基于生物信息學(xué)方法的胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后風(fēng)險標(biāo)志物篩選

張志鵬，陸曄斌，陳泓西，夏華，孫維佳

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 膽胰外科，湖南 長沙 410008）

胰腺癌是目前最難診治的惡性腫瘤之一，其病死率幾乎與發(fā)病率持平。據(jù)統(tǒng)計，2015年美國胰腺癌新發(fā)48 960例，死亡40 560例，病死率在男女性別中均排第4位[1]。在全球范圍內(nèi)，預(yù)計2015年胰腺癌新發(fā)病例達(dá)到367 000例，死亡359 000例，如果預(yù)后得不到改善的話，胰腺癌將在下個10年內(nèi)成為癌癥相關(guān)性死亡的第二大主要原因[2-3]。胰腺導(dǎo)管腺癌是胰腺癌中最常見的病理類型，其比例超過90%，而其惡性程度也遠(yuǎn)高于其他10%，如黏液性囊腺癌和腺泡細(xì)胞癌等[4]。由于胰腺導(dǎo)管腺癌早期癥狀不明顯，缺乏特異性的腫瘤標(biāo)志物，并常伴有局部的神經(jīng)、血管侵犯及早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，當(dāng)確診時往往已處于進(jìn)展期，且對放化療不敏感，導(dǎo)致其總體5年生存率不到5%[5]。只有10%～20%的患者病灶局限，可采取手術(shù)治療，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)80%，其5年生存率也僅為15%～25%[6-7]。雖然近年來在胰腺癌的診斷及治療上取得了一些進(jìn)步，但患者的預(yù)后并未得到明顯的改善[8]。因此，探索胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后風(fēng)險標(biāo)志物可能會為它的治療提供新的思路。

本研究從癌癥基因組數(shù)據(jù)集（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫下載了胰腺導(dǎo)管腺癌患者的臨床資料、miRNA和gene表達(dá)譜數(shù)據(jù)。通過彈性網(wǎng)絡(luò)Cox比例風(fēng)險回歸分析（EN-Cox），繪制受試者工作特征（ROC）曲線和Kaplan-Meier曲線，篩選出了與胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后風(fēng)險明顯相關(guān)的miRNA和基因；然后對預(yù)后風(fēng)險miRNA的靶基因進(jìn)行功能預(yù)測，對預(yù)后風(fēng)險基因及預(yù)后風(fēng)險miRNA的靶基因進(jìn)行文獻(xiàn)挖掘和功能分析，從而發(fā)現(xiàn)潛在的胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后風(fēng)險標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

TCGA（https://cancergenome.nih.gov）數(shù)據(jù)庫包含腫瘤患者的臨床資料、腫瘤基因組特征和高通量分析數(shù)據(jù)，而且是迄今世界范圍內(nèi)最大、最成功的癌癥基因組數(shù)據(jù)庫。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載了197例胰腺癌患者的臨床資料，其中有150例為胰腺導(dǎo)管腺癌。在這150例胰腺導(dǎo)管腺癌中，有2例沒有準(zhǔn)確的總體生存時間（OS）而被剔除，即有148例具有完整的生存資料。

基于IlluminaHiSeq的高通量測序功能，下載了183例胰腺癌患者的miRNA和基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，包括上述148例胰腺導(dǎo)管腺癌的137例。這137例包含miRNA和基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的胰腺導(dǎo)管腺癌病例用于預(yù)后風(fēng)險標(biāo)志物的篩選。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

miRNA和基因表達(dá)值將以每100萬標(biāo)記讀本中每千堿基外顯子的讀本數(shù)（RPKM）[9]進(jìn)行估算。此外，不同樣本間通過中位數(shù)法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3 篩選可能的預(yù)后風(fēng)險miRNA和基因

EN是一種理想的變量選擇方法，既能有效處理共線性又可以降維。Cox是一種分析生存資料的半?yún)?shù)模型。EN-Cox則既能處理共線性又可以降維，是分析處理高維小樣本生存資料的理想模型。應(yīng)用EN-Cox篩選回歸分析的自變量，構(gòu)建回歸模型，篩選預(yù)后風(fēng)險因素。本研究利用R的glmnet包（https://cran.r-project.org/web/packages/glmnet/index.html）[10]完成EN-Cox回歸分析過程，篩選出可能的預(yù)后風(fēng)險miRNA和基因。參數(shù)為λ的最小值。

1.4 篩選預(yù)后風(fēng)險標(biāo)志物

在生物信息學(xué)研究中，ROC曲線常被用于評估分層效應(yīng)，Kaplan-Meier曲線常被用于生存資料的單變量統(tǒng)計分析。在本研究中，利用R（The R Project for Statistical Computing）的pROC包（https://cran.r-project.org/web/packages/pROC/index.html）[11]繪制ROC曲線，確定患者分組的截斷值，以此截斷值為分界將所有患者分為兩組，然后利用R的survival包（https://cran.r-project.org/web/packages/survival/index.html）[12]繪制KM曲線，通過Log-rank檢驗兩組患者的生存時間有無統(tǒng)計學(xué)差異。得到有差異的miRNA和基因被認(rèn)為與胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后風(fēng)險明顯相關(guān)。

1.5 預(yù)后風(fēng)險miRNA的功能預(yù)測

在MiRWalk（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2）[13]數(shù)據(jù)庫中篩選預(yù)后風(fēng)險miRNA的靶基因，并通過Cytoscape（http://www.cytoscape.org）構(gòu)建miRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。Cytoscape是一種資源開放的軟件，可用于數(shù)據(jù)整合和生物網(wǎng)絡(luò)的可視化處理[14]。進(jìn)而，對miRNA的靶基因進(jìn)行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）（http://www.kegg.jp）[15]及REACTOME（http://www.reatome.org）[16]信號通路、基因本體論（gene ontology，GO）（http://geneontology.org）[17]和疾病本體論（disease ontology，DO）（http://disease-ontology.org）富集分析。通過TargetMine數(shù)據(jù)庫的超幾何分析確定富集的信號通路、生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和疾病名稱。TargetMine（http://targetmine.mizuguchilab.org）[18]是一個用于檢索靶基因和蛋白的數(shù)據(jù)庫，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 預(yù)后風(fēng)險基因的文獻(xiàn)挖掘和功能分析

對預(yù)后風(fēng)險基因及預(yù)后風(fēng)險miRNA的靶基因進(jìn)行文獻(xiàn)挖掘和功能分析。通過TRRUST（http://www.grnpedia.org/trrust）數(shù)據(jù)庫檢索預(yù)后風(fēng)險基因的轉(zhuǎn)錄活性，并篩選出目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子的靶基因及其協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子，然后用Cytoscape繪制轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。TRRUST是目前已知最大的且有文獻(xiàn)證實的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，并可將靶基因的模塊化及轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同性顯示出來[19]。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理后，共得到137例胰腺導(dǎo)管腺癌中的797個miRNA和19 969個基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。

2.2 篩選可能的預(yù)后風(fēng)險miRNA和基因

λ=0.107被設(shè)為參數(shù)，基于此參數(shù)，共篩選出包括5個miRNA和54個基因在內(nèi)的59個預(yù)后風(fēng)險因素。

2.3 篩選預(yù)后風(fēng)險標(biāo)志物

根據(jù)ROC曲線的截斷值，將所有患者分為兩組，即miRNA或基因表達(dá)值低于截斷值者被歸于低表達(dá)組，miRNA或基因表達(dá)值高于截斷值者被歸于高表達(dá)組，共得到16個基因和1個miRNA（表1）。這17個預(yù)后風(fēng)險標(biāo)志物被認(rèn)為與胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后明顯相關(guān)（均P＜0.05）。

表1 風(fēng)險標(biāo)志物篩選結(jié)果Table 1 Results of prognostic risk marker identi fi cation

2.4 預(yù)后風(fēng)險miRNA的功能預(yù)測

在MiRWalk數(shù)據(jù)庫中檢索到miRNA-125a的靶基因有1 982個，其中miRNA-125a-3p有1 030個靶基因，而miRNA-125a-5p有1 021個（圖1）。miRNA-125a-3p的靶基因主要富集于甘油脂類代謝通路（KEGG），小分子物質(zhì)分解代謝過程（BP）和皮膚纖維瘤（DO）中（圖2），如成纖維細(xì)胞生長因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2）富集于皮膚纖維瘤。miRNA-125a-5p的靶基因主要富集于核酸結(jié)合區(qū)域富亮氨酸重復(fù)包含受體通路（KEGG）和淋巴細(xì)胞趨化性調(diào)控過程（BP）中（圖3）。

圖1 miRNA-125a及其靶基因的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò) （黃色矩形節(jié)點代表miRNA-125a-3p和miRNA-125a-5p，粉紅色與綠色橢圓節(jié)點代表miRNA-125a-3p和miRNA-125a-5p的靶基因，其中綠色橢圓節(jié)點同時也是本研究篩選出的預(yù)后風(fēng)險基因）Figure 1 The regulatory network of miRNA-125a and target genes (The yellow rectangle nodes representing miRNA-125a-3p and miRNA-125a-5p, the pink and green ellipse nodes representing the targets genes of miRNA-125a-3p and miRNA-125a-5p, of which the green ellipse nodes also the prognostic risk genes identi fi ed in this study)

圖2 miRNA-125a-3p靶基因的功能富集分析Figure 2 The functional enrichment analyses of the target genes of miRNA-125a-3p

圖3 miRNA-125a-5p靶基因的功能富集分析Figure 3 The functional enrichment analyses of the target genes of miRNA-125a-5p

2.5 預(yù)后風(fēng)險基因的文獻(xiàn)挖掘和功能分析

miRNA-125a共有1 982個靶基因，其中谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶μ4（GSTM4）既是miRNA-125a-5p的靶基因又是預(yù)后風(fēng)險基因，可誘導(dǎo)T細(xì)胞共刺激分子配體（ICOSLG）、精子發(fā)生相關(guān)2（SPATA2）既是miRNA-125a-3p的靶基因又是預(yù)后風(fēng)險基因。在16個預(yù)后風(fēng)險基因中，只有GATA結(jié)合蛋白1（GATA1）可編碼轉(zhuǎn)錄因子?；赥RRUST數(shù)據(jù)庫檢索到的GATA1的靶基因及協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子，通過Cytoscape軟件構(gòu)建GATA1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖4）。

圖4 GATA1與其靶基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)（綠色三角節(jié)點代表GATA1的靶基因，粉紅色矩形節(jié)點代表GATA1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）Figure 4 The transcriptional regulatory network of GATA1 and its target genes and transcriptional coregulators (The green triangle nodes representing the target genes of GATA1, and the pink rectangle nodes representing the transcriptional coregulators of GATA1)

3 討 論

胰腺癌是世界范圍內(nèi)最致命的惡性腫瘤之一，幾十年來其治療效果及預(yù)后仍然較差，而其病理類型的90%以上是胰腺導(dǎo)管腺癌[20]。由于胰腺導(dǎo)管腺癌缺乏典型的臨床表現(xiàn)及特異性的腫瘤標(biāo)志物，并常伴有血管神經(jīng)浸潤及早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和對傳統(tǒng)治療方法的高度抵抗，使得診斷時多處于進(jìn)展期，嚴(yán)重阻礙了其治療的實施及預(yù)后的改善[21]。因此，探索胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后風(fēng)險標(biāo)志物可能會為它的治療提供新的思路。

本研究發(fā)現(xiàn)了包括1個miRNA和16個基因在內(nèi)的17個預(yù)后風(fēng)險標(biāo)志物；同時檢索了miRNA的靶基因，并對其靶基因進(jìn)行功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)它們主要在皮膚纖維瘤和結(jié)締組織腫瘤中富集。此外，ICOSLG、SPATA2和GSTM4既是預(yù)后風(fēng)險基因又是預(yù)后風(fēng)險miRNA的靶基因。在16個預(yù)后風(fēng)險基因中，只有GATA1可編碼轉(zhuǎn)錄因子。研究結(jié)果提示這些預(yù)后風(fēng)險因子可能參與了胰腺導(dǎo)管腺癌的病理進(jìn)程。

miRNA-125a是本研究篩選到的唯一的一個miRNA。近年來對miRNA已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，其作用方式已經(jīng)相對明確，已被發(fā)現(xiàn)在許多生理及病理過程中發(fā)揮了重要作用。miRNA-125a有兩種形式：miRNA-125a-3p和miRNA-125a-5p，分別來源于miRNA-125a前體的3'端和5'端。Jiang等[22-23]發(fā)現(xiàn)，miRNA-125a的這兩種形式均可通過p53信號通路誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮抑癌基因的作用，不同的是miRNA-125a-3p不完全依靠該信號通路。Hashiguchi等[24]發(fā)現(xiàn)miRNA-125a-3p可抑制胃癌細(xì)胞的增殖，并與胃癌的臨床病理特征呈負(fù)相關(guān)，可作為一種潛在的預(yù)后風(fēng)險因子。Yang等[25]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析推測miRNA-125a-5p可能參與了胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，并有望成為治療的新靶點，與本次研究結(jié)果一致。

在16個預(yù)后風(fēng)險基因中，ICOSLG、SPATA2和GSTM4又屬于miRNA-125a的靶基因，其中ICOSLG、SPATA2為miRNA-125a-3p的靶基因，GSTM4為miRNA-125a-5p的靶基因。ICOSLG，其編碼的蛋白質(zhì)為可誘導(dǎo)T細(xì)胞共刺激分子配體（inducible T-cell co-stimulator ligand，ICOSLG），是B7家族成員之一，為新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞表面分子，常表達(dá)于B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞上[26]。ICOSLG為ICOS（可誘導(dǎo)T細(xì)胞共刺激分子）的唯一配體，后者是CD28超家族的成員，在活化的T細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上呈高表達(dá)。生理狀態(tài)下ICOS通過與細(xì)胞表面的ICOSLG相互作用，可促進(jìn)T細(xì)胞的活化、增殖與細(xì)胞因子的分泌。近年來的研究[27]顯示，ICOS/ICOSLG信號通路參與了炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)生。眾所周知，腫瘤的發(fā)生與免疫逃逸有關(guān)。Faget等[28]研究發(fā)現(xiàn)ICOS/ICOSLG的相互作用可通過抑制CD4+T淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)而促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展，并且ICOS+細(xì)胞的增多與乳腺癌較差的預(yù)后相關(guān)，從而認(rèn)為阻斷ICOS與ICOSLG的結(jié)合可作為乳腺癌臨床治療的新策略。

SPATA2，起初被稱為PD1，于1999年在人類睪丸cDNA文庫中被首次發(fā)現(xiàn)，后來研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與精子發(fā)生有關(guān)，遂更名為SPATA2，其編碼的蛋白質(zhì)為精子發(fā)生相關(guān)蛋白2[29]。Luca等[30]發(fā)現(xiàn)SPATA2可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞的有絲分裂；通過多克隆抗體抑制其表達(dá)后，促進(jìn)有絲分裂的能力明顯受限。此外，SPATA2還是NF-κB信號通路中的關(guān)鍵分子，可與關(guān)鍵蛋白CYLD結(jié)合，并將其招募至TNF受體復(fù)合物；SPATA2的缺失會促進(jìn)TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，并抑制其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[31]。因此，miRNA-125a-3p及其靶基因ICOSLG、SPATA2在胰腺導(dǎo)管腺癌的作用還有待進(jìn)一步的闡明。

GSTM4是谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferases，GSTs）家族μ亞族的成員，又是miRNA-125a-5p的靶基因。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶是一種催化谷胱甘肽與致癌物、藥物、毒性物質(zhì)及氧化應(yīng)激產(chǎn)物結(jié)合，以減少這些物質(zhì)對細(xì)胞成分產(chǎn)生毒性作用的的解毒酶。尤文肉瘤是小兒第二常見的骨與軟組織惡性腫瘤，而絕大多數(shù)尤文肉瘤是由染色體易位導(dǎo)致的EWS/FLI融合蛋白所引起的[32]。有研究[33]報道GSTM4是EWS/FLI融合蛋白的靶基因，GSTM4表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)尤文肉瘤的發(fā)生及化療抵抗，并與不良的預(yù)后相關(guān)；而GSTM4沉默則可以減少其惡性轉(zhuǎn)化并增強(qiáng)對化療藥物的敏感性，從而認(rèn)為GSTM4可作為尤文肉瘤的潛在治療靶點。結(jié)合本研究結(jié)果，筆者推測miRNA-125a-5p可能通過靶向抑制GSTM4的表達(dá)，在胰腺導(dǎo)管腺癌中發(fā)揮抑癌作用。

在16個預(yù)后風(fēng)險基因中，只有GATA1可編碼轉(zhuǎn)錄因子。GATA1，其編碼的蛋白質(zhì)為GATA結(jié)合蛋白1（GATA binding protein 1），因能特異性地結(jié)合血紅蛋白基因調(diào)控區(qū)域的GATA蛋白而被發(fā)現(xiàn)，是GATA家族第一個被發(fā)現(xiàn)的成員[34]。GATA1可直接抑制細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如Kit、Myc和Myb等促癌基因，失去對這些靶基因的抑制會導(dǎo)致幼稚紅細(xì)胞的大量增殖[35]。唐氏綜合征（又稱21-三體綜合征）的患兒有發(fā)生急性巨核細(xì)胞白血病的高風(fēng)險。幾乎所有發(fā)展為急性巨核細(xì)胞白血病的唐氏綜合征患者都含有GATA1的體細(xì)胞突變，而無GATA1突變的唐氏綜合征患者則不發(fā)展為白血病[36]。因此，GATA1是否突變可作為識別唐氏綜合征患兒發(fā)生白血病的潛在預(yù)測指標(biāo)，尚未見GATA1在胰腺癌中的研究報道。

除了上述提到的基因外，本研究還發(fā)現(xiàn)了其他幾個預(yù)后風(fēng)險基因，但在胰腺癌中的作用還有待闡明?？傊?，本次生物信息學(xué)分析將有望為探索胰腺癌的發(fā)病機(jī)制和治療提供新的思路和方向，但還需要后續(xù)的實驗證實。

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