用效果好于單一作用，而其他的表面活性劑、有機(jī)溶劑、金屬離子對(duì)其無(wú)明顯影響；該抗菌物質(zhì)具有一定的貯藏穩(wěn)定性且抑菌譜較廣。

副干酪乳桿菌；抗菌物質(zhì)；特性

近年來(lái)從干酪乳桿菌中劃分出一個(gè)新種即副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），但對(duì)其在分類(lèi)學(xué)中的地位一直存有爭(zhēng)議。L. paracasei具有耐酸和耐膽鹽能力，某些菌株還有抗過(guò)敏作用，能夠調(diào)節(jié)人體腸道菌群平衡、增強(qiáng)免疫功能、預(yù)防疾病等。另外，許多研究表明，在發(fā)酵干酪成熟的過(guò)程中，L. paracasei可以控制并促進(jìn)幾種重要的芳香物質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)形成[1-4]， 改善乳制品質(zhì)量。

目前對(duì)L. paracasie的研究多數(shù)集中在利用其益生特性開(kāi)發(fā)新的乳制品方面，對(duì)其產(chǎn)生的細(xì)菌素的研究相對(duì)較少。Sa等[5]從生驢奶中分離篩選得到了1 株L. paracasei，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了這株菌的細(xì)菌素粗提物對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌Salmonella typhi有很強(qiáng)的抑制作用，其最小抑菌濃度為128 μL/mL；Hassan等[6]發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌堅(jiān)韌亞種L. paracasei ssp. tolerans L17不但可以作為酸面包發(fā)酵劑，而且還可以有效地抑制層生鐮刀菌Fusarium proliferatum M5689，禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum R4053和白曲霉Aspergillium candidus C25等產(chǎn)毒素真菌。Lozo等[7]通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)，從塞爾維亞高原地區(qū)自然發(fā)酵的半硬質(zhì)干酪中分離得到的一株L. paracasei subsp. paracasei BGSJ2-8，能夠產(chǎn)生第2類(lèi)細(xì)菌素BacSJ，是一種具有熱穩(wěn)定性的未經(jīng)修飾的的小分子肽。這些資料表明L. paracasei具有產(chǎn)生具有抑菌作用的蛋白類(lèi)細(xì)菌素。L. paracasei所產(chǎn)細(xì)菌素具有很多優(yōu)良特性，具有天然食品防腐劑的潛力，如某些菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素在pH 3～12均有抑菌活性，對(duì)熱有極好的耐受性，在可在4 ℃條件下可貯藏6 個(gè)月或-20 ℃條件下貯藏長(zhǎng)達(dá)12 個(gè)月[8]。

本研究通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)對(duì)分離自?xún)?nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品中的乳酸桿菌進(jìn)行篩選，得到受試菌株L. paracasei Q-1-4，對(duì)其進(jìn)行生理生化和分子生物學(xué)鑒定，并確定所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的性質(zhì)，為開(kāi)發(fā)具有新型生物防腐劑功能的細(xì)菌素產(chǎn)生菌提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑

供試菌株：內(nèi)蒙古牧民家庭手工制作的酸馬奶樣品中分離得到8 株乳酸桿菌；其他11株菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院提供，分別為：Bacillus cerecus CGMCC1.1686、Geobacillus stearo thermophilus GMCC1.1923、Streptococcus thermophilus CICC6038、Staphylococcus aureus CMCC(B)26112、Micrococcus luteus CMCC(B)28001、Listeria monocytogenes CMCC54002、Bacillus subtilis CGMCC1(B)63501、Pseudomonas fluarescens CGMCC1.1802、Salmonella enterica subsp. enterica CGMCC1.1859、Escherichia coli ATCC25922、Salmonella typhimurium CMCC50115。

MRS液體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]方法配制，固體培養(yǎng)基均添加1.5%～2%的瓊脂。制備培養(yǎng)基使用的試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、過(guò)氧化氫酶、溶菌酶 美國(guó)Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；單盒生化鑒定管 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠(chǎng)；PB-10 pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HH.S1-Ni電熱恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠(chǎng)；BPG-9240A精密鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BCN-1360型生物超凈工作臺(tái) 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；KDC-140HR高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸桿菌的活化及無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液的制備

將半固體穿刺保存的實(shí)驗(yàn)菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，按2%接種量傳3代，將最后一代液體培養(yǎng)物在冷凍離心機(jī)中以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮10倍，0.45 μm孔徑的濾菌器過(guò)濾除菌，得無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，置于4 ℃保存?zhèn)溆肹11]。

1.3.2 指示菌菌懸液的制備

將保存的指示菌挑單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，以2%的接種量再活化兩代，第3代培養(yǎng)24 h后。用0.85%無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋至菌懸液濃度為106CFU/mL，置于4 ℃保存待用。

1.3.3 抑菌活性的測(cè)定

抑菌實(shí)驗(yàn)采用雙層瓊脂平板擴(kuò)散法[12]。以Salmonella typhimurium CMCC50115為指示菌，測(cè)待檢菌中是否具有抑菌活性。

1.3.4 產(chǎn)抗菌物質(zhì)乳酸桿菌的篩選及鑒定

1.3.4.1 菌株個(gè)體形態(tài)和生理生化鑒定

將半固體保存的實(shí)驗(yàn)菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)兩代。在固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng)，挑取單菌落，革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察形態(tài)并對(duì)篩選出的乳酸桿菌做生理生化實(shí)驗(yàn)和糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]和《乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[14]中描述的特征進(jìn)行分析鑒定。

1.3.4.2 分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)細(xì)菌基因組D N A提取試劑盒中說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總D N A提取，并以此D N A為模板，加入通用引物進(jìn)行P C R擴(kuò)增，正向引物為2 7 f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物為1495r：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR擴(kuò)增體系為25 μL：上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，Ex Taq mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，PCR的反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，58 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，30 次循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序及雙向拼接后，在NCBI上用BLAST模塊進(jìn)行同源性比對(duì)，獲得數(shù)據(jù)后使用DNAStar軟件中Megalign程序繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并進(jìn)行分析。

1.3.5 Q-1-4所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的確定

1.3.5.1 酸及酸性末端產(chǎn)物作用的排除

為排除酸性末端產(chǎn)物的干擾，將濃縮10倍的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液（cell-free fermentation supernatant，CFS）pH值調(diào)至5.0，以相同pH值的乳酸和乙酸為對(duì)照，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.5.2 過(guò)氧化氫作用的排除

乳酸桿菌代謝產(chǎn)生的過(guò)氧化氫也可抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[15]。將過(guò)氧化氫酶溶解并按終質(zhì)量濃度為1 mg/mL加入到排酸后的CFS中，37 ℃水浴2 h后沸水煮沸5 min使酶滅活，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.5.3 蛋白酶對(duì)抗菌物質(zhì)活性的影響

取5份等量的CFS，分別將pH值調(diào)至7.6、6.5、6.2、7.0、2.0，依次為胰蛋白酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶的最適pH值，按終質(zhì)量濃度1.0 mg/mL加入各酶液，37 ℃溫浴2 h后，沸水煮沸5 min使酶失活。將pH值調(diào)至排酸pH值，以未經(jīng)酶處理的CFS為對(duì)照，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 Q-1-4所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的特性測(cè)定

1.3.6.1 pH值穩(wěn)定性

分別用1 mol/L的HCl溶液和1 mol/L的NaOH溶液將CFS的pH值調(diào)為2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，以相同pH值的MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.6.2 熱穩(wěn)定性

將調(diào)至不同pH值的CFS分別于60、80、105、121 ℃條件下處理30 min，冰浴急冷后，以未溫度處理的CFS為對(duì)照，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.6.3 紫外線(xiàn)敏感性

取等量的CFS 加到滅菌平皿中，于40 W紫外燈下距離40 cm分別輻照不同時(shí)間，以未經(jīng)紫外處理的CFS為對(duì)照[16]，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.6.4 有機(jī)溶劑對(duì)抑菌活性的影響

按1.0%（V/V）添加甲醇、乙醇、丁醇、丙酮、氯仿到CFS中。以未經(jīng)有機(jī)溶劑處理的CFS、加入相同用量有機(jī)溶劑處理的MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照[16]，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.6.5 表面活性劑對(duì)抑菌活性的影響

按1.0%（V/V）添加Tween-20、Tween-80、 TritonX-100、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、尿素到CFS中。以未經(jīng)表面活性劑處理的CFS、加入相同用量表面活性劑處理的MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照[17]，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.6.6 金屬離子對(duì)抑菌活性的影響

將CFS與溶解在50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）中的不同金屬離子溶液分別按1∶1體積比混合。以未經(jīng)金屬離子處理但加入相同體積超純水的CFS及加入相同金屬離子濃度處理的MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照[18]，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.6.7 貯藏穩(wěn)定性

將CFS分別在25、4、-20 ℃條件下貯藏0、20、40、60 d，檢測(cè)不同溫度條件下貯藏不同時(shí)間后對(duì)指示菌抑菌活性的變化。

1.3.6.8 抑菌譜的測(cè)定

將不同的革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌活化3 代，第3代的培養(yǎng)菌數(shù)進(jìn)行梯度稀釋調(diào)節(jié)至106CFU/mL，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)抗菌物質(zhì)乳酸桿菌的篩選

表1 乳酸桿菌的抑菌活性Table1 Antimicrobial activity of the screened strains

表1結(jié)果顯示，8 株乳酸桿菌對(duì)S. typhimurium CMCC 50115均有抑制作用。但Q-1-4所產(chǎn)CFS對(duì)其的抑菌直徑較大，故選定菌株Q-1-4為最終實(shí)驗(yàn)菌株。

2.2 菌株個(gè)體形態(tài)和生理生化鑒定

菌株分離純化后，光學(xué)顯微鏡下菌體形態(tài)見(jiàn)圖1。菌株Q-1-4生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表2，表中這些生理生化特征與文獻(xiàn)[19]中描述的L. paracasei的特征相同，初步將菌株Q-1-4歸入L. paracasei。L. paracasei的分類(lèi)學(xué)地位一直飽受爭(zhēng)議。2007年，在公布的乳桿菌屬和種的分類(lèi)中，德國(guó)微生物與細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心將L. paracasei直接劃分為干酪乳桿菌菌群[20]。由于L. paracasei與鼠李糖乳桿菌以及干酪乳桿菌中的其他亞種具有很高的相似性，需要結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行鑒定。

圖1 菌株Q-1-4的菌體形態(tài)（10×100）Fig.1 Mycelial morphology of strain Q-1-4

表2 菌株Q-1-4的生理生化特征Table2 Physiological and biochemical characteristics of strain Q-1-4

2.3 分子生物學(xué)鑒定

以菌株Q-1-4的細(xì)菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為1 500 bp的16S rDNA堿基序列。與GenBank中已知菌株的基因序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果見(jiàn)表3，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。

表3 菌株Q-1-4的同源性比較Table3 Homology alignment of strain Q-1-4

由表3、圖2可直觀(guān)地看出實(shí)驗(yàn)菌株和已知菌的親緣關(guān)系，菌株Q-1-4與L. paracasei同源性均高達(dá)99.2%，在進(jìn)化樹(shù)中處于同一分支，由此可判定Q-1-4為L(zhǎng). paracasei，這同生理生化鑒定得到的結(jié)果一致，由此進(jìn)一步驗(yàn)證了菌株Q-1-4為L(zhǎng). paracasei。

圖2 菌株Q-1-4系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on the sequences of strain Q-1-4

2.4 L. paracasei Q-1-4產(chǎn)抗菌物質(zhì)的確定

2.4.1 酸與過(guò)氧化氫作用的排除

表4 酸與過(guò)氧化氫作用的排除Table4 Acids and hydrogen peroxide in CFS were not responsible for its antimicrobial activity

由表4可以看出，pH 5.0的乳酸、乙酸對(duì)S. typhimurium CMCC50115沒(méi)有抑制作用，而 pH 5.0的L. paracasei Q-1-4產(chǎn)生的CFS對(duì)其有明顯的抑制作用，說(shuō)明CFS的抑菌活性不是由有機(jī)酸引起的，仍然存在其他的抗菌物質(zhì)。CFS經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理后，抑菌能力比未處理的CFS略有下降，但還存在較強(qiáng)的抑菌作用，從而說(shuō)明CFS中的過(guò)氧化氫不是主要的抗菌物質(zhì)，還有另其他物質(zhì)對(duì)指示菌起抑制作用。

2.4.2 蛋白酶對(duì)抗菌物質(zhì)抑菌活性的影響

表5 抗菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶的敏感性Table5 Sensitivity of the antimicrobial substances of strain Q-1-4 to protease

由表5可以看出，CFS經(jīng)過(guò)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶處理之后對(duì)指示菌的抑菌活性分別下降了25.79%、19.50%、22.80%、25.73%，且顯著差異，根據(jù)Luo Fan等[21]的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定CFS含有對(duì)蛋白酶敏感的蛋白類(lèi)物質(zhì)或肽類(lèi)抗菌物質(zhì)。而經(jīng)過(guò)溶菌酶處理之后抑菌活性沒(méi)有明顯變化，仍具有抑菌活性，原因可能是L. paracasei Q-1-4所產(chǎn)抗菌物質(zhì)不僅僅含有蛋白類(lèi)物質(zhì)，還有其他具有抑菌效果的代謝產(chǎn)物，如胞外多糖[22]等。

2.5 L. paracasei Q-1-4所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的特性

2.5.1 pH值穩(wěn)定性

表6 抗菌物質(zhì)的pH值穩(wěn)定性Table6 pH Stability of the antimicrobial activity

由表6可知，與空白對(duì)照比較，L. paracasei Q-1-4產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在pH 2.0～5.5時(shí)對(duì)指示菌有抑制作用，但抑菌活性隨pH值升高而逐漸降低，pH 3.0、4.0、4.5、5.0、5.5分別較pH 2.0時(shí)活性下降了3.2%、13.72%、27.82%、43.81%、53.35%，當(dāng)pH值大于5.5時(shí)對(duì)指示菌的抑菌作用消失，這可能是由于pH值既是肽鏈上氨基質(zhì)子化程度的決定性因素，同時(shí)也間接地影響著乳酸菌素在介質(zhì)中的溶解性并影響該細(xì)菌素對(duì)指示菌的表面吸附作用，因而pH值對(duì)乳酸菌素的活性會(huì)產(chǎn)生影響[23]。該抗菌物質(zhì)在pH 2.0時(shí)抑菌活性較強(qiáng)，所以它適合應(yīng)用于偏酸性食品中，不同于周佳等[24]認(rèn)為的pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響細(xì)菌素結(jié)構(gòu)，從而降低或喪失抑菌活性，本實(shí)驗(yàn)表明細(xì)菌素產(chǎn)生的最佳pH值條件具有一定的菌株特異性[25]。

2.5.2 熱穩(wěn)定性

表7 抗菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性Table7 Thermal stability of the antimicrobial substance

從表7可以看出，CFS在同一處理溫度、不同pH值條件下，隨著pH值的升高抑菌活性逐漸下降，且有顯著差異，與2.5.1節(jié)結(jié)果相一致，這與許多細(xì)菌素相似，如Mason等[23]研究了含有組氨酸的陽(yáng)離子型抑菌肽在中性條件下的抑菌性一般，而在酸性條件下的抑菌性會(huì)增強(qiáng)很多。

CFS在同一pH值、不同處理溫度條件下，隨著處理溫度的升高，抑菌活性逐漸降低。選取抑菌活性最高的pH 2.0時(shí)，60、80、105、121 ℃處理后分別較5 ℃時(shí)的活性下降了1.91%、2.69%、3.1%、5.13%，這可能是由于高pH值環(huán)境會(huì)脅迫細(xì)菌素的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生變化，從而導(dǎo)致抑菌活性下降。但總體來(lái)說(shuō)，該抗菌物質(zhì)表現(xiàn)出了良好的熱穩(wěn)定性，Miao Jianxin等[26]從L. paracasei subsp. tolerans FX-6菌株中分離出的新型細(xì)菌素同樣耐高溫。耐高溫是抗菌物質(zhì)的有利優(yōu)點(diǎn)，食品經(jīng)巴氏殺菌處理后，其抑菌活性不受影響。

2.5.3 紫外線(xiàn)敏感性

表8 抗菌物質(zhì)對(duì)紫外線(xiàn)的敏感性Table8 Ultraviolet sensitivity of the antimicrobial substances

由表8可知，經(jīng)紫外線(xiàn)輻照不同時(shí)間的抗菌物質(zhì)的抑菌活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異，說(shuō)明L. paracasei Q-1-4所產(chǎn)抗菌物質(zhì)對(duì)紫外線(xiàn)不敏感。由于有些食品不耐高溫高壓殺菌，便可以通過(guò)紫外殺菌的方式來(lái)達(dá)到滅菌的目的，且該抗菌物質(zhì)對(duì)紫外有良好的耐受性，為其應(yīng)用到食品生產(chǎn)和銷(xiāo)售環(huán)節(jié)提供了有力的依據(jù)。

2.5.4 有機(jī)溶劑對(duì)抑菌活性的影響

表9 有機(jī)溶劑對(duì)抑菌活性的影響Table9 Effect of organic solvents on the inhibitory activities

由表9可知，上述有機(jī)溶劑對(duì)CFS的抑菌活性沒(méi)有明顯影響，說(shuō)明該抗菌物質(zhì)對(duì)有機(jī)溶劑具有良好的耐受性。與Mi等[27]的研究結(jié)果相一致。

2.5.5 表面活性劑對(duì)抑菌活性的影響由表10可知，經(jīng)表面活性劑處理的CFS的抑菌活性沒(méi)有明顯影響。L. paracasei Q-1-4所產(chǎn)抗菌物質(zhì)與EDTA

表10 表面活性劑對(duì)抑菌活性的影響Table10 Effect of surfactants on the antimicrobial activity

共同作用效果好于單一作用，說(shuō)明EDTA對(duì)抗菌物質(zhì)有一定的協(xié)同增效作用且效果顯著（P＜0.05）。EDTA是一種金屬離子的螯合劑，它可以與介質(zhì)中的金屬離子通過(guò)共價(jià)鍵相結(jié)合，消耗溶液中的金屬離子，從而增強(qiáng)乳酸菌素的抑菌活性[28]。

2.5.6 金屬離子對(duì)抑菌活性的影響

表11 金屬離子對(duì)抑菌活性的影響Table11 Effect of metal ions on the antimicrobial activity

由表11所示，上述二價(jià)金屬離子對(duì)CFS的抑菌活性并沒(méi)有明顯影響（P＞0.05），說(shuō)明對(duì)上述金屬離子有一定的耐受性。

2.5.7 貯藏穩(wěn)定性

圖3 抑菌活性在貯藏過(guò)程中的變化Fig.3 Effect of storage temperature on the antimicrobial activity

由圖3可以看出，CFS貯藏20 d后，其抑菌活性基本沒(méi)有明顯的變化。40 d后，抑菌活性略微降低一點(diǎn)，基本保持穩(wěn)定。60 d 后，其抑菌活性均有不同程度的降低，其中-20 ℃的損失最小，具體機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究?？梢?jiàn)L. paracasei Q-1-4所產(chǎn)抗菌物質(zhì)在貯藏過(guò)程中對(duì)冷凍和冷藏有較好的耐受性，且冷凍比冷藏效果更好。韓雪等[29]曾提出冷凍比冷藏對(duì)乳酸片球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素活性的損害小，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類(lèi)似。

2.5.8 抑菌譜的測(cè)定結(jié)果

由表12可以得出，L. paracasei Q-1-4所產(chǎn)抗菌物質(zhì)對(duì)所選的指示菌均顯示了較強(qiáng)的抑菌活性，其中對(duì)Bacillus cerecus CGMCC1.1686、Geobacillus stearo thermophilus GMCC1.1923、Micrococcus luteus CMCC(B)28001、 Listeria monocytogenes CMCC54002、Bacillus subtilis CGMCC1(B)63501、Salmonella typhimurium CMCC50115這6 株指示菌顯示了很強(qiáng)的抑菌活性，抑菌圈直徑達(dá)到16 mm以上；對(duì)其他的指示菌（Streptococcus thermophilus CICC6038、Staphylococcus aureus CMCC(B)26112、Pseudomonas fluarescens CGMCC1.1802、Salmonella enterica subsp. enterica CGMCC1.1859、Escherichia coli ATCC25922）均顯示了較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌圈直徑為13～16 mm，其中陳飛龍等[30]已經(jīng)對(duì)L. paracasei FX-6對(duì)Staphylococcus aureus的抑菌機(jī)理做了一定的解釋?zhuān)呵罢咚置诘目咕哪芘c后者細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，阻礙其遺傳信息正常表達(dá)繼而使相應(yīng)的大分子產(chǎn)物活性減弱，使生長(zhǎng)代謝無(wú)法順利進(jìn)行。L. paracasei Q-1-4對(duì)包括食品常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌均有良好的抑制作用，與馬迎濤[31]所研究的L. paracasei S-2相似。

表12 L. paracasei Q-1-4所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的抑菌譜Table12 Antimicrobial spectrum of the antimicrobial substances from L. paracaseiQ-1-4

3 結(jié) 論

采用雙層瓊脂平板擴(kuò)散法，從分離自?xún)?nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品的8 株乳酸桿菌中篩選出有較好抑菌效果的菌株Q-1-4，通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)和分子學(xué)鑒定認(rèn)定為L(zhǎng). paracasei。

將L. paracasei Q-1-4所產(chǎn)抗菌物質(zhì)經(jīng)排酸、排過(guò)氧化氫后對(duì)S. typhimurium CMCC50115仍具有明顯的抑制作用，且經(jīng)過(guò)不同蛋白酶處理后，抑菌活性均有不同程度的下降，說(shuō)明該抗菌物質(zhì)中含有蛋白類(lèi)物質(zhì)。L. paracasei Q-1-4所產(chǎn)抗菌物質(zhì)在pH值小于5.5范圍內(nèi)對(duì)S. typhimurium CMCC50115有抑制作用。在此pH值范圍內(nèi)抗菌物質(zhì)對(duì)熱有耐受性，對(duì)紫外不敏感，耐貯藏，有機(jī)溶劑、金屬離子、表面活性劑對(duì)其影響不顯著，但與EDTA共同作用效果好于單一作用。且L. paracasei Q-1-4所產(chǎn)抗菌物質(zhì)抑菌譜較廣。

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Screening and Identif i cation of Lactobacillus paracasei Q-1-4 and Analysis of Antimicrobial Substances Produced by It

LIN Xiaolong1, JIA Mutai2, GUO Haiyan1, WANG Quanxi2, MANG Lai2, HE Yinfeng1, WU Jing1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

To isolate Lactobacillus with great application potential from traditional homemade dairy products in Inner Mongolia, eight strains of Lactobacillus were screened for their antimicrobial activity. Strain Q-1-4 was found to have a broad spectrum of antimicrobial activity and was identif i ed as Lactobacillus paracasei by physiological and biochemical characterization and 16S rDNA sequencing analysis. The antimicrobial activity of the cell-free culture supernatant (CFS) of L. paracasei Q-1-4 against Salmonella typhimurium CMCC50115 still existed after eliminating the interference factors such as lactic acid, acetic acid, and hydrogen peroxides. However, the CFS of L. paracasei Q-1-4 was inactivated after treatment with proteolytic enzymes. Inhibitory activity of the CFS against S. typhimurium CMCC50115 was observed in the pH range from 2.0 to 5.5. The antimicrobial substance had good thermal stability in this pH range and was not sensitive to ultraviolet. SDS and EDTA could enhance the antimicrobial activity, but surfactants, organic solvents and metal ions had no effect on the antimicrobial activity. In addition, the antibacterial activity had good storage stability with a broad inhibitory spectrum.

Lactobacillus paracasei; antimicrobial activity; characteristics

10.7506/spkx1002-6630-201704003

TS201.4

A

1002-6630（2017）04-0013-07

林曉龍, 佳木泰, 郭海燕, 等. 副干酪乳桿菌Q-1-4的篩選鑒定及抗菌物質(zhì)特性分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 13-19.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704003. http://www.spkx.net.cn

LIN Xiaolong, JIA Mutai, GUO Haiyan, et al. Screening and identif i cation of Lactobacillus paracasei Q-1-4 and analysis of antimicrobial substances produced by it[J]. Food Science, 2017, 38(4): 13-19. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704003. http://www.spkx.net.cn

2016-06-30

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31260391）；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014MS0392）；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（BJ2013D-19；BJ2014D-20）

林曉龍（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c分子生物學(xué)。E-mail：nevsaynev3@163.com

*通信作者：吳敬（1969—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)及功能食品。E-mail：wujing2003825@163.com