齊口裂腹魚骨膠原蛋白超聲波輔助提取工藝及其特性研究

嚴秋萍 - 鄔應龍 - 李月娥 - 蔣 艷 郭玉春 - 秦 濤

(四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014)

膠原蛋白是動物的主要結構蛋白，具有支撐器官、保護機體的作用[1]。膠原蛋白右旋三股超螺旋結構使其具有較強的拉伸強度[2]，其功能具有多樣性和復雜性[3]。膠原蛋白主要分布在動物的骨、軟骨和皮膚等組織中[4]，從水產(chǎn)動物中提取的膠原蛋白比陸生動物性膠原蛋白更安全，具有廣闊的開發(fā)前景[5]，可廣泛應用于食品、化妝品及生物制品的生產(chǎn)中[6-8]。齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)屬鯉形目，鯉科，裂腹魚亞科，裂腹魚屬，裂腹魚亞屬，主要分布于長江上游、大渡河、青衣江和漢江的上游，是產(chǎn)區(qū)名貴的經(jīng)濟魚類[9]。齊口裂腹魚肉質(zhì)細嫩，肉色雪白，味道鮮美，頗受大眾消費者的喜愛[10]。但目前對其魚骨的應用還鮮有報道，如不加以有效的利用將會造成資源的浪費和環(huán)境的污染。

研究[11]發(fā)現(xiàn)，一定濃度的酸液可破壞蛋白質(zhì)分子之間的氫鍵，引起膠原纖維膨脹、溶解，使膠原蛋白從原料中釋放出來，常用來提取膠原蛋白的酸有檸檬酸、鹽酸、乙酸、乳酸等。劉娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)以濃度為0.54 mol/L的乙酸為提取劑，在溫度36.4 ℃，液料比51∶1 (mL/g)條件下提取齊口裂腹魚皮中的膠原蛋白36 h，提取率可達67.26%。吳緹等[13]分別用檸檬酸與乙酸作為提取劑提取斑點叉尾鮰魚骨膠原蛋白，結果顯示2種方法提取的膠原蛋白提取率無顯著差異，但乙酸提取的膠原蛋白具有刺鼻的酸味。王林等[14]采用超聲波輔助提取深海紅魚膠原蛋白，結果表明膠原蛋白的提取時間縮短了30 h。

目前，中國對冷水魚膠原蛋白提取方法的研究較少，主要是借鑒陸生動物膠原蛋白的提取方法[15]，如酸法提取和酶法提取，提取效率低且受環(huán)境因素影響較大。超聲提取技術是通過機械破碎和空化作用促進浸提物向提取劑中擴散，具有能耗低、提取率高等優(yōu)點[16]。本試驗擬采用超聲波輔助的方法以檸檬酸作為提取劑，探討齊口裂腹魚骨膠原蛋白的提取方法，并對純化的魚骨膠原蛋白特性進行分析，為魚骨膠原蛋白的提取和應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

齊口裂腹魚：購買于雅安市天全縣齊口裂腹魚養(yǎng)殖場，體重為(80.58±3.06) g，取其脊椎骨作為試驗材料，放入保鮮袋，-20 ℃凍藏貯存，備用。

1.2 試劑及儀器

L-羥脯氨酸標準品：含量≥99%，美國Sigma公司；

濃鹽酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、高氯酸、對二氨基苯甲醛、氯胺T、氫氧化鈉、尿素、硫脲、EDTA(乙二胺四乙酸)、β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)、Tris堿、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等：分析純；

pH計：PHS-3C型，上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠；

搖床：TS-2000A型，海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；

紫外-可見分光光度計：UV-2102PCS型，上海尤尼柯儀器有限公司；

垂直電泳儀：Mini-PROTEAN Tetra System型，美國Bio-Rad公司；

凝膠成像儀：GelDoc2000型，美國Bio-Rad公司；

高速氨基酸分析儀：835-50型，日本日立公司；

烏氏黏度計：227型，內(nèi)徑0.5～0.6 mm，上海申誼玻璃制品有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羥脯氨酸標準曲線的繪制 精確稱取羥脯氨酸0.1 g，用0.001 mol/L的鹽酸溶解，配制成1 g/L羥脯氨酸貯存液，將貯存液稀釋成不同濃度的羥脯氨酸標準液；取1 mL標準溶液于試管中，以0.001 mol/L的鹽酸作空白液，向標準液和空白液中加2 mL氯胺T溶液，室溫靜置20 min；加入2 mL 高氯酸，混勻后室溫靜置5 min，再加入2 mL顯色液60 ℃水浴15 min；流水冷卻后，以空白液調(diào)零，560 nm下測定吸光值[17]。以羥脯氨酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制羥脯氨酸標準曲線，得回歸方程為：Y=0.007 5x-0.000 8，相關系數(shù)R2=0.999 1。

1.3.2 齊口裂腹魚魚骨的預處理 魚骨充分剁碎后，用其質(zhì)量10倍的0.1 mol/L NaOH溶液浸泡4 h[18]，再用2.5% NaCl浸泡4 h[19]，去除非膠原蛋白成分及防止內(nèi)源性蛋白酶對膠原蛋白的影響；魚骨用蒸餾水反復洗滌瀝干，用其質(zhì)量5倍的0.5 mol/L EDTA溶液(pH 7.4)于4 ℃下浸泡5 d，每天更換1次EDTA溶液以脫去鈣質(zhì)；用蒸餾水反復洗滌后瀝干[20]，加入其質(zhì)量20倍的10%異丙醇溶液于4 ℃下浸泡1 d 以去除脂肪；用蒸餾水沖洗魚骨至中性，瀝干，貯存于-20 ℃ 冰箱中備用。

1.3.3 膠原蛋白提取得率的計算 取膠原蛋白提取液1 mL，加入3 mL 6 mol/L的鹽酸，105 ℃條件下水解5 h；水解液用超純水分次轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶定容，取1 mL溶液于試管中，按1.3.1羥脯氨酸標準曲線的繪制方法測定吸光值，按式(1)計算膠原蛋白提取得率[21-22]。

(1)

式中：

c——膠原蛋白提取得率，%；

m1——羥脯氨酸的質(zhì)量，g；

m2——魚骨總質(zhì)量，g。

1.3.4 魚骨膠原蛋白的提取方法優(yōu)化

(1) 液料比對膠原蛋白提取得率的影響：選取25∶1，50∶1，75∶1，100∶1，125∶1 (mL/g)的液料比，0.5 mol/L檸檬酸為提取劑，超聲波功率300 W，超聲波預處理時間20 min，提取溫度30 ℃，提取時間48 h，以膠原蛋白提取得率為評價指標確定料液比。

(2) 超聲波預處理時間對膠原蛋白提取得率的影響：選取0，10，20，30，40 min的超聲波預處理時間，0.5 mol/L檸檬酸為提取劑，超聲波功率300 W，液料比75∶1 (mL/g)，提取溫度30 ℃，提取時間48 h，以膠原蛋白提取得率為評價指標確定超聲波預處理時間。

(3) 提取溫度對膠原蛋白提取得率的影響：選取20，25，30，35，40 ℃的提取溫度，0.5 mol/L檸檬酸為提取劑，超聲波功率300 W，液料比75∶1 (mL/g)，超聲波預處理時間20 min，提取時間48 h，以膠原蛋白提取得率為評價指標確定提取溫度。

(4) 提取時間對膠原蛋白提取得率的影響：選取24，36，48，60，72 h的提取時間，0.5 mol/L檸檬酸為提取劑，超聲波功率300 W，液料比75∶1 (mL/g)，超聲波預處理時間20 min，提取溫度30 ℃，以膠原蛋白提取得率為評價指標確定提取時間。

(5) 正交試驗設計：在單因素試驗基礎上以液料比、超聲波預處理時間、提取溫度、提取時間作為影響因素，各取3個水平，采用L9(34)正交試驗設計，研究齊口裂腹魚骨膠原蛋白提取最優(yōu)條件并對該條件進行驗證。

1.3.5 魚骨膠原蛋白的純化方法 魚骨膠原蛋白提取液過濾后向濾液中加入NaCl至最終濃度為0.9 mol/L鹽析過夜；于4 ℃、10 000 r/min離心15 min，收集沉淀，用10倍體積的0.5 mol/L檸檬酸溶解沉淀，重復鹽析和溶解[23]；將魚骨膠原蛋白溶液轉(zhuǎn)入透析袋于超純水中透析3 d，每天更換超純水2～3次；將透析袋中的膠原蛋白溶液真空冷凍干燥后得到魚骨膠原蛋白成品。

1.3.6 魚骨膠原蛋白特性分析

(1) 紫外光譜掃描：精確稱取骨膠原蛋白成品0.005 g溶于5 mL 0.5 mol/L的檸檬酸中，振蕩使其全部溶解，樣品經(jīng)4 ℃離心(10 000 r/min，5 min)后取上清液在波長200～400 nm進行紫外光譜掃描[24]。

(2) SDS-PAGE電泳及純度測定：聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度8%，濃縮膠濃度4%，上樣量10 μL。采用恒壓電泳跑膠，樣品在濃縮膠時電壓保持在80 V，當樣品進入分離膠后保持電壓120 V，在樣品快接近分離膠底部時，終止電泳[25]。電泳結束后將凝膠放入含1 g/L考馬斯亮藍R-250、45%甲醇和10%冰醋酸的染色液中染色2～3 h，用10%甲醇和10%冰醋酸脫色，中途更換脫色液，直至條帶清晰。

精確稱取0.005 g樣品溶于5 mL 6 mol/L鹽酸中，在105 ℃條件下水解24 h，在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除鹽酸，用超純水定容至50 mL。吸取1 mL樣液，按標準曲線的繪制方法測定吸光值，根據(jù)待測樣品羥脯氨酸濃度按式(2)計算膠原蛋白純度。

(2)

式中：

w——膠原蛋白純度，%；

C——羥脯氨酸質(zhì)量濃度，μg/mL；

m——樣品質(zhì)量，mg；

V——樣品總體積，mL；

F——換算系數(shù)11.1。

(3) 氨基酸組成測定：根據(jù)Li等[26]的測定方法修改如下：取齊口裂腹魚骨膠原蛋白樣品0.005 g在110 ℃條件下經(jīng)5 mL 6 mol/L鹽酸水解24 h后，用氨基酸分析儀進行氨基酸組成的分析。

(4) 熱變性溫度測定：根據(jù)劉慶慧等[27]和鐘朝輝等[28]的測定方法修改如下：取適量齊口裂腹魚骨膠原蛋白溶于10 mL 0.5 mol/L檸檬酸，采用烏氏黏度儀測定樣品在毛細管中的流出時間t，每個溫度重復測定3次，以0.5 mol/L檸檬酸作為空白液，測定值為t0(控制t/t0在1.2～2.0為宜)。在15～40 ℃內(nèi)測定膠原蛋白溶液的分數(shù)黏度，每個溫度水平恒溫30 min后測定。根據(jù)樣品的流出時間及空白液流出時間計算樣品的分數(shù)黏度，并以溫度為橫坐標、分數(shù)黏度為縱坐標制圖，以分數(shù)黏度變化一半時所對應的溫度為膠原蛋白熱變性溫度。計算公式：

ηr=t/t0，

(3)

ηsp=ηr-1，

(4)

(5)

式中：

ηr——相對黏度；

ηsp——增比黏度；

η0——分數(shù)黏度；

t——樣品流出時間，s；

t0——檸檬酸流出時間，s；

T——測定溫度，℃。

2 結果與分析

2.1 膠原蛋白提取條件的選擇

2.1.1 液料比對膠原蛋白提取得率的影響 由圖1可知，液料比在較低范圍內(nèi)，魚骨不能充分浸泡使得提取效果較差，隨著液料比的提高魚骨與提取劑充分接觸，檸檬酸通過破壞蛋白質(zhì)分子之間的氫鍵，膠原蛋白從原料魚骨中釋放使得提取得率顯著升高(P<0.05)，液料比為75∶1 (mL/g)時膠原蛋白提取得率最高。隨著液料比的繼續(xù)增加，魚骨中膠原蛋白基本釋放完全，提取得率趨于平穩(wěn)(P>0.05)。液料比的繼續(xù)增加會降低膠原蛋白在提取液中的濃度，增大膠原蛋白分離純化的難度，遵循經(jīng)濟方便的原則確定最佳液料比為75∶1 (mL/g)。

圖1 液料比對膠原蛋白提取得率的影響Figure 1 Effect of liquid-solid ratio on collagen extraction yield

2.1.2 超聲波預處理時間對膠原蛋白提取得率的影響 由圖2可知，隨超聲波預處理時間的延長，齊口裂腹魚膠原蛋白提取得率不斷增大，經(jīng)超聲波預處理的魚骨膠原蛋白提取得率顯著高于未處理組(P<0.05)，說明超聲波輔助可提高魚骨膠原蛋白提取得率。當超聲波預處理時間超過20 min后，膠原蛋白提取得率呈下降趨勢(P>0.05)，可能是超聲波具有的機械剪切作用和空化效應使提取液中膠原蛋白發(fā)生部分分解。故確定超聲波預處理時間為20 min。

2.1.3 提取溫度對膠原蛋白提取得率的影響 由圖3可知，提取溫度對齊口裂腹魚膠原蛋白提取得率的影響較大，隨著提取溫度的上升膠原蛋白提取得率顯著升高(P<0.05)，溫度為30 ℃時膠原蛋白提取得率最高。當提取溫度超過35 ℃ 時，提取得率顯著下降(P<0.05)，可能是膠原蛋白穩(wěn)定性較差，提取溫度過高導致膠原蛋白轉(zhuǎn)化為明膠等物質(zhì)或者是破壞其結構使其分解[29]。故選擇30 ℃為最佳提取溫度。

圖2 超聲波預處理時間對膠原蛋白提取得率影響Figure 2 Effect of ultrasonic pretreatment time on collagen extraction yield

圖3 提取溫度對膠原蛋白提取得率的影響Figure 3 Effect of extraction temperature on collagen extraction yield

2.1.4 提取時間對膠原蛋白提取得率的影響 膠原蛋白從原料骨中釋放是一個緩慢的過程，由圖4可知，提取時間為24 h魚骨中膠原蛋白提取得率較低，隨著提取時間的延長膠原蛋白提取得率呈上升趨勢，提取時間為48 h膠原蛋白提取得率達到最大值。由于膠原蛋白長時間處于酸性環(huán)境中會發(fā)生部分變性，導致提取液中膠原蛋白含量減少，提取得率呈下降趨勢(P>0.05)。為提高提取效率、縮短周期，故確定最佳提取時間為48 h。

圖4 提取時間對膠原蛋白提取得率的影響Figure 4 Effect of extraction time on collagen extraction yield

2.1.5 正交試驗 在單因素試驗結果的基礎上，采用L9(34) 正交試驗設計確定膠原蛋白的最優(yōu)提取參數(shù)。正交試驗因素及水平見表1，正交試驗結果見表2。

由表2可知，根據(jù)極差分析各因素對膠原蛋白提取得率的影響次序為：A>C>B>D，最優(yōu)組合為A2B2C2D3，結合膠原蛋白的提取得率及單因素的結果，考慮實際操作的方便及經(jīng)濟原則[30]，修正齊口裂腹魚骨膠原蛋白提取方法為A2B2C2D2，即提取溫度30 ℃、超聲波預處理時間20 min、提取時間48 h、液料比75∶1 (mL/g)，在該條件下進行驗證實驗，重復3次，結果顯示，膠原蛋白的提取得率為6.91%，優(yōu)于正交試驗中最大值，因此，此條件可用于齊口裂腹魚骨膠原蛋白的提取。

表1 L9(34)正交試驗因素水平

表2 正交試驗結果

2.2 膠原蛋白特性分析

2.2.1 紫外光譜掃描 膠原蛋白與大多數(shù)蛋白質(zhì)的區(qū)別在于幾乎不含色氨酸，因此，在280 nm處不會有紫外吸收峰的出現(xiàn)，可作為一種鑒定膠原蛋白純度的方法。由圖5可知，齊口裂腹魚骨膠原蛋白溶液在紫外光譜220～232 nm范圍內(nèi)有一個較強的吸收峰，在257，275，280 nm處有較弱的吸收峰，表明苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在膠原蛋白一級結構中含量較低，其紫外吸收峰特性與黃石溪[31]酸法提取的草魚骨膠原蛋白紫外掃描220～230 nm內(nèi)有一個尖銳的吸收峰的結果相似，說明在該試驗條件下提取的魚骨膠原蛋白純度較高，且符合I型膠原蛋白的紫外吸收特征。膠原蛋白在紫外光譜200～220 nm范圍內(nèi)有微弱的峰，可能是由于膠原蛋白溶液中檸檬酸的影響。

圖5 齊口裂腹魚骨膠原蛋白的紫外吸收光譜Figure 5 UV absorption spectra of collagen in the Schizothorax prenanti bone

2.2.2 SDS-PAGE電泳 在SDS-PAGE電泳中膠原蛋白的電泳遷移率只取決于相對分子量大小，因此，此方法可用于膠原蛋白樣品的分子組成及分子質(zhì)量分析(結果見圖6)。齊口裂腹魚骨膠原蛋白由兩條α鏈(α1鏈和α2鏈)和一條β鏈組成，β鏈的分子量約為200 kDa，α1鏈與α2鏈分子量在110～130 kDa，而且α1鏈的條帶比α2鏈的要深，說明α1鏈在膠原蛋白中的含量高于α2鏈。同時，圖譜上幾乎不含其他的雜帶，說明提取的齊口裂腹魚骨膠原蛋白純度較高，通過測定樣品的吸光值按回歸方程計算得膠原蛋白純度為89.74%。

圖6 齊口裂腹魚骨膠原蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Figure 6 SDS-PAGE analysis of collagen in the Schizothorax prenanti bone

SDS-PAGE電泳結果與陳申如等[32]對淡水魚魚骨膠原蛋白特性研究中β肽鏈分子量約為200 kDa，α1肽鏈分子量約為130 kDa，且α2肽鏈含量相對較低的結果相似。此外，葉韜等[33]研究發(fā)現(xiàn)羅非魚骨膠原蛋白中α1鏈的相對分子質(zhì)量約為120 kDa，α2鏈的相對分子質(zhì)量在100～120 kDa，β鏈的相對分子質(zhì)量略大于200 kDa，α1鏈的含量最高，其次是α2鏈，而β鏈含量最低。經(jīng)純度分析，膠原蛋白樣品純度為89.74%，符合SDS-PAGE電泳中條帶單一的結果。

2.2.3 氨基酸組成 由表3可知，齊口裂腹魚骨膠原蛋白中各種氨基酸含量相對豐富，其中甘氨酸含量最高，占總氨基酸含量的31.21%；亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)含量較多，占總氨基酸含量的20.66%；其次是丙氨酸和谷氨酸，分別占總氨基酸含量的10.18%和7.31%；組氨酸和酪氨酸含量較少，不含色氨酸，只有極少量的半胱氨酸。氨基酸分析結果符合膠原蛋白的氨基酸組成特征，與紫外掃描圖譜結果分析一致，說明采用超聲波輔助提取可保持膠原蛋白的完整性。

2.2.4 熱變性溫度 由圖7可知，溫度為25 ℃時分數(shù)黏度值呈下降的趨勢，說明膠原蛋白開始發(fā)生部分變性，當溫度為31.4 ℃時，分數(shù)黏度值為最大值的一半，此溫度即為齊口裂腹魚骨膠原蛋白熱變性溫度，與鯉魚骨膠原蛋白熱變性溫度30 ℃接近[34]。同時也說明正交試驗中膠原蛋白最佳提取溫度確定為30 ℃是合理的。

表3 齊口裂腹魚骨膠原蛋白氨基酸組成

圖7 齊口裂腹魚骨膠原蛋白熱變性溫度曲線Figure 7 Temperature curve of thermal denaturation of collagen in the Schizothorax prenanti bone

研究表明，膠原蛋白的熱變性溫度與亞氨基酸的含量正相關，主要是由于亞氨基酸中的吡咯環(huán)與羥脯氨酸的羥基所形成的氫鍵增強了膠原蛋白結構的穩(wěn)定性[35]，與上述齊口裂腹魚骨膠原蛋白氨基酸分析結果一致；相關研究還表明：魚類膠原蛋白的熱變性溫度與其生活環(huán)境的水溫也存在一定的相關性，大致與其最高水溫相等[36]，吳青等[37]研究發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚幼魚在水溫30 ℃時已經(jīng)出現(xiàn)呼吸頻率加快，不攝食現(xiàn)象，生存的臨界溫度上限為33.5 ℃，與齊口裂腹魚骨膠原蛋白變性溫度31.4 ℃接近。

3 結論

本研究結果表明，齊口裂腹魚骨中的膠原蛋白最優(yōu)提取條件為：提取溫度30 ℃、超聲波預處理時間20 min、提取時間48 h、液料比75∶1(mL/g)，膠原蛋白提取得率可達6.91%。齊口裂腹魚骨膠原蛋白為I型膠原蛋白，采用超聲波技術與檸檬酸結合應用于齊口裂腹魚骨膠原蛋白提取可提高產(chǎn)品得率，保持膠原蛋白的完整性且純度較高，但提取時間較長。如何將超聲波技術與其他提取方法結合最大限度縮短提取時間并提高產(chǎn)品得率和純度，還有待研究。近年來，水產(chǎn)膠原蛋白的相關研究越來越多，同時水產(chǎn)動物原料的低脂高蛋白的特性非常適用于膠原產(chǎn)品的制備[38]，從宗教信仰，節(jié)約資源，保護環(huán)境方面考慮，魚骨膠原蛋白的進一步研究一定具有重要的科學意義和市場價值。

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