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    馬鈴薯干腐病拮抗菌Pseudomonas sp.YL11發(fā)酵液理化性質(zhì)測(cè)定及發(fā)酵條件優(yōu)化

    2017-03-27 11:32:27張紊瑋王艷玲贠建民
    中國(guó)食品工業(yè) 2017年11期
    關(guān)鍵詞:干腐病生物防治氮源

    張紊瑋,王艷玲,贠建民

    1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅 蘭州 730070;2.蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅 蘭州 730050

    馬鈴薯干腐病是一種由鐮刀菌引起的田間和儲(chǔ)藏期都普遍發(fā)生的病害,主要引起塊莖腐爛,致使馬鈴薯品質(zhì)降低,嚴(yán)重影響了其食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值 [1]。我國(guó)是馬鈴薯生產(chǎn)大國(guó),隨著“馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略”的提出,馬鈴薯種植面積在逐年擴(kuò)大,干腐病的發(fā)生也越來(lái)越嚴(yán)重,常年發(fā)病率高達(dá)30%,由此造成馬鈴薯產(chǎn)量損失40%-50%[2]。甘肅是我國(guó)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)之一,硫色鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和接骨木鐮刀菌是造成馬鈴薯干腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌[3,4]。目前,對(duì)馬鈴薯干腐病以化學(xué)防治為主,化學(xué)農(nóng)藥雖然短期有效,但長(zhǎng)期反復(fù)施用,會(huì)造成藥劑殘留、產(chǎn)生耐藥性菌株以及環(huán)境污染等問(wèn)題而逐漸受到限制[5,6]。因此,使用高效、合理、環(huán)保的方法控制病害的發(fā)生顯得尤為重要,生物防治便成了國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[7-9]。

    生物防治在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中是一種很有前景的防治方法,這種從自然界中分離、篩選有益微生物并用于病原菌的拮抗、病害控制的防治方法,具有高效、無(wú)毒、無(wú)殘留等特點(diǎn)[10]。拮抗菌株用于生物防治時(shí),首先要考慮該菌株易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),同時(shí)要求菌劑具有穩(wěn)定性好、活性高、環(huán)保等特點(diǎn)[11-13]。為此,本試驗(yàn)以前期分離獲得的一株對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌——硫色鐮刀菌有拮抗作用的Pseudomonas sp.YL11為研究對(duì)象,進(jìn)行發(fā)酵液抑菌成分理化性質(zhì)的探索,并以LB培養(yǎng)基作為YL11菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,通過(guò)添加輔助碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽,對(duì)溫度、pH值、轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量及培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,旨在為該菌株的田間應(yīng)用和活性產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)提供必要的前期基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株

    菌株P(guān)seudomonas sp.YL11為甘肅定西地區(qū)馬鈴薯根際土壤中分離獲得;供試病原真菌硫色鐮刀菌(Fusarium sulphureum)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)采后生物學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏。

    1.2 培養(yǎng)基

    PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL,pH自然,121℃高壓滅菌20min。

    LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、瓊脂15g、蒸餾水1000mL,pH7.0,121℃高壓滅菌20min。

    LB液體培養(yǎng)基:LB固體培養(yǎng)基中不加瓊脂。

    1.3 方法

    1.3.1 預(yù)處理

    1.3.1.1 指示菌的活化

    將在PDA培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)7d的F. sulphureum用無(wú)菌水沖洗孢子,制備孢子懸浮液,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),調(diào)整孢子濃度為1.5×105CFU/mL,分裝至1mL,無(wú)菌離心管中于4℃保存,一周內(nèi)使用[14]。

    1.3.1.2 供示菌的活化

    將-20℃保藏Pseudomonas sp.YL11菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃線,30℃培養(yǎng)48h,挑單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)24h,反復(fù)傳代接種培養(yǎng)3~4次。

    1.3.1.3 無(wú)菌發(fā)酵液的制備

    Pseudomonas sp.YL11發(fā)酵液10000r/min離心15min后,收集上清液即為發(fā)酵上清液。將上清液用0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾,收集濾液即為無(wú)菌發(fā)酵液。

    1.3.2 菌株P(guān)seudomonas sp. YL11代謝產(chǎn)物理化性質(zhì)測(cè)定

    1.3.2.1 熱穩(wěn)定性測(cè)定

    將發(fā)酵液分別置于30℃,50℃,60℃,70℃,80℃,90℃,100℃下處理30min,未經(jīng)處理的發(fā)酵液作對(duì)照,以F.sulphureum為指示菌,牛津杯法測(cè)抑菌活性。

    1.3.2.2 pH穩(wěn)定性測(cè)定

    將發(fā)酵液用0.5M HCl和0.5M NaOH處理依次調(diào)節(jié)pH至3,4,5,6,7,8,9,10,靜置2h后將pH調(diào)回自然pH(原始發(fā)酵液pH值為7),未經(jīng)處理的發(fā)酵液作對(duì)照,以F. sulphureum為指示菌,牛津杯法測(cè)抑菌活性。

    1.3.2.3 紫外光照穩(wěn)定性測(cè)定

    將發(fā)酵液分裝于1.5mL離心管中置于20W紫外燈下距離20cm處敞口照射1h,2h,4h,6h,8h,10h,12h后,未經(jīng)處理的發(fā)酵液作對(duì)照,以F. sulphureum為指示菌,牛津杯法測(cè)抑菌活性。

    1.3.3 培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

    在LB培養(yǎng)基中,以酵母提取物為基本碳源物質(zhì),分別添加1%的其他碳源物質(zhì)(葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、麥芽糖);以蛋白胨為基本氮源物質(zhì),分別添加1%其他氮源物質(zhì)(尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨);以氯化鈉為基本無(wú)機(jī)鹽,分別添加0.5%其他無(wú)機(jī)鹽(氯化鉀、硫酸鎂、氯化鎂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉),以不額外添加碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的LB液體培養(yǎng)基作對(duì)照,30℃,120r/min振蕩培養(yǎng)4d后,測(cè)定發(fā)酵上清液對(duì)F. sulphureum的抑菌活性,每個(gè)處理重復(fù)3次。

    1.3.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

    在上述最佳培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,在裝液量為30mL/100mL、轉(zhuǎn)速120r/min和30℃條件下分別改變培養(yǎng)基的發(fā)酵時(shí)間(12h、24h、36h、48h、60h、72h、96h、100h、120h)、發(fā)酵溫度(25℃、28℃、30℃、37℃、40℃)和初始pH值(pH5、pH5.5、pH6、pH6.5、pH7、pH7.5、pH8),以發(fā)酵液對(duì)F. sulphureum的抑菌活性為指標(biāo),確定最佳發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和pH值。在篩選出最佳pH值、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的條件下改變接種量(1%、3%、5%、7%、9%)、裝液量(10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50mL/100mL)、轉(zhuǎn)速(100、120、150、180r/min),以發(fā)酵液對(duì)F. sulphureum的抑菌活性為指標(biāo),確定最佳接種量、裝液量和轉(zhuǎn)速。同時(shí)用分光光度法測(cè)定波長(zhǎng)600nm處的吸光度值,每個(gè)處理重復(fù)3次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 發(fā)酵液理化性質(zhì)

    2.1.1 熱穩(wěn)定性

    YL11發(fā)酵液代謝產(chǎn)物具有較好的熱穩(wěn)定性,經(jīng)過(guò)30℃-50℃各處理30min后活性基本保持穩(wěn)定,60℃-80℃各處理30min活性略有降低,抑菌活性為對(duì)照的90.1%-87.3%。90℃-100℃各處理30min活性下降的比較明顯,抑菌活性為對(duì)照的63.9%-59.1%。

    2.1.2 pH穩(wěn)定性

    在pH值低于4時(shí),發(fā)酵液抑菌活性完全喪失,表明發(fā)酵液代謝產(chǎn)物對(duì)酸敏感;pH4-5范圍和pH9-10范圍內(nèi)活性均有降低,抑菌活性為對(duì)照的45.1%-88.7%。pH6-8的范圍內(nèi)活性保持穩(wěn)定,說(shuō)明YL11適合于中性或弱堿性環(huán)境,分離純化的最佳pH為6-8之間。

    2.1.3 紫外光照穩(wěn)定性

    在紫外光下連續(xù)照射12h后,YL11發(fā)酵液活性基本保持不變,抑菌活性仍然能達(dá)到對(duì)照的83.7%,表明YL11發(fā)酵液具有良好的紫外光照穩(wěn)定性。

    2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

    由圖1可見(jiàn),葡萄糖作為輔助碳源時(shí)發(fā)酵液的抑菌活性最高,抑菌圈直徑達(dá)到26.7mm,利用麥芽糖和蔗糖的發(fā)酵液抑菌活性相當(dāng)不存在顯著性差異p>0.05,抑菌圈分別為25.2mm和24.9mm,其次是淀粉。表明YL11利用單糖的能力要強(qiáng)于二糖和多糖,所以選擇葡萄糖為最佳碳源。

    由圖2可見(jiàn),當(dāng)磷酸二氫銨作為輔助氮源時(shí),發(fā)酵液抑菌活性最大,抑菌圈直徑為28.0mm,表明對(duì)磷酸二氫銨的利用效率最高。尿素最低,抑菌圈直徑為22.9mm,甚至低于LB基本培養(yǎng)基對(duì)照(25.4mm),可能尿素不利于YL11對(duì)氮源的利用或者產(chǎn)生了其他化學(xué)物質(zhì)抑制了其抑菌活性產(chǎn)物的活性。

    由圖3可見(jiàn),當(dāng)硫酸鎂作為輔助無(wú)機(jī)鹽時(shí),抑菌活性最高,抑菌圈直徑達(dá)到29.7mm,所以選擇硫酸鎂為發(fā)酵液的無(wú)機(jī)鹽。因此,以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,確定YL11的最佳配方組成為:葡萄糖1%,酵母提取物0.5%,蛋白胨1%,磷酸二氫銨1%,氯化鈉1%,硫酸鎂0.5%。抑菌圈大小為29.7mm,采用傳統(tǒng)LB培養(yǎng)基,抑菌圈大小為25.4mm,由此可見(jiàn),培養(yǎng)基優(yōu)化后能明顯提高發(fā)酵液的抑菌活性。

    圖2 不同氮源對(duì)YL11抑菌活性的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on the antagonistic activity of YL11

    圖3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)YL11抑菌活性的影響Fig.3 Effect of inorganic salt on the antagonistic activity of YL11

    2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

    由圖4可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),抑菌活性逐步增大,發(fā)酵時(shí)間為100h時(shí),抑菌活性最高,抑菌圈直徑為30.7mm,而后隨著時(shí)間延長(zhǎng)抑菌活性逐漸下降。發(fā)酵時(shí)間短,抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量低,抑菌性能低;發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng),抑菌活性也逐漸下降,可能原因是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),YL11菌體的大量繁殖及營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的逐步消耗,菌體開(kāi)始衰老、自溶,所以確定發(fā)酵時(shí)間為100h。

    圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)YL11生長(zhǎng)及抑菌活性的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the growth and antagonistic activity of YL11

    由圖5可知,YL11菌株在25℃-40℃時(shí)均可產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)。在28℃時(shí),抑菌活性最大,抑菌圈直徑為30.7mm,37℃及40℃時(shí),抑菌活性均有降低,這可能是溫度升高不利于YL11菌體生長(zhǎng)所致。所以確定發(fā)酵溫度為28℃。

    由圖6可知,發(fā)酵液初始pH在5和8時(shí)對(duì)活性物質(zhì)的影響較小,當(dāng)初始發(fā)酵液pH為7時(shí)抑菌活性最大,抑菌圈直徑為30.7mm,在弱酸及弱堿條件下抑菌活性均有輕微下降。所以確定發(fā)酵pH為7。

    圖5 溫度對(duì)YL11生長(zhǎng)及抑菌活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the growth and antagonistic activity of YL11

    圖6 不同初始pH值對(duì)YL11生長(zhǎng)及抑菌活性的影響Fig.6 Effect of initial pH on the growth and antagonistic activity of YL11

    由圖7可知,YL11發(fā)酵液的接種量在1%-9%范圍內(nèi)均能達(dá)到較高的抑菌效果,當(dāng)接種量為3%時(shí)抑菌圈直徑最大,達(dá)到30.7mm,接種量大于3%時(shí),菌株生物量及抑菌活性開(kāi)始逐漸降低,確定接種量為3%。

    由圖8可知,在100mL的錐形瓶中裝液量為30mL,發(fā)酵液抑菌活性最強(qiáng),隨著裝液量的增加,發(fā)酵液抑菌活性逐漸降低,說(shuō)明搖瓶?jī)?nèi)空氣含量對(duì)YL11產(chǎn)活性代謝產(chǎn)物影響較大,但過(guò)低的裝液量會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足菌體生物量下降進(jìn)而影響抑菌活性。所以確定裝液量為30ml。

    圖7 接種量對(duì)YL11生長(zhǎng)及抑菌活性的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on the growth and antagonistic activity of YL11

    圖8 裝液量對(duì)YL11生長(zhǎng)及抑菌活性的影響Fig.8 Effect of liquid volume on the growth and antagonistic activity of YL11

    由圖9可知,YL11菌株的生物量隨轉(zhuǎn)速的增加先增加后減少,在轉(zhuǎn)速120r/min時(shí)生物量和抑菌活性均達(dá)到峰值,轉(zhuǎn)速進(jìn)一步增大菌體生物量略有下降,抑菌活性略有升高,表明高轉(zhuǎn)速對(duì)菌體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞從而導(dǎo)致活性物質(zhì)釋放。120r/min-180r/min均不存在顯著性差異p>0.05,綜合考慮,選擇120r/min為最佳搖床轉(zhuǎn)速。

    圖9 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)YL11生長(zhǎng)及抑菌活性的影響Fig.9 Effect of rotational speed on the growth and antagonistic activity of YL11

    3 結(jié)論與討論

    本研究以前期分離獲得的一株對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌——F. sulphureum有拮抗作用的Pseudomonas sp.YL11為研究對(duì)象,對(duì)發(fā)酵液理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定,并以LB培養(yǎng)基作為YL11菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,通過(guò)添加輔助碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽,對(duì)溫度、pH值、轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量及培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

    結(jié)果表明:YL11抑菌活性成分具有較好的熱穩(wěn)定性,經(jīng)過(guò)30℃-50℃各處理30min后活性基本保持穩(wěn)定,60℃-80℃各處理30min活性略有降低,抑菌活性為對(duì)照的90.1%-87.3%;pH6-8的范圍內(nèi)活性保持穩(wěn)定,適合于中性或弱堿性環(huán)境;紫外燈照12h后抑菌活性基本不變,仍然能達(dá)到對(duì)照的83.7%,具有良好的紫外光照穩(wěn)定性。

    最佳培養(yǎng)基配方為:葡萄糖1%,酵母提取物0.5%,蛋白胨1%,NH4H2PO4 1%,NaCl 1%,MgSO4 0.5%,發(fā)酵溫度28℃,初始pH7,接種量3%,裝液量30 mL /100mL,搖床轉(zhuǎn)速120r/min,發(fā)酵時(shí)間100h,在此條件下發(fā)酵上清液對(duì)F. sulphureum的抑菌活性最強(qiáng),抑菌圈直徑達(dá)到30.7mm,與優(yōu)化前25.4mm相比,顯著提高了抑菌效果,為今后工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和參考。本研究?jī)H探討了拮抗菌株發(fā)酵培養(yǎng)的條件及其影響因素,我們今后將對(duì)抑菌機(jī)制及活性物質(zhì)的分離提取進(jìn)行系統(tǒng)的研究,為馬鈴薯干腐病的生物防治打下基礎(chǔ)。

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