藜麥皮總皂苷微波輔助提取工藝及其抗氧化活性研究

楊 潔 高鳳祥 - 楊 敏 邊紅聿 - 張仕剛 - 趙二勞 -

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西 忻州 034000)

藜麥(Chenopodiumquinoa)為藜科(Chenopodiaceae)藜屬(Chenopodiumspp.)雙子葉1年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲的玻利維亞、厄瓜多爾和秘魯?shù)鹊兀哂心秃?、耐寒、耐瘠薄、耐鹽堿等特性，是公認(rèn)的全營養(yǎng)谷物[1]。目前世界各地均有引種，中國西藏、陜西、山西、四川、青海和浙江等地已大量種植[2]。研究[3-4]表明，藜麥含有皂苷、不飽和脂肪酸、維生素E等多種營養(yǎng)成分，皂苷主要分布在藜麥皮中。

目前，皂苷的提取方法主要有溶劑熱提取法、酶法提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界CO2萃取法以及超聲-微波聯(lián)合提取法等[7-8]。微波輔助提取法因具有設(shè)備簡單、提取效率高、選擇性強、節(jié)約時間與溶劑、污染小等諸多優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于黃酮[9]、多糖[10]、多酚[11]、色素[12]等提取中。有關(guān)藜麥皮皂苷微波輔助提取的研究未見報道。因此本試驗擬采用響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥皂苷微波輔助提取工藝，并研究其抗氧化活性，以期為藜麥皮綜合開發(fā)利用及提高藜麥資源附加值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥皮：山西華青藜麥產(chǎn)品開發(fā)有限公司，石油醚脫脂后，60 ℃烘箱中烘干，粉碎后過60目篩，裝瓶保存?zhèn)溆?

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品：含量≥98%，上海賽創(chuàng)科學(xué)有限公司；

DPPH?(1,1-二苯基-2-苦肼基)、ABTS[2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]：分析純，美國Sigma 公司；

香草醛、冰醋酸、高氯酸、過硫酸鉀等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

微電腦微波化學(xué)反應(yīng)器：LWMC-201型，南京陵江科技開發(fā)有限責(zé)任公司；

紫外可見分光光度計：V-1100D型，上海美譜達(dá)儀器有限公司；

電子分析天平：AL204型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

循環(huán)水真空泵：SHZ-DⅢ型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參考文獻(xiàn)[13]，分別準(zhǔn)確移取濃度為0.05 mg/mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20，1.40 mL于10 mL具塞試管中，70 ℃水浴將溶劑揮干，然后加入0.20 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液和0.80 mL的高氯酸，加塞搖勻，于60 ℃水浴加熱15 min，取出后立即用冰水冷卻5 min，再加入5.0 mL冰醋酸稀釋，搖勻，靜置30 min后，以不加樣品的平行樣作為空白，在546 nm 波長下測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，齊墩果酸質(zhì)量濃度(c)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=67.497c+0.003，R2=0.998 6，線性范圍為0.002～0.012 mg/mL。

1.3.2 總皂苷的測定 準(zhǔn)確移取0.20 mL藜麥皮提取液于10 mL比色管中，按1.3.1的方法測定皂苷含量，按式(1)計算總皂苷得率。

(1)

式中：

Z——總皂苷得率，mg/g；

C——測量液皂苷濃度，mg/mL；

n——測量時稀釋倍數(shù)；

V——提取液的定容體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 藜麥皮總皂苷的提取 稱取藜麥皮樣品1.0 g，按單因素及響應(yīng)面試驗設(shè)計進(jìn)行微波輔助提取，提取液過濾后，定容至100 mL，測定總皂苷得率。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計

(1) 乙醇濃度的選擇：固定微波時間10 min，微波功率455 W，料液比1∶20 (g/mL)，提取次數(shù)1次，分別考察乙醇濃度為50%，60%，70%，80%，90%時，對藜麥皮總皂苷得率的影響。

(2) 微波時間的選擇：固定乙醇濃度70%，微波功率455 W，料液比1∶20 (g/mL)，提取次數(shù)1次，分別考察微波時間為2，6，10，14，18 min時，對藜麥皮總皂苷得率的影響。

(3) 微波功率的選擇：固定乙醇濃度70%，微波時間10 min，料液比1∶20 (g/mL)，提取次數(shù)1次，分別考察微波功率為65，195，325，455，585 W時，對藜麥皮總皂苷得率的影響。

(4) 料液比的選擇：固定乙醇濃度70%，微波時間10 min，微波功率455 W，提取次數(shù)1次，分別考察料液比為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL)時，對藜麥皮總皂苷得率的影響。

(5) 提取次數(shù)的選擇：固定乙醇濃度70%，微波時間10 min，微波功率455 W，料液比1∶20 (g/mL)。考察提取次數(shù)分別為為1，2，3次時，對藜麥皮總皂苷得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化藜麥皮總皂苷提取工藝 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取乙醇濃度、微波時間、微波功率、料液比4個因素為自變量，以皂苷提取得率為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.6.1軟件設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面試驗，分析并優(yōu)化藜麥皮總皂苷的微波輔助提取工藝。

1.3.6 藜麥皮總皂苷的抗氧化活性 本試驗選取3種自由基清除模型考察藜麥皮總皂苷的抗氧化活性，并利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

(1) DPPH?清除率測定：根據(jù)文獻(xiàn)[14]修改如下：取2 mL 濃度為0.3 mg/mL的DPPH?溶液8份，分別置于10 mL 比色管中，分別加入一定體積的總皂苷提取液，用68%的乙醇溶液定容至刻度，使比色管中總皂苷濃度分別為5，10，15，20，40，60，80，100 μg/mL，搖勻，室溫下避光反應(yīng)30 min后，在517 nm處測量其吸光值為A1。測定不加總皂苷溶液僅DPPH?溶液體系吸光度為A0，測定不加DPPH?溶液體系吸光度為A2。同法測定VC對DPPH?清除率。

(2) ABTS+?清除率測定：根據(jù)文獻(xiàn)[15]修改如下：取配制好的ABTS溶液2 mL，置于10 mL比色管中，分別加入一定體積的總皂苷提取液，用68%的乙醇溶液定容至刻度，使比色管中總皂苷濃度分別為5，10，15，20，40，60，80，100 μg/mL，搖勻，室溫下放置10 min后，在734 nm處測量其吸光值A(chǔ)1。測定不加總皂苷溶液體系A(chǔ)BTS+?溶液吸光度為A0，測定不加ABTS+?溶液體系吸光度為A2。同法測定VC對ABTS+?清除率。

(3) ?OH清除率測定：根據(jù)文獻(xiàn)[16]修改如下：取6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L水楊酸溶液各2 mL置于10 mL比色管中，分別加入一定體積的總皂苷提取液，再加入2 mL 3% H2O2溶液，最后用68%的乙醇溶液定容，使比色管中總皂苷濃度分別為5，10，15，20，40，60，80，100 μg/mL，搖勻，37 ℃水浴反應(yīng)15 min后，在波長510 nm下測量其吸光值為A1。測定不加總皂苷溶液體系吸光度為A0，測定不加H2O2溶液體系吸光度為A2。同法測定VC對?OH清除率。

(4) 自由基清除率：上述3種藜麥皮總皂苷清除自由基試驗，按式(2)計算各自由基清除率。

(2)

式中：

s——清除率，%；

A0——空白對照液的吸光度；

A1——加入待測溶液后的吸光度；

A2——待測液本身的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對藜麥皮總皂苷得率的影響 由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，藜麥皮總皂苷得率先增后降，當(dāng)乙醇濃度為70%時，總皂苷得率達(dá)到最大，以后隨乙醇濃度的增加，總皂苷得率下降。原因可能是隨乙醇濃度的增加，溶劑的極性發(fā)生變化，使雜質(zhì)溶出增多，從而影響總皂苷得率[11]。因此選擇乙醇濃度為70%。

圖1 乙醇濃度對藜麥皮總皂苷得率的影響Figure 1 Effect of ethanol concentration on the total saponin yield

2.1.2 微波時間對藜麥皮總皂苷得率的影響 由圖2可知，藜麥皮總皂苷得率隨著微波時間的延長而增大，當(dāng)微波時間為10 min時，藜麥皮總皂苷得率達(dá)到最大。以后隨微波時間的延長總皂苷得率逐漸降低。這可能是微波時間過長會使皂苷結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致得率下降[11]。因此選擇微波時間為10 min。

2.1.3 微波功率對藜麥皮總皂苷得率的影響 由圖3可知，藜麥皮總皂苷得率隨著微波功率的增加，也呈先增后降趨勢。當(dāng)微波功率為455 W時，總皂苷得率達(dá)到最大，以后有所下降，可能是微波功率過高使溫度升高導(dǎo)致皂苷降解所致[11]。因此選擇微波功率為455 W。

圖2 微波時間對藜麥皮總皂苷得率的影響Figure 2 Effect of microwave time on the total saponin yield

圖3 微波功率對藜麥皮總皂苷得率的影響Figure 3 Effect of microwave power on the total saponin yield

2.1.4 料液比對藜麥皮總皂苷得率的影響 由圖4可知，隨提取劑的增加，藜麥皮總皂苷得率先增大后降低；當(dāng)料液比為1∶30 (g/mL)時，藜麥皮總皂苷得率達(dá)到最大?？赡苁怯捎诹弦罕忍?，不利于皂苷溶出，料液比過大，雜質(zhì)溶出增加影響皂苷溶出[11]。因此選擇料液比為1∶30 (g/mL)。

圖4 料液比對藜麥皮總皂苷得率的影響Figure 4 Effect of solid-liquid ratio on the total saponin yield

2.1.5 提取次數(shù)對藜麥皮總皂苷得率的影響 由圖5可知，隨提取次數(shù)的增加，總皂苷得率增加，當(dāng)提取為2次或3次時，藜麥皮總皂苷得率基本不變，說明此時皂苷已基本溶出，考慮成本，選擇提取次數(shù)為2次。

圖5 提取次數(shù)對藜麥皮總皂苷得率的影響Figure 5 Effect of extraction time on the total saponin yield

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥皮總皂苷提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗方案設(shè)計及結(jié)果分析 按試驗方法，以總皂苷得率為響應(yīng)值，試驗因素與水平見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得總皂苷得率的多元回歸方程為：

表1 響應(yīng)面試驗因素和水平

Y=26.26-0.47A-0.49B+0.33C-0.13D-0.026AB+0.16AC-0.55AD+0.47BC+0.43BD-1.00CD-0.80A2-0.89B2-0.70C2-1.42D2。

(3)

藜麥皮總皂苷得率回歸模型的方差及顯著性分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析?

?表示顯著(P<0.05)；表示極顯著(P<0.01)；R2= 0.974 8；；C.V%=0.98。

2.2.2 因素交互作用分析 用Design Expert 8.0.6.1軟件根據(jù)回歸方程進(jìn)行繪圖分析，得各因素間交互作用響應(yīng)面及等高線圖見圖6～11。曲面傾斜度越高，即坡度越陡，說明兩者交互作用越顯著，等高線圖越橢圓，則說明交互作用越顯著[18]。由圖6～11看出，CD、AD、BC、BD交互影響作用顯著，與模型的方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 驗證實驗 由回歸方程得到藜麥皮總皂苷微波輔助提取最佳工藝條件為：乙醇濃度68.12%，微波功率423.05 W，料液比1∶32.22 (g/mL)，微波時間9.63 min。該工藝條件下，藜麥皮總皂苷理論預(yù)測提取得率為26.411 mg/g。為了檢驗試驗結(jié)果的可靠性，進(jìn)行驗證實驗?？紤]試驗因素的實際可操作性，將上述工藝修正為：乙醇濃度68%，微波功率455 W，料液比1∶32 (g/mL)，微波時間10 min，進(jìn)行3次平行實驗，測得總皂苷平均得率為26.329 mg/g，RSD為0.48%。與理論預(yù)測值基本相符，說明優(yōu)化的提取工藝條件可靠，具有實際應(yīng)用價值。

圖6 乙醇濃度與微波功率的交互作用Figure 6 Interactive effects of ethanol concentraction and microwave power

圖7 乙醇濃度與料液比的交互作用Figure 7 Interactive effects of ethanol concentraction and solid-liquid ratio

2.3 藜麥皮總皂苷抗氧化活性分析

2.3.1 藜麥皮總皂苷對DPPH?的清除率 由圖12可知，隨藜麥皮總皂苷濃度的增加，對DPPH?的清除率增大，兩者呈明顯的量效關(guān)系。在測定濃度范圍內(nèi)，由SPSS 20.0軟件多因素方差分析知，藜麥皮總皂苷與VC清除DPPH?能力具有顯著差異(P<0.05)，即藜麥皮總皂苷清除DPPH?能力明顯低于VC，但藜麥皮總皂苷對DPPH?最大清除率仍達(dá)80.44%，IC50為34.74 μg/mL，表明藜麥皮總皂苷具有一定的DPPH?清除能力及抗氧化活性。

圖8 乙醇濃度與微波時間的交互作用Figure 8 Interactive effects of ethanol concentraction and microwave time

圖9 料液比與微波功率的交互作用Figure 9 Interactive effects of solid-liquid ratio and microwave power

圖10 微波時間與微波功率的交互作用Figure 10 Interactive effects of microwave time and microwave power

圖11 微波時間與料液比的交互作用Figure 11 Interactive effects of microwave time and solid-liquid ratio

2.3.2 藜麥皮總皂苷對ABTS+?的清除率 由圖13可知，藜麥皮總皂苷對ABTS+?的清除率隨著濃度的增加而增大。SPSS 20.0軟件ANOVA多因素方差分析知，在測定濃度范圍內(nèi)，盡管藜麥皮皂苷對ABTS+?的清除率遠(yuǎn)低于VC，具有顯著差異(P<0.05)，但藜麥皮總皂苷對ABTS+?最大清除率仍達(dá)59.16%，IC50為48.18 μg/mL，也表明藜麥皮總皂苷具有一定的ABTS+?清除能力及抗氧化活性。

圖12 藜麥皮總皂苷對DPPH?的清除率Figure 12 Scavenging rate of total saponins on DPPH ?

圖13 藜麥皮總皂苷對ABTS+?的清除率Figure 13 Scavenging rate of total saponins on ABTS+?

2.3.3 藜麥皮總皂苷對?OH的清除率 由圖14可知，隨藜麥皮總皂苷濃度的增加，對?OH的清除率增強。由SPSS 20.0軟件ANOVA單因素方差分析知，濃度對藜麥皮總皂苷和VC清除?OH能力有顯著的影響(P<0.05)。當(dāng)藜麥皮總皂苷濃度為100 μg/mL時，對?OH的清除率最大可達(dá)94.07%，IC50為5.45 μg/mL，而VC的IC50為9.79 μg/mL，藜麥皮總皂苷清除?OH能力強于VC，且具有顯著差異(P<0.05)。表明藜麥皮總皂苷具有較強的?OH清除能力及抗氧化活性。

圖14 藜麥皮總皂苷對?OH的清除率Figure 14 Scavenging rate of total saponins on ?OH

3 結(jié)論

本試驗采用微波輔助提取藜麥皮總皂苷，在單因素試驗基礎(chǔ)上采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化了藜麥皮總皂苷的提取工藝。結(jié)果表明，最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇濃度68%，微波功率455 W，料液比1∶32 (g/mL)，微波時間10 min，提取次數(shù)2次。該條件下藜麥皮總皂苷得率為26.329 mg/g。采用SPSS 20.0軟件對抗氧化試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示濃度對藜麥皮總皂苷自由基清除能力具有顯著影響(P<0.05)，隨著濃度的增加其清除能力增強，清除DPPH?、ABTS+?和?OH的IC50分別為34.74，48.18，5.45 μg /mL，表明藜麥皮總皂苷具有較強的自由基清除能力及抗氧化活性，因此藜麥總皂苷的開發(fā)利用及其中抗氧化有效單體成分的發(fā)現(xiàn)值得進(jìn)一步深入研究。

[1] 杜靜婷, 陳超, 范三紅. 響應(yīng)面優(yōu)化藜麥糠皂苷的提取及抗氧化活性[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 44(7): 932-937.

[2] 郭曉鳳. 試論藜麥的推廣前景及栽培技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè), 2015(2): 61-63.

[3] KULJANABHAGAVAD T, THONGPHASUK P, CHAMULITRAT W, et al. Triterpene saponins from Chenopodium quinoa Wild[J]. Phytochemistry, 2008, 69(9): 1 919-1 926.

[4] 王晨靜, 趙習(xí)武, 陸國權(quán), 等. 藜麥特性及開發(fā)利用研究進(jìn)展[J]. 浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2014, 31(2): 296-301.

[5] 歐陽凱, 何先元, 陳飛, 等. 四齒四棱草總皂苷提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究[J]. 食品與機械, 2016, 32(7): 141-145.

[6] 俞琦, 蔡琨, 田維毅. 合歡皮總皂苷對H22荷瘤小鼠細(xì)胞免疫功能的影響[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2016, 22(15): 143-148.

[7] 張新宇, 張笛, 王琳, 等. 絞股藍(lán)皂苷提取純化工藝研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(18): 378-382, 386.

[8] 程軼群, 張帆, 周守標(biāo), 等. 超聲-微波聯(lián)合提取絞股藍(lán)皂苷工藝優(yōu)化及協(xié)同作用分析[J]. 食品與機械, 2016, 32(9): 135-140.

[9] 陳鐵壁, 肖樂, 楊盟盟, 等. 金桂花中總黃酮的微波輔助提取工藝優(yōu)化[J]. 食品與機械, 2015, 31(3): 185-188.

[10] 曾紅亮, 黃燦燦, 常青, 等. 金柑多糖微波輔助提取工藝優(yōu)化及抑菌效果[J]. 食品與機械, 2016, 32(9): 154-160.

[11] 黃琦, 王啟越, 李穎, 等. 石榴皮總多酚的微波輔助提取工藝及抗氧化活性研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2016, 37(12): 46-51, 61.

[12] 師萱, 閻語, 梁旭明, 等. 銀耳菌糠黑色素微波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性[J]. 食品與機械, 2016, 32(12): 161-165, 174.

[13] 趙文婷. 藜麥皮總皂苷的提取純化及其抗氧化和免疫增強作用[D]. 太谷: 山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015: 12.

[14] 陳洪彬, 楊敏, 宋露露, 等. 龍須菜多酚提取工藝及其體外抗氧化活性[J]. 食品與機械, 2017, 33(4): 139-143, 194.

[15] 白海娜, 王振宇, 劉瑞海, 等. 白藜蘆醇與黑木耳多糖協(xié)同清除ABTS自由基活性的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014, 30(3): 64-68.

[16] 王曉波, 李金芳, 王梅, 等. 山竹殼總黃酮抗氧化及抑制亞硝化作用研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2013, 34(6): 9-13.

[17] 吳德智, 鄭強, 李安, 等. 纈草總黃酮超聲輔助雙水相提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究[J]. 食品與機械, 2017, 33(5): 162-167.

[18] 蔣玉蓉, 袁俊杰, 孫雪婷, 等. 藜麥葉片多糖最佳提取工藝及抗氧化性研究[J]. 中國食品學(xué)報, 2017, 17(2): 110-118.