牛場肥水灌溉冬小麥對(duì)不同土層中氨氧化細(xì)菌群落多樣性的影響

崔丹瑤，孫 溪，高文萱

(1.農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191；2.天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；3. 天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384)

施肥是對(duì)作物管理最具有影響力的方式之一[1]，土壤中不同群類微生物，如氨氧化細(xì)菌(Ammonia-oxidizing bacteria，AOB )，均受到不同施肥制度的影響[2]。氨氧化細(xì)菌作為土壤硝化作用的主要驅(qū)動(dòng)者[3,4]，通過控制氨單加氧酶(amoA)的活性來影響硝化作用的亞硝化過程[5]，該過程是硝化作用的限速步驟[6]。硝化作用是土壤氮素循環(huán)的主要方式，也是氮素流失的潛在途徑之一[7]，所以研究施肥對(duì)氨氧化細(xì)菌的影響是土壤微生物生態(tài)學(xué)的重要組成部分，氨氧化細(xì)菌也被稱為土壤生態(tài)學(xué)的模式生物[8]。研究不同施肥條件下，土壤中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性對(duì)于檢測土地質(zhì)量及作物的生產(chǎn)水平是極為重要的。

由于土壤中99%的微生物無法在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)[9]，所以學(xué)者們越來越熱衷于通過分子生物學(xué)的方法來研究土壤中微生物的群落多樣性。1997年Rotthauwe等[10]用PCR法擴(kuò)增amoA基因,對(duì)氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。2012年，王亞男等[11]通過對(duì)amoA基因TRFLP-PCR與qPCR技術(shù)相結(jié)合的方法，研究了不同處理下AOB的群落組成和豐度的變化，得出了施肥類型和土壤層次均是影響AOB群落豐度和結(jié)構(gòu)組成的重要因素的結(jié)論。2015年，周志成等[12]通過建立amoA克隆文庫，研究在紅壤蔬菜田上施加無機(jī)肥與有機(jī)肥等AOB和AOA的多樣性，結(jié)論為有機(jī)肥比無機(jī)肥提高了AOB與AOA的多樣性。

牛場肥水中含有大量的氮素資源[13]，而這些氮素資源常常得不到再循環(huán)利用，而是被排放到地下水中，造成水資源污染。而近些年，中國農(nóng)業(yè)用水已占全國總用水量的60%[14]，那么將牛場肥水作為灌溉水，循環(huán)利用于作物土壤中，既不造成污染，又解決了用水問題，這是人們一直所期待的[15]。目前研究施肥制度對(duì)土壤中微生物群落多樣性的影響主要是針對(duì)施肥種類(包括無機(jī)肥，有機(jī)肥，無機(jī)肥與有機(jī)肥配施等)[16-18]，而針對(duì)作物不同生長期，進(jìn)行次數(shù)控制的施肥對(duì)于讓微生物的影響則研究較少。而且，大部分對(duì)于AOB群落多樣性的研究多為表層土(0～5 cm或0～20 cm)[19-20]，研究20～40 cm土層的則比較少。本文研究了牛場肥水灌溉對(duì)于0～20 cm土層與20～40 cm土層的AOB群落多樣性，為肥水灌溉的科學(xué)管理提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

本試驗(yàn)中采集土壤樣品的地點(diǎn)位于河北省徐水縣梁家營施肥田(38°09-39°09N，115°19-115°46E)，該地處于太行山東麓，河北省中部，屬大陸性季風(fēng)氣候。

1.2 試驗(yàn)材料處理

試驗(yàn)共設(shè)置8個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置3組平行，分別為各生長期均用清水灌溉的CK組；播種后、拔節(jié)期為無機(jī)肥處理的CF組；其余6組編為T1～T6，為不同時(shí)期，不同濃度的牛場肥水灌溉處理，各個(gè)處理施肥量詳情見表1。

試驗(yàn)小區(qū)長9 m寬6 m，中間有1 m保護(hù)行。作物的種植方式為冬小麥與夏玉米交替種植，試驗(yàn)中的小麥品種為濟(jì)麥22，玉米品種為農(nóng)大221，牛場肥水的沼液原液成分見表2。

表1 各處理中的施肥量Tab.1 Fertilizer amount in different treatment

表2 肥水沼液原液成分Tab.2 The composition of cattle biogas slurry

1.3 樣品采集

樣品采集的時(shí)間為小麥?zhǔn)崭詈蟮?月中旬，采用“五點(diǎn)法”進(jìn)行樣品采集，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)采集0～20 cm與20～40 cm兩個(gè)土層的土樣，去除雜草、秸稈、碎石等，將同一土層的5個(gè)土樣混合，裝入密閉塑封袋中，暫時(shí)在冰盒中保存，后存放于-20 ℃冰箱中。

1.4 土壤總DNA提取

采用FastDNA? SPIN Kit For Soil試劑盒提取土壤中DNA基因組，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照說明書進(jìn)行。使用Nano Drop核酸蛋白儀對(duì)DNA的濃度進(jìn)行測定，根據(jù)測定結(jié)果對(duì)DNA進(jìn)行稀釋，存放于-20 ℃冰箱，供后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.5 PCR擴(kuò)增及酶切分析

PCR擴(kuò)增的引物與反應(yīng)條件如表3所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，使用MSP I(TAKARA)進(jìn)行酶切反應(yīng)[21]，體系參考說明書。將酶切產(chǎn)物送往生物公司進(jìn)行檢測。

表3 PCR反應(yīng)條件Tab.3 PCR reaction condition

注：①上下游引物分別標(biāo)注為F和R; ②S=Cor G; W=Aor T; ③用6-FAM對(duì)上游引物進(jìn)行熒光標(biāo)記。

1.6 克隆及測序分析

將1.5中的純化產(chǎn)物與T載體連接，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，將篩選得到的100個(gè)經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證的陽性克隆子送往生物公司測序。

1.7 數(shù)據(jù)處理

結(jié)合T-RFLP數(shù)據(jù)，計(jì)算0～20 cm與20～40 cm兩個(gè)土層中氨氧化細(xì)菌的多樣性指數(shù)，并用CANOCO for Windows 4.5 軟件進(jìn)行主成分(PCA)分析。用MEGA 6.0構(gòu)建兩個(gè)土層的amoA基因系統(tǒng)發(fā)育樹，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 施肥對(duì)0～20 cm土層氨氧化細(xì)菌的影響

2.1.1 不同施肥處理下氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化

將MSP I酶切amoA基因的T-RFLP結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，如圖1可見，共有16種片段，但56 bp、66 bp、156 bp、235 bp、256 bp在所有片段中所占百分比比例較高，占主導(dǎo)地位，為優(yōu)勢菌群。

圖1 0～20cm土層不同處理氨氧化細(xì)菌(AOB)T-RFs 相對(duì)豐度百分比
Fig.1 0～20 cm layer relative abundance of AOB amoA T-RFs in different fertilization treatments

對(duì)0～20 cm土層的T-RFs進(jìn)行主成分分析(PCA)，結(jié)果如圖2所示，主成分1(PC1)解釋了77.2%的物種變量，主成分2(PC2)解釋了13.2%的物種變量。除T1之外的牛場肥水灌溉處理(T2、T3、T4、T5、T6)均在PC1的負(fù)軸，而清水處理(CK)和無機(jī)肥處理(CF)均在PC1的正軸，且明顯分開。除T1處理之外，牛場肥水灌溉降低了主要成分所占的比例，無機(jī)肥處理提高了主要成分比例，不同牛場肥水處理之間對(duì)群落結(jié)構(gòu)的影響并不明顯。

對(duì)0～20 cm土層氨氧化細(xì)菌的主成分2(PC2)進(jìn)行分析，與無機(jī)肥處理(CF)相比，清水灌溉處理(CK)對(duì)次要成分的影響最大；T1、T6、T3、T4這四個(gè)處理在PC2上相差不大，說明CF處理增加了氨氧化細(xì)菌的次要種類，而不同牛場肥水灌溉對(duì)其無明顯影響。

圖2 0～20 cm土層氨氧化細(xì)菌主成分(PCA)分析Fig.2 0～20 cm layer AOB principal component analysis(PCA)

2.1.2 不同施肥處理對(duì)氨氧化細(xì)菌群落多樣性的影響

根據(jù)表4所示，Shannon-Weiner(H)、Simpson(D)、Pielou(E)指數(shù)中，T1處理均為最大值，說明T1處理在一定程度上增加了0～20 cm土層中氨氧化細(xì)菌的多樣性和豐富度，且效果顯著；T4處理均為最小值，說明T4處理在一定程度上降低了0～20 cm土層中氨氧化細(xì)菌的多樣性，T5與CK相比，能增加土壤中AOB的種群多樣性但效果不明顯。

表4 0～20 cm土層各處理的多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表Tab.4 0～20 cm layer diversity index in different treatment

注：不同英文字母表示P<0.05 水平差異顯著性。

2.1.3 氨氧化細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

對(duì)于0～20 cm土層的氨氧化細(xì)菌克隆文庫，共挑取了107個(gè)經(jīng)PCR驗(yàn)證后的陽性克隆子。經(jīng)BLAST比對(duì)后，按酶切片段進(jìn)行分型，得到18個(gè)典型的操作分類單元(OTU)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

參考先前文獻(xiàn)中被廣泛認(rèn)可的命名方式，對(duì)氨氧化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行命名[22]。從圖3可知，多數(shù)序列屬于β-變形菌門，主要包括亞硝化螺菌屬(Nitrosospira) cluster 3a、3b、cluster 2及亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas) cluster 6。結(jié)合表5可以看出屬于Nitrosospira cluster3a的片段包括156和256bp，屬于Nitrosospira cluster 3b的片段包括60 bp，235 bp，Nitrosospira cluster 2的片段包括50 bp與60 bp，Nitrosomonas cluster 6的片段包括56 bp與235 bp。根據(jù)表5顯示，60 bp與235 bp所占的比例較多。Nitrosospira屬的氨氧化細(xì)菌所占比例約為95%，為主要菌群。Nitrosomonas類群所占比例約為5%。

圖3 0～20 cm土層amoA序列的氨氧化細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Tree of ammonia oxidizing bacteria based on analysis of 0～20 cm amoA sequences

T-RFsOTUs代表的克隆子數(shù)克隆子所占比例/%登錄號(hào)近緣種相似性/%50OTU111.041HQ638970.1unculturedammonia-oxidizingbacterium10056OTU211.041KT001130.1unculturedbacterium10060OTU322.083EU624876.1unculturedammonia-oxidizingbacterium99OTU422.083KP781201.1unculturedammonia-oxidizingbacterium100OTU511.041KP783327.1unculturedbetaproteobacterium97OTU63637.5HQ875335.1unculturedammonia-oxidizingbacterium100OTU755.208KM520895.1unculturedbetaproteobacterium100OTU81313.541KP781219.1unculturedammonia-oxidizingbacterium99156OTU911.041KT768084.1unculturedammonia-oxidizingbacterium100OTU1011.041KT768084.1unculturedammonia-oxidizingbacterium100OTU1122.083KM520900.1unculturedbetaproteobacterium100OTU1288.333KR081225.1unculturedammonia-oxidizingbacterium100

續(xù)表5 0～20cm土層氨氧化細(xì)菌的T-RFLP 與 OTUs 序列的模擬酶切比對(duì)結(jié)果

2.2 施肥對(duì)20～40 cm 氨氧化細(xì)菌的影響

2.2.1 不同施肥處理下氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化

同樣使用限制性內(nèi)切酶MSP I進(jìn)行酶切，將T-RFLP結(jié)果總結(jié)，如圖4所示，共有14種片段。其中有4個(gè)主要片段：56、66、156、235 bp，為20～40 cm土層中AOB的優(yōu)勢菌群。不同施肥處理間，氨氧化細(xì)菌優(yōu)勢菌群的差異不明顯，與0～20 cm土層中的情況相同，56 bp代表的氨氧化細(xì)菌是最具有優(yōu)勢的種群。

圖4 20～40 cm土層不同處理氨氧化細(xì)菌(AOB)T-RFs 相對(duì)豐度百分比
Fig.4 20～40 cm relative abundance of AOB ’ s T-RFs in different treatments

對(duì)20～40 cm土層的T-RFLP結(jié)果中的T-RFs進(jìn)行主成分分析(PCA)，如圖5。主成分1(PC1)解釋了38.8%的物種變量，主成分2(PC2)解釋了28.5%的物種變量。T3、T4、T5、T6均在PC1的正軸，CK、CF、T1、T2均在PC1的負(fù)軸，說明不同濃度的牛場肥水處理對(duì)氨氧化細(xì)菌的主要種類的影響是不同的。T5處理在PC2正軸的最遠(yuǎn)處，說明高濃度的牛場肥水灌溉會(huì)對(duì)20～40 cm的次要成分造成明顯影響。CK、CF、T1、T2這4種處理均在PC2的正軸，但距離很近，說明清水處理，無機(jī)肥處理，牛場肥水處理都會(huì)對(duì)氨氧化細(xì)菌的次要種類有所增加，但相互之間的差別不明顯。

2.2.2 不同施肥處理對(duì)氨氧化細(xì)菌群落多樣性的影響

根據(jù)T-RFLP數(shù)據(jù)分析結(jié)果，計(jì)算出3個(gè)關(guān)于生物多樣性的指數(shù)，如表6。Shannon -Weiner (H)、Simpson (D)、Pielou(E)指數(shù)T1處理均為最大，T4、T6均小于CK組，說明T1組的處理明顯增加了20～40 cm土層中AOB的群落多樣性和豐富度，T4和T6在一定程度上降低了AOB的群落多樣性和豐富度，這與0～20 cm土層的情況相一致。

圖5 20～40 cm土層氨氧化細(xì)菌主成分(PCA)分析Fig.5 20～40 cm layer AOB principal component analysis(PCA)

處理指數(shù)H指數(shù)D指數(shù)ECK1.593±0.094a0.703±0.036a0.715±0.046aCF1.641±0.094a0.754±0.036a0.807±0.046aT11.76±0.094a0.776±0.036a0.808±0.046aT21.704±0.094a0.762±0.036a0.793±0.046aT31.681±0.094a0.735±0.036a0.761±0.046aT41.524±0.116a0.667±0.045a0.701±0.056aT51.566±0.094a0.705±0.036a0.76±0.046aT61.51±0.094a0.68±0.036a0.683±0.046a

注：不同英文字母表示P<0.05 水平差異顯著性。

為探究0～20 cm土層與20～40 cm土層之間是否具有顯著性差異，選取T1、T4、CK、CF這四個(gè)處理，對(duì)它們的Shannon-wiener (H) 指數(shù)、Simpson (D) 指數(shù)Pielou (E) 指數(shù)進(jìn)行橫向比較。根據(jù)表7、表8顯示，T1處理與CF處理對(duì)于兩個(gè)不同土層中AOB的群落多樣性和均勻度具有顯著的影響。說明在T1與CF處理時(shí)，不同的土壤深度，其AOB群落多樣性和均勻度也是不同的。

2.2.3 氨氧化細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從系統(tǒng)發(fā)育樹圖6可知，多數(shù)序列屬于β-變形菌門，這與0～20 cm土層情況相同。但在20～40 cm土層，氨氧化細(xì)菌主要包括Nitrosospira cluster 3a、3b、4,共3個(gè)屬。結(jié)合表9進(jìn)行分析，Nitrosospira cluster 3a中只有156 bp；屬于Nitrosospira cluster 3b的片段有56 bp，66 bp，156 bp，235 bp和256 bp；Ni-trosospira cluster 4的片段為60 bp。與0～20 cm土層情況不同的是，20～40 cm土層中，不存在Nitrosospira cluster 2與Nitrosomonas cluster 6這兩個(gè)屬，這說明0～20 cm與20～40 cm土層中的微生物群落是不相同的。

表7 T1、T4、CK、CF Shannon-wiener 指數(shù)橫向比較Tab.7 T1、T4、CK、CFtransverse comparisonofShannon-wienerindex

注：不同英文字母表示P<0.05 水平差異顯著性。

表8 T1、T4、CK、CF Pielou 指數(shù)橫向比較Tab.8 T1、T4、CK、CF transverse comparison of Pielou index

注：不同英文字母表示P<0.05 水平差異顯著性。

圖6 20～40 cm土層amoA序列的氨氧化細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Tree of ammonia oxidizing bacteria based on analysis of 20～40 cm amoA sequences

3 討論與結(jié)論

本文采用T-RFLP技術(shù)，研究了不同施肥制度下，牛場肥水灌溉對(duì)0～20 cm土層與20～40 cm土層中AOB的群落結(jié)構(gòu)變化。根據(jù)表4顯示：CF的Shannon-wiener(H) 指數(shù)大于CK，這說明無機(jī)肥處理(CF)比清水灌溉(CK)更能促進(jìn)土壤中氨氧化細(xì)菌的多樣性；T1的H指數(shù)大于CF，說明中等濃度的肥水灌溉(T1)處理比無機(jī)肥灌溉(CF)能夠更好地促進(jìn)土壤中氨氧化細(xì)菌的群落多樣性；CK、T5、T6這3種處理的H指數(shù)差別較小，說明相同時(shí)期，相同灌溉次數(shù)，高濃度的牛場肥水(T5)或低濃度的牛場肥水(T6)對(duì)AOB的多樣性影響與清水灌溉(CK)效果相似。王亞男等[11]發(fā)現(xiàn)1/2MNPK(有機(jī)肥與無機(jī)肥混合)處理的amoA基因拷貝數(shù)要大于MNPK，MNPK處理并沒有因?yàn)楦邼舛鹊牡囟黾油寥乐蠥OB的多樣性，這與本文的發(fā)現(xiàn)相一致。

20～40 cm土層中AOB多樣性指數(shù)如表6，T1、T2、T3、T4的多樣性指數(shù)(H)之間的關(guān)系與表層土不同，為T1>T2>T3>T4，這說明在相同的牛場肥水濃度下，施肥次數(shù)與AOB群落多樣性之間呈反比例關(guān)系，T1處理(105 kg N/hm2，39 kg P2O5/hm2，清水∶沼液=2∶1，1次灌溉)促進(jìn)了AOB的群落多樣性，T4處理(420 kg N/hm2，156 kg P2O5/hm2，清水∶沼液=2∶1，4次灌溉)抑制了AOB的群落多樣性。這是因?yàn)樵?～20 cm土層中，土壤中的可用資源較多，群落之間的競爭關(guān)系弱，為微生物提供了良好的生存環(huán)境，多樣性指數(shù)較高。但隨著土層的加深，資源的有限性和環(huán)境的同質(zhì)性使得生態(tài)條件不能夠充分滿足土壤微生物的生長需求[23]，于是不同群落之間的競爭關(guān)系變強(qiáng)，出現(xiàn)了明顯且穩(wěn)定的優(yōu)勢群落。施肥次數(shù)的增加會(huì)使氮素等成分增加，優(yōu)勢種群生長旺盛，進(jìn)而抑制了其他的種群，使AOB的群落多樣性和豐富度降低。這與前人研究發(fā)現(xiàn)的不同類型氨氧化細(xì)菌對(duì)土壤基質(zhì)與銨離子的敏感度不同，不同的氮素濃度會(huì)改變氨氧化細(xì)菌的主要種類的結(jié)論一致[24-25]。 在施肥方式一定的情況下，0～20 cm土層的多樣性指數(shù)(Shannon-wiener指數(shù)，Simpson指數(shù)，Pielou指數(shù))均比20～40 cm的多樣性指數(shù)高。這與前人分析的結(jié)果相一致。Griffiths等[26]利用16S rDNA PCR擴(kuò)增和DGGE的方法檢測了測了0～5，5～10，10～15，15～20 cm，4個(gè)土層中細(xì)菌群落及多樣性。發(fā)現(xiàn)0～5 cm多樣性高，養(yǎng)分被利用得充分，越深的土層多樣性越低。

表9 20～40 cm土層氨氧化細(xì)菌的T-RFLP與OTUs序列的模擬酶切比對(duì)結(jié)果Tab.9 20～40 cm layer ammonia-oxidizing bacteria comparison between T-RFLP patterns and OTUs sequences

根據(jù)圖1和圖4顯示，56 bp代表的氨氧化細(xì)菌在0～20 cm土層中，各處理的豐度與CK組相比，差異很大；而20～40 cm土層中各組處理的豐度變化則較小。說明56 bp代表的氨氧化細(xì)菌能夠更好地適應(yīng)深層土的環(huán)境，充分利用施肥后土壤中的養(yǎng)分，與其他種群競爭，從而成為優(yōu)勢種群。施肥次數(shù)越多，此類氨氧化細(xì)菌生長越旺盛，群落總體的多樣性降低，均勻度也降低。

235 bp代表的氨氧化細(xì)菌，在0～20 cm土層中，所占豐度變化浮動(dòng)較小；在20～40 cm土層中，235bp所占百分比依舊穩(wěn)定，各處理之間變化浮動(dòng)較小。而且發(fā)現(xiàn)兩個(gè)土層中清水灌溉(CK)，無機(jī)肥(CF)，中等含氮量的肥水(T1)，高含氮量的肥水(T5)之間的豐度差別不大，說明235 bp片段代表的在群落中所占比例相對(duì)穩(wěn)定，推測235 bp代表的氨氧化細(xì)菌對(duì)銨濃度不敏感。結(jié)合0～20 cm系統(tǒng)發(fā)育樹，235 bp代表的氨氧化細(xì)菌屬于亞硝化螺菌屬(Nitrosospira )cluster 3b和亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)cluster 6，而根據(jù)前人的研究顯示，王亞男等[27]證實(shí)，Nitrosospira cluster 3 在不同濃度的氮肥處理中均處于優(yōu)勢種群，推測Nitrosospira cluster 3 屬對(duì)銨離子濃度不敏感，與本文研究相符。

根據(jù)圖3與圖6的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，兩個(gè)土層中的AOB均包括Nitrosospira cluster 3a，Nitrosospira cluster 3b這兩個(gè)屬，并稱為Nitrosospira cluster 3屬，這說明在長期施肥的條件下，不同土層中，優(yōu)勢種屬?zèng)]有發(fā)生改變，且Nitrosospira屬占的比例分別為95%與100%，這與前人研究得出的土壤中氨氧化細(xì)菌以亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)為主，而非亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)的結(jié)論相一致[28-31]．但在20～40 cm土層中，沒有Nitrosospira cluster 2與Nitrosomonas cluster 6這兩個(gè)屬，說明不同的土層在不同程度上改變了氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

[1] Li J,Zhao B Q, Li X Y, et al. Effects of long-term combined application of organic and mineral fertilizer on microbial biomass, soil enzyme activities and soil fertility. Agriculture Sciences in China, 2008,7(3):336-343.

[2] 畢明麗,宇萬太,江子紹,等.施肥和土壤管理對(duì)土壤微生物生物量碳氮和群落結(jié)構(gòu)的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2010,30(1):0 032-0 042.

[3] 武傳東,辛 亮,李秀穎,等.長期施肥對(duì)黃土旱塬黑壚土AOA群落多樣性和豐度的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(20):4 230-4 239.

[4] 武志杰,史云峰,陳利軍.硝化抑制作用機(jī)理研究進(jìn)展[J].土壤通報(bào),2008,39(4):962-970.

[5] 張 偉.硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)及氨單加氧酶基因片段的PCR擴(kuò)增[D].浙江:浙江大學(xué),2002.

[6] 汪 峰,曲浩麗,丁玉芳,等.三種農(nóng)田土壤中氨氧化細(xì)菌amoA 基因多樣性比較分析[J].土壤學(xué)報(bào),2012,49(2):347-353.

[7] 鮑俊丹,石 美,張妹婷等.中國典型土壤硝化作用與土壤性質(zhì)的關(guān)系[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(7):1 390-1 398.

[8] Horz H P, Barbrook A, Field C B, et al. Ammonia-oxidizing bacteria respond to multifactorial global change[J]. PNAS, 2004,101(42):15 136-15 141.

[9] 邱 權(quán),陳雯莉.三峽庫區(qū)小江流域消落區(qū)土壤微生物多樣性[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,32(3):15-20.

[10] Rotthauwe J H, Witze K P, Liesack W. The ammonia monooxygenases-tructural gene amoA as a functional marker:Molecular fine scaleanalysis of natural ammonia-oxidizing populations[J].Applied and Environ-mental Microbiology, 1997, 63(2)：4 704-4 712.

[11] 王亞男,曾希柏,俄勝哲等. 施肥對(duì)設(shè)施菜地氨氧化細(xì)菌群落和豐度的影響[J],.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2012,31(12):2 425-2 432.

[12] 周志成,羅葵,唐前君等.不同施肥方式對(duì)紅壤蔬菜田氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌群落的影響[J].中國蔬菜,2015,(7):33-39.

[13] 杜會(huì)英,馮潔,郭海剛等.麥季牛場肥水灌溉對(duì)冬小麥-夏玉米輪作土壤氮素平衡的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2015，31(3)：159-165.

[14] 中華人民共和國國家統(tǒng)計(jì)局.中國統(tǒng)計(jì)年鑒2013[M].北京:中國統(tǒng)計(jì)出版社,2013.

[15] 袁耀武,張 偉,李英軍,等.污水灌溉對(duì)土壤中不同微生物類群數(shù)量的影響[J].節(jié)水灌溉,2003,(6):15-17.

[16] 裴雪霞,周 衛(wèi).長期施肥對(duì)黃棕壤性水稻土氨氧化細(xì)菌多樣性的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào),2011,17(3): 724- 730.

[17] 王亞男,曾希柏,王玉忠,等.設(shè)施蔬菜種植年限對(duì)氮素循環(huán)微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2014,25(4):1 115 -1 124.

[18] 劉振香,劉 鵬,賈緒存,等.不同水肥處理對(duì)夏玉米田土壤微生物特性的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2015,26(1):113-121.

[19] 辜運(yùn)富,云 翔,張小平,等.不同施肥處理對(duì)石灰性紫色土微生物數(shù)量及氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008,41(12):4 119-4 126.

[20] 袁 飛.不同農(nóng)田土壤中的硝化作用及硝化細(xì)菌種群[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[21] 王 婷,劉麗麗,張克強(qiáng),等.牛場肥水灌溉對(duì)土壤氨氧化微生物的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2015,34(9):1 737-1 746.

[22] HAO Yong-Jun,WU Song-Wei,WUWei-Xiang,et al.Research progress on them icrobial ecology of aerobic ammonia-oxidizing bacteria.Acta Ecologica Sinica,2007,27(4):1 573- 1 582.

[23] 夏北成.植被對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 1998,9(3):296-300.

[24] Webster G, Embley T M, Freitag T E, et al. Links between ammonia oxidizer species composition, functional diversity and nitrification kinetics in grassland soils[J]. Environmental Microbiology, 2005,(7):676-684.

[25] Suwa Y, Imamura Y, Suzuki T, et al. Ammonia-oxidizing bacteria with different sensitivities to( NH4)2SO4in activated sludges[J]. Water Resources, 1994,28:1 523-1 532.

[26] Griffiths R I, Whiteley A S, O Donnell A G, et al. Influence of depth and sampling time on bacterial community structure in an upland grassland soil[J]. FEMS Microbio Eco, 2003,43:35-43.

[27] 王亞男,曾希柏,俄勝哲,等.施肥對(duì)設(shè)施菜地氨氧化細(xì)菌群落和豐度的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào).2012,31(12):2 425-2 432.

[28] Yuan F,Ran W,Hu J,et al.Ammonia-oxidizing bacteria communities and their influence on the nitrification potential of chinese soils measured by denaturing gradient gel electrophoresis ( DGGE)[J].Acta Ecologica Sinica,2005,25(6):1 318-1 324(in Chinese).

[29] Kowalchuk GA,Stephen JR.Ammonia-oxidizing bacteria: A model for molecular microbiaEcology[J].Annual Review of Microbiology.2001,55:485-529.

[30] Fierer N,Carney KM,Horner Devine MC,et al.The biogeography of ammonia-oxidizing bacterial communities in soil[J].Soil Microbiology,2009,58:435-445.

[31] Yin J,Xu WF.Ammonia biofiltration and community analysis of ammonia-oxidizing bacteria in Biofilters[J].Bioresource Technology，2009,100:3 869-3 876.