高黃酮含量野葛淀粉提取工藝優(yōu)化

何美軍++王華++張宇,穆森+郭坤元++何銀生

摘要：采用單因子和正交試驗(yàn)方法對(duì)富含黃酮的野葛（Pueraria lobata）淀粉提取工藝進(jìn)行了研究，對(duì)水、甲醇、乙醇3種溶劑提取效果進(jìn)行了比較，以淀粉中的總黃酮含量為參考指標(biāo)，分別對(duì)4個(gè)提取參數(shù)（提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、固液比）進(jìn)行單因子試驗(yàn)，然后采用正交試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，野葛淀粉高黃酮含量提取的工藝條件為提取溫度35 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間3.0 h、固液比1∶8（kg∶L）。

關(guān)鍵詞：野葛（Pueraria lobata）；黃酮；淀粉

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）24-6537-04

EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）作為茶葉中的一種有效成分，具有抗病毒、抗氧化、抑菌消炎等功能[1]，在體內(nèi)外試驗(yàn)中被證實(shí)具有廣泛的抗癌活性，其抗癌機(jī)理包含誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期、阻滯細(xì)胞轉(zhuǎn)移、協(xié)同抗癌等[2]。近年來對(duì)其功效的研究日趨深入和完善，被廣泛用于食品、保健品和日化領(lǐng)域。本研究通過對(duì)高純度EGCG的提取、分離純化工藝的探討，為放大生產(chǎn)EGCG提供參考，對(duì)提高湖北省秋茶的利用率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶葉原料 茶葉原料來自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所茶葉資源圃種植的鄂茶1號(hào)、鄂茶5號(hào)、鄂茶8號(hào)、中茶108和福鼎大白。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 乙醇為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），冰醋酸、乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher Chemical）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料篩選 在前人研究基礎(chǔ)上[3]，選擇EGCG含量相對(duì)較高的茶葉資源作為試驗(yàn)原料。采摘一芽二葉（采摘日期為2015年8月6日），100 ℃純水蒸制3 min，100 ℃烘至足干，茶樣粉碎后過40目篩，分別稱取3 g，加入500 mL水，100 ℃浸提45 min，得到的濾液定容至500 mL，HPLC法檢測(cè)其EGCG含量。

1.2.2 EGCG的提取 單因素試驗(yàn)：按照茶多酚提取方法，浸提溫度選取40、50、60、70、80、90、100 ℃，浸提時(shí)間選取30、40、50、60、70、80、90 min，浸提料液比選取1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20（g/mL，下同），以此研究各因素的影響作用。

正交試驗(yàn)：通過單因素試驗(yàn)，分析各因素對(duì)EGCG浸出量的影響，確定較佳的單因素試驗(yàn)條件范圍，在此基礎(chǔ)上，以浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比為主要影響因素，各選出4個(gè)水平，安排L16（43）正交試驗(yàn)分析。

1.2.3 EGCG的分離純化 樹脂的預(yù)處理：樹脂在使用之前需要進(jìn)行有效的預(yù)處理，以除去制備和貯存中引入的雜質(zhì)。一般預(yù)處理的方法是：①乙醇浸泡。樹脂浸泡在95%左右濃度的乙醇中，乙醇的液面高于樹脂，不停攪拌以使樹脂和乙醇充分接觸，對(duì)樹脂進(jìn)行初步的浮選。浸泡時(shí)間一般為24 h。②乙醇沖洗。浸泡后的樹脂濕法上柱，再用95%的乙醇沖洗，直至流出液清亮無渾濁為止。③3%的氫氧化鈉溶液的浸泡和沖洗。先將經(jīng)乙醇浸泡沖洗過的樹脂浸泡于3%的氫氧化鈉溶液中4 h，再以2 BV 3%的氫氧化鈉溶液沖洗樹脂，最后用蒸餾水沖洗至中性。④5%的檸檬酸沖洗。先將經(jīng)3%的氫氧化鈉溶液浸泡沖洗過的樹脂浸泡于5%的檸檬酸溶液中4 h，再以2 BV 5%的檸檬酸沖洗樹脂，最后用蒸餾水沖洗至中性[4]。

樹脂的篩選：在劉偉等[5]、王偉濤等[6]研究基礎(chǔ)上，選擇AB-8、HPD-826和聚酰胺三種樹脂。根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)，樹脂在使用3～15次時(shí)柱效穩(wěn)定、分離效果較佳，故選取使用過2次的3種樹脂各8 g，分別置于500 mL的具塞磨口燒瓶中，加入2%濃度的原茶湯400 mL，在恒溫?fù)u床（30 ℃、140 r/min）上充分吸附2 h，考察樹脂對(duì)EGCG的吸附量。冰箱中靜置約12 h后過濾，濾液中加入200 mL 80%的乙醇，在恒溫?fù)u床上充分解吸2 h，得解吸液。將以上的原茶湯、吸附后茶湯殘留液和解吸液各用移液管吸取5 mL，定容至50 mL，進(jìn)行HPLC分析檢測(cè)，并按下式分別計(jì)算吸附量和解吸率：

式中，Q為吸附量（mg/g），M為去游離水的樹脂質(zhì)量（g），E為解吸率，V1為茶湯原始體積，V2為80%乙醇洗脫液體積，C1為原茶湯溶液濃度（mg/mL），C2為樹脂吸附后剩余茶湯殘留液濃度（mg/mL），C3為80%乙醇洗脫液濃度（mg/mL）。

洗脫劑濃度的選擇：選用篩選到的樹脂，茶湯（500 mL，濃度為20 mg/mL）上柱流速控制在1 BV/h，上柱后靜態(tài)吸附2 h，開展解吸試驗(yàn)。先研究水洗量對(duì)咖啡因和EGCG含量的影響，再分別制備乙醇濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的洗脫液，解吸流速控制在1 BV/h，研究EGCG和咖啡因在樹脂中的乙醇梯度洗脫的含量變化。

1.3 高效液相色譜分析檢測(cè)方法

色譜柱為PhenomenexGemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相A：0.2%乙酸水溶液（V/V），流動(dòng)相B：乙腈。流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取EGCG標(biāo)準(zhǔn)樣品，溶于一定量的25%乙腈水溶液中，分別配制成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)EGCG標(biāo)樣及相對(duì)保留時(shí)間作為定性方法，以峰面積計(jì)算其含量，工作曲線Y=11 004 641.426X-528 274.199。其中Y為峰面積；X為樣品濃度（mg/mL）。洗脫梯度見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料篩選

表3為不同茶葉資源中EGCG的含量。由表3可見，鄂茶1號(hào)中EGCG含量相對(duì)較高，可用作提取分離純化高純度EGCG單體的原料。

2.2 EGCG的提取

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 圖1表明，浸提液中EGCG的含量隨著浸提溫度的升高先升后降，分析其原因?yàn)榻嵋詳U(kuò)散原理為基礎(chǔ)，隨溫度升高，擴(kuò)散速度加快，浸提液中EGCG含量有所增加，但當(dāng)溫度到達(dá)一定值后，EGCG的氧化速度也加快，含量反而有所下降。

圖2表明，浸提液中EGCG的含量隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)先升后降，分析其原因?yàn)楣?液浸提過程為三步[7]：①溶劑進(jìn)入固體內(nèi)部，溶質(zhì)溶解；②溶質(zhì)從固體內(nèi)部到表面；③溶質(zhì)溶解液從固體表面到溶劑中。這個(gè)過程需要一定的時(shí)間，在這個(gè)時(shí)間范圍內(nèi)，隨浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，EGCG浸出量增加，但當(dāng)浸提時(shí)間到達(dá)一定值后，因溫度原因EGCG的氧化速度加快，含量反而有所下降。

圖3表明，在選取的料液比范圍內(nèi)隨著浸提用水量的增加，浸提液中EGCG含量一直呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)料液比達(dá)到1∶16后，再增加浸提用水量，對(duì)EGCG的浸出影響不大，分析其原因?yàn)椴璺壑兴腅GCG量是一定的，當(dāng)浸提用水量到達(dá)一定值后，茶粉中EGCG已全部浸提出，再增加用水量EGCG也沒有明顯增加，反而會(huì)因溫度等原因加快EGCG的氧化，同時(shí)給后續(xù)吸附、解吸和濃縮處理增加能耗，提高生產(chǎn)成本。

2.2.2 正交試驗(yàn)確定浸提茶多酚和EGCG的最佳條件 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，浸提溫度選取60、70、80、90 ℃，浸提時(shí)間選取40、50、60、70 min，浸提料液比選取1∶14、1∶16、1∶18、1∶20，正交分析結(jié)果見表4和表5。

由表4可知，最佳浸提工藝組合為A2B3C4，即浸提溫度70 ℃，浸提時(shí)間60 min，料液比1∶20，此條件下茶湯中EGCG含量為9.041%。由表5可知，浸提溫度和料液比對(duì)浸提液中EGCG含量的影響顯著，浸提時(shí)間對(duì)浸提液中EGCG含量的影響不顯著。

2.3 EGCG的分離純化

2.3.1 樹脂的篩選結(jié)果 由表6可見，聚酰胺樹脂優(yōu)于其他兩種，可用于較好地分離純化茶湯中的EGCG單體。分析其原因是聚酰胺樹脂具有的酰胺基與EGCG分子上的酚羥基進(jìn)行氫鍵締合能產(chǎn)生較好的吸附作用，用高濃度乙醇洗脫時(shí)解吸率也較高。

2.3.2 洗脫梯度選擇 浸提液上柱完成后先用純水洗脫，這是因?yàn)榭Х纫驅(qū)儆卩堰噬飰A，在溶劑中作為氫鍵受體，不易與聚酰胺樹脂形成較強(qiáng)吸附作用，而EGCG的酚羥基與聚酰胺樹脂的酰胺基具有很好的氫鍵結(jié)合力，所以用純水沖洗時(shí)，水洗量對(duì)EGCG的含量幾乎無影響，對(duì)咖啡因的解吸效果影響比較明顯。由圖4可見，解吸液中咖啡因含量隨水洗量的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，且在500 mL水洗量（1 BV料液）的時(shí)候咖啡因的含量達(dá)到最高。

由圖5可知，解吸液中EGCG含量隨著乙醇濃度的提高而升高，乙醇濃度為80%時(shí)達(dá)到最高，而后稍降低，分析其原因?yàn)橐掖挤肿又械牧u基與EGCG分子中的酚羥基有很強(qiáng)的氫鍵結(jié)合力，有效取代了聚酰胺樹脂與EGCG分子的結(jié)合，但是聚酰胺樹脂結(jié)合的EGCG分子數(shù)量是一定的，所以當(dāng)乙醇濃度到達(dá)一定值后，過剩的乙醇分子開始結(jié)合除EGCG以外的其他分子，導(dǎo)致解吸液中EGCG含量反而有所下降。

由圖6可見，咖啡因含量隨著乙醇濃度的提高而降低，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%以后，變化微小。分析其原因?yàn)榈图兌纫掖既芤褐袠O性和非極性分子同時(shí)大量存在，可充分洗脫出樹脂柱中的咖啡因，隨乙醇濃度增加，極性分子含量增多，非極性分子含量減少，咖啡因的解吸量反而下降。

綜合圖4、圖5和圖6的結(jié)果，從產(chǎn)品的品質(zhì)和成本考慮，選用梯度洗脫：先用1 BV的純水洗脫，再用1 BV 20%乙醇洗脫，最后用1 BV 80%乙醇洗脫，所得解吸液經(jīng)懸轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，但試驗(yàn)最終得到的EGCG單體純度僅為90.87%。為解決產(chǎn)品純度問題，考慮兩次上柱純化的方案，最終得到純度為95.21%的EGCG單體，但得率僅為0.276%。

3 小結(jié)與討論

3.1 結(jié)論

湖北省廣泛種植的5種茶葉資源中，鄂茶1號(hào)的EGCG含量相對(duì)較高，可用作提取、分離純化高純度EGCG單體的原料。

用純水浸提，浸提溫度70 ℃，料液比1∶20條件下浸提60 min，所得浸提液中EGCG含量最高。

聚酰胺樹脂由于其酰胺基能對(duì)含酚羥基的EGCG具有較好的吸附作用，且對(duì)CAF的選擇吸附作用較低，非常符合本試驗(yàn)制備無酯兒茶素產(chǎn)品的要求。聚酰胺樹脂純化兒茶素最佳工藝條件為：上樣流速1 BV/h、茶湯濃度為20 mg/mL，解吸流速為1 BV/h，分別用1 BV的水、1 BV 20%的乙醇溶液以及1 BV80%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫。

通過兩次柱層析分離純化，得到的EGCG單體純度可達(dá)95.21%。

3.2 討論

本研究通過提取、分離純化工藝的探討，得到了高純度EGCG單體，工藝綠色無污染，對(duì)提高湖北省秋茶的利用率具有重要意義，但是得率低，成本相對(duì)較高。預(yù)計(jì)從兩方面著手開展后續(xù)試驗(yàn)：一是擴(kuò)大高EGCG含量茶葉資源[8]的篩選范圍，從湖北省擴(kuò)大到全國(guó)；二是進(jìn)一步篩選合適的樹脂，力求一次柱層析可分離純化得到95%純度的EGCG單體，減少損耗，提高得率。

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