臭氧、電子束輻照降解玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A

羅小虎 - 李 克 王 韌 邢家溧 - 王 莉 杜志紅 - 潘麗紅 - 孫冬玲 -ng 李亞男 - 陳正行 -

(1. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術 國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；3. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122； 4. 寧波市食品檢驗檢測研究院，浙江 寧波 315048；5. 無錫愛邦輻照技術有限公司，江蘇 無錫 214151)

真菌毒素污染是全球性問題，每年由此造成了巨大的經(jīng)濟損失。在中國，相當大的地區(qū)處于溫帶和亞熱帶，為產(chǎn)毒真菌的生長繁殖帶來了適宜的氣候條件[1]。目前已發(fā)現(xiàn)的400余種真菌毒素中，來源于鐮孢屬菌種的玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)[2]和來源于曲霉屬和青霉屬真菌的赭曲霉毒素(OchratoxinA，OTA)[3]，ZEN、OTA分布范圍極廣且毒性較強[4-6]。

臭氧是一種強氧化劑，在液體體系中，能以分子和自由基2種作用方式攻擊有機物中的雙鍵[7]，且臭氧具有良好的滲透性，并能自動分解為氧氣，無任何毒性殘留物產(chǎn)生。因此，臭氧作為一項極具潛力的真菌毒素消減技術，近10年來對其進行了大量研究。羅小虎等[8]研究了臭氧降解黃曲霉毒素B1污染玉米在小鼠體內(nèi)的毒性，結果表明，臭氧處理后的污染玉米可顯著改善小鼠多項生理、生化指標，證明了該項技術的安全性；Zorlugenc等[9]分別采用臭氧氣體和臭氧水對干無花果中的AFB1進行處理，當臭氧氣體和臭氧水中臭氧濃度分別為13.8，1.71 mg/L，處理時間為180 min時，樣品中AFB1降解率分別為95.21%，88.62%。

電子束輻照技術是利用電子加速器產(chǎn)生的電子束，對產(chǎn)品進行輻照，該技術具有能量利用率高、操作簡單、使用安全等突出優(yōu)勢，是一項安全有效的綠色加工技術。自20世紀90年代以來，研究者們對其在農(nóng)產(chǎn)品和食品貯藏、作物育種、輻射化工、輻射殺菌殺蟲等領域進行了大量探索[10-12]。近年來，研究者在利用電子束輻照降解真菌毒素方面進行了一些探索。羅小虎等[13]研究了電子束輻照對玉米AFB1的降解效果，結果表明，電子束劑量在0～50 kGy時，可以有效降解玉米中AFB1，當電子束劑量達50 kGy時，AFB1降解率高于90%，其作用機理與γ射線相似[14]，即水分子經(jīng)電子束輻照后被激發(fā)、電離，產(chǎn)生羥自由基和水合電子等，羥自由基進一步破壞毒素分子結構。

當前，臭氧和電子束輻照對ZEN和OTA降解的理論和應用研究較少[15]，這為了解臭氧、電子束輻照降解食品中ZEN和OTA的效果形成了局限。本研究擬基于前人在臭氧降解嘔吐毒素(Deoxynivalenol，DON)[16]、AFB1[17]、OTA、ZEN[15]，以及電子束輻照降解AFB1的基礎上，分別采用乙腈和甲醇溶劑體系，研究臭氧濃度、樣品濃度、處理時間和輻照劑量等因素對ZEN和OTA降解率的影響，最終為臭氧和電子束輻照降解食品中OTA和ZEN的污染提供理論基礎和實踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

ZEN和OTA標準品：純度≥99.8%，百靈威科技有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，美國Fisher Scientific公司；

乙酸：色譜純，百靈威科技有限公司；

實驗用超純水：電阻≥18.2 MΩ/cm，Millipore-QSP超純水儀制備；

氮氣(純度≥99.8%)、氧氣(純度≥99.8%)：無錫新南化學氣體有限公司；

其他試劑：分析純，國藥化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

帶熒光檢測器：HPLC 1260型，美國安捷倫公司；

色譜柱：ZORBAX SB C18型，美國安捷倫公司；

電子束加速設備：AB5.0型，無錫愛邦輻照科技有限公司；

臭氧發(fā)生器：CFG-3-20 g型，青島國林實業(yè)股份有限公司；

臭氧濃度分析記錄儀：Ideal 2000型，中國淄博愛迪爾測量控制有限公司；

氮吹儀：MD200-1型，杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 ZEN和OTA標準儲備液和工作液的配制 將ZEN溶于甲醇溶液，OTA溶于乙腈溶液，分別配備成100 μg/mL和10 μg/mL標準儲備液，-20 ℃保藏。取一定量ZEN標準儲備液，氮氣吹干，再分別加入甲醇和乙腈復溶，配置成0.5，1.0，2.0，5.0 μg/mL的ZEN/甲醇(ZEN/Met)和ZEN/乙腈(ZEN/Ace)的標準工作液，4 ℃保藏，待電子束輻照處理；取一定量ZEN標準儲備液，用甲醇配置成50 μg/mL的標準工作液，4 ℃保藏，待臭氧處理。取一定量OTA標準儲備液，氮氣吹干，再分別加入甲醇和乙腈復溶，配置成0.1，0.2，0.5，1.0 μg/mL的OTA/甲醇(OTA/Met)和OTA/乙腈(OTA/Ace)標準工作液，4 ℃保藏，待電子束輻照處理；取一定量OTA標準儲備液用乙腈配制成5 μg/mL的工作溶液，4 ℃保藏，待臭氧處理。

1.2.2 ZEN和OTA含量的測定 高效液相色譜儀：帶G1312B熒光檢測器，Agilent 1260型。色譜柱：ZORBAX SB C18柱，4.6×150 mm，填料直徑5 μm，柱溫35 ℃，進樣量20 μL。ZEN流動相：甲醇/水(體積比60/40)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：激發(fā)波長274 nm，發(fā)射波長440 nm。OTA流動相：水/乙腈/乙酸(體積比56/43/1)，流速：0.9 mL/min；檢測波長：激發(fā)波長333 nm，發(fā)射波長477 nm。

1.2.4 臭氧降解ZEN和OTA 分別取2 mL ZEN(50 μg/mL)和OTA(5 μg/mL)工作液于10 mL聚乙烯離心管，通入臭氧。臭氧處理ZEN條件：濃度2.0 mg/L，流速1.0 L/min，處理時間為0，1，2，3，5，10 s；臭氧處理OTA條件：濃度50.0 mg/L，流速1.0 L/min，處理時間為0，10，30，60，90，120，180 s。臭氧處理結束后，通氮氣3 min終止反應，隨后用1 mL流動相復溶，待測。

1.2.5 電子束輻照降解ZEN和OTA 分別取2 mL的ZEN和OTA電子束輻照工作液于5 mL聚乙烯離心管，輻照劑量分別為0，3，6，9，12 kGy，加速電子能量5 MeV，束流20 mA，劑量率2 kGy/s。樣品輻照后氮氣吹干，1 mL流動相復溶，待測。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 本試驗樣品處理和檢測至少重復3次，采用SPSS17.0數(shù)據(jù)分析軟件進行單因素方差分析，當P<0.05時，認為數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學上具有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

由圖1、2可見，ZEN和OTA濃度分別在0.5～5.0 μg/mL 和0.1～1.0 μg/mL時，其峰面積與濃度呈線性相關性。以峰面積(mAU)為縱坐標(Y)，進樣濃度(μg/mL)為橫坐標(X)制作標準曲線，得ZEN標準曲線回歸方程為Y=3.223 3X+0.066，R2=0.999 8，OTA標準曲線回歸方程為Y=140.51X+0.502 3，R2=0.999 6。

2.2 臭氧和電子束輻照降解ZEN

2.2.1 臭氧對ZEN降解率的影響 圖3顯示的是2 mL 50 μg/mL 的ZEN標準工作液在不同的臭氧處理時間下的降解率。當處理時間為1 s時，ZEN的降解率超過50%，隨處理時間的延長，ZEN的降解速率逐漸減緩，當處理時間達10 s 時，溶液中未檢出ZEN。

ZEN分子中C10—C11為烯烴雙鍵結構，是臭氧分子的主要反應位點[18]。此外，研究表明芳香族有機物中苯環(huán)上含酚羥基結構有助于臭氧等氧化物反應破壞[19]，ZEN分子中苯環(huán)結構含2個酚羥基，且空間位阻作用小，可能是導致在低臭氧濃度和較短反應時間條件下，ZEN即被降解完全的原因。

圖1 ZEN的HPLC標準曲線Figure 1 Standard curve of zearalenone solution

圖2 OTA的HPLC標準曲線Figure 2 Standard curve of ochratoxin A solution

圖3 不同臭氧處理時間下ZEN的降解效果Figure 3 Degradation curve of ZEN by ozone at different treat time

2.2.2 電子束輻照對ZEN的降解效果

“一帶一路”背景下珠三角企業(yè)的外籍人才需求研究——基于廣深佛三市314家企業(yè)問卷數(shù)據(jù)的分析………………何展鴻(29)

(1) 輻照劑量對ZEN的降解效果：圖4顯示的是2.0 μg/mL 的ZEN標準工作液在不同輻照劑量下的降解效果。從圖4中可以看出，在0～6 kGy劑量條件下，ZEN降解速率隨輻照劑量的增加呈加快趨勢，6 kGy時，ZEN降解率超過50%；在6～9 kGy的劑量條件下，隨輻照劑量的增加，ZEN降解率增速減緩，12 kGy條件下，ZEN降解率達到86%。

圖4 輻照劑量對溶液中ZEN的降解效果Figure 4 Degradation curve of ZEN solution at different EB irradiation doses

現(xiàn)有研究表明，電子束輻照技術在真菌毒素降解中具有獨特的優(yōu)勢，并取得了良好的成果。Liu等[20]采用電子束輻照處理水溶液中的AFB1，8 kGy劑量下1，5 μg/mL的毒素樣品均被降解完全；Peng等[21]采用電子束輻照技術對不同溶劑體系中的OTA進行了輻照處理，發(fā)現(xiàn)相同濃度下OTA的降解率：水>乙腈>甲醇-水(體積比60∶40)。本研究結果表明，電子束輻照技術對甲醇溶液中的ZEN同樣具有良好的降解效果。

(2) 樣品濃度對ZEN的降解效果：圖5顯示的是不同濃度的ZEN標準工作液在不同輻照劑量下的降解效果。由圖5 可知，在0.5～5.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，ZEN濃度的增加對ZEN的降解率無明顯影響。該結果與相同輻照劑量和ZEN濃度下Luo等[22]的研究結果相似，然而ZEN濃度更高，ZEN降解率下降，可能是ZEN濃度為20 μg/mL時，相同劑量下，單位質量毒素的輻照吸收量過低，限制了溶液中自由基的反應，從而導致降解率下降。

圖5 樣品濃度對溶液中ZEN的降解效果Figure 5 Degradation curve of ZEN solution at different concentrations

(3) 溶劑對ZEN降解效果：圖6顯示的是將相同濃度梯度的ZEN標準工作液氮吹至干，采用等體積乙腈復溶后進行電子束輻照，考察其對ZEN降解效果的影響。由圖6可知，在0～6 kGy輻照劑量下，ZEN在乙腈溶液中的降解速率明顯快于標準工作液，即ZEN在乙腈溶液中，3 kGy劑量下，ZEN降解率即超過50%，而達到相同降解率的ZEN甲醇溶液所需劑量為6 kGy；在6～12 kGy劑量下，ZEN在2種溶液體系中降解速率均減緩，沒有顯著區(qū)別。

圖6 溶劑對溶液中ZEN的降解效果Figure 6 Degradation curve of ZEN at different solution

Schmelling等[23]的研究結果表明，電子束輻照有機溶劑體系[乙腈和甲醇-水(體積比60∶40)]中產(chǎn)生的自由基數(shù)量較少，且甲醇為自由基清除劑[24]，自由基處于產(chǎn)生-湮滅的動態(tài)過程。在0～6 kGy的輻照劑量下，由于乙腈溶液體系中輻照產(chǎn)生自由基隨即與ZEN分子反應，而甲醇體系中生成的自由基伴隨著甲醇分子的消除，因此降低了ZEN在甲醇溶液中的降解速率；6～12 kGy劑量下，乙腈和甲醇體系中ZEN降解速率均減緩，原因可能是在更高劑量下，溶劑中自由基增加數(shù)量有限，進一步限制了降解速率。

2.3 臭氧和電子束輻照降解OTA

2.3.1 臭氧對OTA的降解效果 圖7顯示的是2 mL 5 μg/mL 的OTA標準工作液在50 mg/L，流速為1 L/min，不同時間的臭氧處理對OTA降解率的影響。當臭氧處理時間為10 s時，OTA的降解速率最快，隨后逐漸降低，30 s時OTA降解率達最大值(22%)，30～180 s時，OTA降解率趨于平緩，無明顯變化。推測可能是在本試驗的強氧化條件下，乙腈分子發(fā)生聚合反應，形成共軛體系，對毒素分子形成保護作用，因而限制了降解率的進一步增加。此外，OTA分子較為復雜的分子結構，造成的較大空間位阻效應，也是限制反應的因素。

圖7 OTA在不同臭氧處理時間下的降解效果Figure 7 Degradation curve of OTA by ozone at different treat time

2.3.2 電子束輻照對OTA的降解效果

(1) 輻照劑量對OTA的降解效果：圖8顯示為0.5 μg/mL 的OTA標準工作液在不同輻照劑量下的降解效果。0～3 kGy劑量下，OTA降解速率最快，3 kGy時降解率即超過60%，隨后隨著輻照劑量的增加，OTA降解速率逐漸降低，但降解率始終呈升高趨勢，12 kGy時，OTA降解率達93.35%。該結果表明，電子束輻照對OTA具有良好的降解效果，具有廣闊的應用前景。

(2) OTA初始濃度對降解效果的影響：圖9顯示的是不同初始濃度的OTA標準工作液在不同輻照劑量下的降解效果。由圖9可知，在0.1～1.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，OTA濃度的增加對OTA的降解率無明顯影響。Peng等[21]研究了初始OTA濃度下電子束輻照降解效果，發(fā)現(xiàn)在水溶液中，0.1，0.2，20.0 mg/L OTA濃度下，達到90%降解率所需的輻照劑量分別為2.19，3.93，6.66 kGy。本研究采用有機溶劑體系，因此相同OTA濃度下，降解率低于前人研究。此外，由于本試驗選用OTA樣品濃度較小，也造成不同初始濃度的OTA降解效果無顯著差別。

圖8 輻照劑量對溶液中OTA降解效果的影響Figure 8 Degradation curve of OTA solution at different EB irradiation doses

圖9 初始濃度對溶液中OTA的降解效果Figure 9 Degradation curve of OTA solution at different initial concentrations

(3) 溶劑對降解效果的影響：圖10顯示的是將相同濃度梯度的OTA標準工作液氮吹至干，采用等體積甲醇復溶后進行電子束輻照，考察其對OTA降解效果的影響。由圖10可知，在0～6 kGy輻照劑量下，OTA在甲醇溶液中的降解速率明顯低于在標準工作液中，即OTA在乙腈溶液中，3 kGy 劑量下，OTA降解率即超過60%，而達到相同降解率的OTA甲醇溶液所需劑量為6 kGy；在6～12 kGy劑量下，OTA降解速率均逐漸減緩，12 kGy時甲醇溶液中OTA降解率達到87%，低于乙腈溶液中OTA 93%的降解率。

從結果可知，乙腈溶劑體系更有利于OTA的快速降解。原因與ZEN相同，一方面，甲醇溶劑對自由基和水合電子的捕獲作用降低了電子束輻照OTA分子產(chǎn)生的自由基量；另一方面，較高的輻照劑量下溶劑中生成的自由基量有限，不足以推動反應的快速進行，從而限制了OTA分子的降解。

圖10 溶劑體系對溶液中OTA的降解效果Figure 10 Degradation curve of OTA at different solution

3 結論

本研究采用不同濃度臭氧以及不同處理時間，分別對高濃度ZEN和相對低濃度的OTA標準溶液進行處理，結果臭氧氣體對ZEN的降解效果極佳，而在更高臭氧濃度和較長處理時間下，OTA降解率仍難以達到預期效果；采用0，3，6，9，12 kGy電子束輻照劑量，對甲醇和乙腈溶液中ZEN和OTA進行輻照，發(fā)現(xiàn)電子束輻照對ZEN和OTA均具有良好的降解效果，且毒素在乙腈中降解效果更佳。臭氧降解ZEN的效果優(yōu)于電子束輻照，而電子束輻照對OTA具有更好的降解效果。本研究為今后臭氧或電子束輻照降解ZEN和OTA污染食品提供了參考依據(jù)。今后需進一步研究臭氧和電子束輻照對ZEN和OTA降解效果差異的原因。

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