連翹中連翹苷的提取方法研究

閆久江

摘 要：本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以高效液相色譜法測定從連翹藥材中提出連翹苷的量為考察指標(biāo)，考察提取次數(shù)、加水倍數(shù)、提取時(shí)間3個(gè)因素。含量測定方法：色譜柱為安捷倫Cl8規(guī)格為（4.6mm×250mm，5μm）；流動相以乙腈-水（22：88）；檢測波長為277nm；流速1.0mL·min-1；柱溫：35℃。連翹苷對照品在50～350μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。連翹苷平均回收率分別為99.6%。連翹苷最佳提取工藝為加入8倍量水，煎煮提取90分鐘，連續(xù)提取2次。本工藝穩(wěn)定、可行、收率高；測定方法簡便、準(zhǔn)確。

關(guān)鍵詞：連翹；提??；工藝

連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspensa （Thunb.）Vahl的干燥果實(shí)。連翹分布遼寧、河北、河南、山東、江蘇、湖北、江西、云南、山西、陜西、甘肅等地。連翹具有清熱解毒，消腫散結(jié)等功效?！度杖A子本草》記載："通小腸，排膿。治瘡癤，止痛，通月經(jīng)。"連翹常用于癰疽、乳癰、風(fēng)熱感冒、神昏發(fā)斑、溫病初起、溫?zé)崛霠I、熱淋尿閉等。連翹具有改善學(xué)習(xí)記憶障礙、舒張血管、抗氧化、抗菌、抗感染、解熱、抗DNA損傷、防護(hù)耳毒性等藥理作用。連翹苷為連翹主要成分之一。連翹苷作為藥用的為木犀科植物連翹Forsythia suspensa （Thunb.） Vahl的干燥果實(shí)的提取物，具有清熱、解毒、散結(jié)排膿等功效。本實(shí)驗(yàn)以連翹苷為指標(biāo)對連翹提取工藝進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

實(shí)驗(yàn)室用高純水制備器（北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司）；TMSH-6050B超級恒溫水槽（上海添時(shí)科學(xué)儀器有限公司）；FA1204CFAC型全自動內(nèi)校電子分析天平（北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司）；EX1600四元低壓梯度液相色譜儀（南京皓而普分析設(shè)備有限公司）；TY-727型可見分光光度計(jì)（臺州斯帕克儀器儀表有限公司）；PHS-550智能型臺式酸度計(jì)（杭州陸恒生物科技有限公司）；WP-UP-Ⅲ-20精密型實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）。連翹苷對照品（中國藥品生物制品檢定所提供）。乙腈（北京亞太龍興化工有限公司）；甲醇（北京亞太龍興化工有限公司）；乙醇（北京亞太龍興化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 單因素考察

2.2.1 提取次數(shù)

取連翹除去雜質(zhì)，篩去脫落的心及灰屑，至于圓底燒瓶內(nèi)，分別提取四次，第一次加10倍水，煎煮提取60分鐘，過濾，合并濾液，減壓濃縮；第二次加10倍水，煎煮提取60分鐘，連續(xù)提取兩次，過濾，合并濾液，減壓濃縮；第三次加10倍水，煎煮提取60分鐘，連續(xù)提取三次，過濾，合并濾液，減壓濃縮。第四次加10倍水，煎煮提取60分鐘，連續(xù)提取四次，過濾，合并濾液，減壓濃縮。采用高效液相測定濃縮膏中連翹苷含量并計(jì)算連翹苷收率。

2.1.2 加水倍數(shù)

取連翹除去雜質(zhì)，篩去脫落的心及灰屑，至于圓底燒瓶內(nèi)，分別提取四次，第一次加14倍水，煎煮提取60分鐘，連續(xù)四次，第二次加12倍水，煎煮提取60分鐘，連續(xù)四次，第三次加10倍水，煎煮提取60分鐘，連續(xù)四次，第四次加8倍水，煎煮提取60分鐘，連續(xù)四次，分別過濾，合并濾液，減壓濃縮。采用高效液相測定濃縮膏中連翹苷含量并計(jì)算連翹苷收率。

2.1.3 提取時(shí)間

取連翹除去雜質(zhì)，篩去脫落的心及灰屑，至于圓底燒瓶內(nèi)，分別提取三次，第一次加10倍水，煎煮提取60分鐘，連續(xù)四次，第二次加10倍水，煎煮提取90分鐘，連續(xù)四次，第三次加10倍水，煎煮提取120分鐘，連續(xù)四次，分別過濾，合并濾液，減壓濃縮。采用高效液相測定濃縮膏中連翹苷含量并計(jì)算連翹苷收率。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取次數(shù)、加水倍數(shù)和提取時(shí)間對連翹苷收率影響較大。選擇提取次數(shù)、加水倍數(shù)和提取時(shí)間作為考察因素，采用正交試驗(yàn)法對影響提取效率的其它工藝條件進(jìn)行優(yōu)選。采用3個(gè)考察水平，用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平表見表1。

3 含量測定

3.1 色譜條件：依據(jù)查閱文獻(xiàn)及考查的結(jié)果，確定色譜條件如下。色譜柱為安捷倫Cl8規(guī)格為（4.6mm×250mm，5μm）；流動相以乙腈-水（22：88）；檢測波長為277nm；流速1.0mL·min-1；柱溫：35℃。理論板數(shù)按連翹苷峰計(jì)算應(yīng)不得低于2000。

3.2 供試品溶液的制備

取提取膏適量，精密量取，加中性氧化鋁0.5g，拌勻，加置中性氧化鋁柱（100～120目，2g，內(nèi)徑1cm）上，用70%乙醇50ml洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得。

3.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取連翹苷對照品5mg，置100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將濃度為50μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml，250μg/ml，300μg/ml，350μg/ml的對照品溶液分別吸取20μL注入HPLC，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)表明，連翹苷對照品在50～350μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)

稱取同一批的膏子6份，按測定方法項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，測定含量，并計(jì)算樣品的RSD值，結(jié)果RSD為0.73%，結(jié)果表明此方法的重現(xiàn)性良好。

3.6 回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批供試品各6份，分別精密添加一定量的連翹苷對照品，測定含量，計(jì)算回收率。平均回收率為99.6%，RSD為0.82%。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照L9（34）正交設(shè)計(jì)表?xiàng)l件進(jìn)行試驗(yàn)，得到最佳提取工藝為加入8倍量水，煎煮提取90分鐘，連續(xù)提取2次。本工藝穩(wěn)定、可行、收率高。

參考文獻(xiàn)

[1]鐘宇飛，雷林生，余傳林，朱正光，李建軍，吳曙光.連翹水提取物對小鼠S180腫瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞體外增殖的影響[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2009（02）.

[2]沈紅，蘆山，陳舒楠，官佳懿，劉恩宏.連翹酯苷對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外增殖與分泌功能的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)，2012（04）.

[3]劉廣遐，王婷婷，胡文靜，錢曉萍，禹立霞，劉寶瑞.連翹醇提物對惡性胸腹水中原代腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用[J].實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2009（05）.

[4]楊建雄，楊晨，邱娟，柴渭莉，楊麗霞.連翹葉中苷類成分Ⅰ的體外抗氧化作用研究[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006（04）.

[5]傅穎珺，袁娟麗，陳江，謝勇.連翹對嚴(yán)重?zé)齻笫笸庵苎猅reg及脾臟Foxp3的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2009（10）.