一種紅菜薹新病害的病原鑒定及生物學(xué)特性研究

聶啟軍+++邱正明++焦忠久++矯振彪++鄧曉輝+鳳娟+吳金平

摘要：2010-2011年在湖北省紅菜薹（Brassica campestris L. ssp. chinensis L.var. utilis Tsen et Lee）栽培中發(fā)現(xiàn)一種新病害，并從該紅菜薹新病害發(fā)病葉片分離得到了病原菌hctyk1，觀察該病原菌的孢子形態(tài)，分析了病原菌的ITS序列，研究了病原菌的生物學(xué)特性。結(jié)果表明，該病原菌為鏈格孢[Alternaria alternata（Fr.：Fr.） Keissler]，病原菌rDNA-ITS區(qū)序列已在GenBank上登錄（登錄號：JQ885954）。該菌菌絲生長致死溫度為50 ℃；適宜pH為8；在供試的幾種碳源、氮源中，最適的碳源是葡萄糖，最適的氮源是酵母浸出液。

關(guān)鍵詞：紅菜薹（Brassica campestris L. ssp. chinensis L.var. utilis Tsen et Lee）；新病害；ITS序列；病原菌

中圖分類號：S634.6：Q93-331 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6442-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.029

紅菜薹（Brassica campestris L. ssp. chinensis L.var. utilis Tsen et Lee）又名紫菜薹、蕓薹、紫菘等，是十字花科（Brassicaceae）蕓薹屬（Brassica L.）的一個變種，是中國特有的蔬菜。由于紅菜薹口感甚佳、肉質(zhì)脆甜爽口、營養(yǎng)豐富而得到廣大消費者的喜愛，種植面積連年擴大。2010-2011年，作者在湖北省長陽縣、利川市等地的紅菜薹高山栽培基地調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)了一種新的紅菜薹病害，該病染病初期多數(shù)葉片葉緣失綠，隨著病情發(fā)展葉緣焦枯，并由葉緣沿葉脈向基部擴展，出現(xiàn)葉脈、葉柄失綠和葉片枯黃狀況，一般發(fā)病率達10%～30%，嚴重削弱了紅菜薹的長勢，降低了產(chǎn)量和品質(zhì)，影響了農(nóng)民的收入。為確定該病病原并建立有效的防治方法，作者結(jié)合形態(tài)鑒定及基因組ITS區(qū)序列分析技術(shù)，對該病害的病原菌及其生物學(xué)特性進行了探討，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離、純化

2010-2011年從長陽縣、利川市等地的高山紅菜薹生產(chǎn)基地采集新病害病葉標本，在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所實驗室采用常規(guī)組織分離法[1]分離菌株，分離菌株接種到馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PSA）上，長出菌落后，挑取單一菌落的少量菌絲，移植到PSA平板，純化培養(yǎng)；純化后菌株編號為hctyk1。

1.2 致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則[2]進行寄主活體接種，在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所南湖試驗基地紅菜薹播種19 d后，用hctyk1孢子懸浮液105個/mL噴霧方法接種，以清水為空白對照，3次重復(fù)。等田間出現(xiàn)相同的癥狀后再次分離，并將2次獲得的分離菌作比較，以確定該菌的身份惟一性。

1.3 病原菌生物學(xué)特性測定

1.3.1 酸堿度試驗 在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所實驗室完成，設(shè)PSA培養(yǎng)基pH分別為4、5、6、7、8、9、10、11，共8個梯度，將直徑為5 mm的hctyk1菌絲塊移到PSA平板中央，平板置于28 ℃條件下培養(yǎng)3 d，然后十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復(fù)3次。

1.3.2 致死溫度試驗 設(shè)35、40、45、50、55 ℃ 5個處理溫度，每個處理重復(fù)6次，將hctyk1菌絲塊置于PSA平板中央，在恒溫水浴鍋中加熱15 min后迅速冷卻至室溫，再于25±1 ℃下培養(yǎng)3 d后檢查菌絲生長情況。

1.3.3 營養(yǎng)條件試驗 基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用査彼（Czapek）培養(yǎng)基，配方是硝酸鈉2 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、磷酸氫二鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、蔗糖30 g、瓊脂17 g，加去離子水1 L。碳源分別用葡萄糖、D-果糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源；氮源分別用甘氨酸、酵母浸出液、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、磷酸二氫銨、硝酸銨和L-谷氨酸鈉替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源。在28 ℃條件下接hctyk1培養(yǎng)3 d，然后十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復(fù)3次。

1.4 病原菌rDNA-ITS PCR擴增和序列分析

將hctyk1菌塊移至PSA平板上，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)48～72 h，然后將菌落邊緣的菌絲切成2～3 mm的小塊，把4～5塊菌絲塊移至馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基里，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)3～4 d。將液體培養(yǎng)好的病菌菌絲在雙層尼龍網(wǎng)上過濾，用去離子水洗滌2次，以除去菌絲內(nèi)的培養(yǎng)液；收集菌絲，將其包好放在硅膠中過夜，吸干水分；使用液氮研磨成粉末；用CTAB法提取DNA[3]。hctyk1病原菌rDNA的ITS區(qū)域PCR擴增引物分別為ITS-F和ITS-R，其堿基序列如下[4]：ITS-F（5′-GTCCTAAC AAGGTTTCCGTA-3′，AJ297952），ITS-R（5′-TTCTC CGCTTATTGATATGC-3′，AJ297953）。將PCR擴增產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化，陽性克隆送華大基因測序公司測序。將測得的基因序列在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進行BLAST比對，并上傳至GenBank。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2003軟件處理，并用其繪圖，運用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)和致病性

hctyk1病原菌分離、純化情況見圖1。從圖1-a可見，病原菌產(chǎn)生了大量褐色的菌絲；圖1-b顯示，分生孢子梗深色，合軸式延伸，分生孢子淡褐色至深褐色，磚隔狀。

田間接種后致病情況見圖2。觀察記載表明，在菌懸液噴霧接種的第七天，紅菜薹植株開始出現(xiàn)癥狀，與在長陽縣、利川市的田間癥狀相同，葉緣開始失綠，然后焦枯。并且從回接表現(xiàn)癥狀的病葉中再次分離到病原菌。

2.2 病原菌生物學(xué)特性

2.2.1 酸堿度 pH對hctyk1菌絲生長的影響情況見圖3。從圖3可見，hctyk1在基質(zhì)中pH 4～11范圍均可生長，其中又以在基質(zhì)中pH 6～9的生長最好，此時菌絲生長擴展快，致密濃厚，表明微堿性培養(yǎng)基質(zhì)較適合hctyk1的生長。

2.2.2 溫度 溫度對hctyk1菌絲生長的影響情況見圖4。從圖4可見，hctyk1的生長適宜溫度在35 ℃左右，致死溫度是50 ℃。

2.2.3 營養(yǎng)條件 營養(yǎng)條件對hctyk1生長的影響情況見圖5、圖6。從圖5、圖6可見，不同營養(yǎng)條件對hctyk1生長的影響差異較大。綜合分析hctyk1菌絲擴展及菌絲生長量情況，適合hctyk1生長的最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為酵母提取物。

2.4 病原菌的rDNA-ITS序列驗證

hctyk1病菌PCR擴增產(chǎn)物的電泳情況見圖7。從圖7可見，ITS-F和ITS-R從hctyk1基因組DNA中擴增出一條大小約為600 bp的片段，測序結(jié)果表明，hctyk1的rDNA-ITS區(qū)大小為534 bp；將該序列在GenBank上登錄，登錄號為JQ885954；然后將測得的序列在GenBank里進行BLAST分析。結(jié)果表明，所測序列與鏈格孢[Alternaria alternata（Fr.：Fr.）Keissler]的同源性為99%，證明引起該新病害的病原菌為鏈格孢。

3 小結(jié)與討論

試驗探討的紅菜薹新病害是在湖北省首次發(fā)現(xiàn)的一種真菌病害，該病在發(fā)病初期從葉片葉緣開始失綠，隨著病情發(fā)展葉緣逐漸焦枯，并由葉緣沿葉脈向基部擴展；后期葉脈、葉柄失綠枯黃。試驗結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)的方法，根據(jù)文獻[5]，鑒定該病的病原菌為鏈格孢；鏈格孢可以引起落葵葉斑病、煙草赤心病、梨黑斑病等，但未見其在紅菜薹上危害的報道。

生物學(xué)特性研究表明，該紅菜薹新病害病菌致死溫度是50 ℃，最適pH是8，最適碳源是葡萄糖，最適氮源是酵母浸出液；適宜生長溫度為25～30 ℃。因此，在不影響紅菜薹生長的情況下，通過適當(dāng)調(diào)節(jié)環(huán)境的溫度或者pH，對病情將能起到一定的控制作用，也為病害綜合防治提供了有益的理論依據(jù)。但該紅菜薹新病害病菌源自何方，傳播媒介是什么，目前尚未找到，這將是下一步深入探討的問題。

參考文獻：

[1] 方中達.植病研究方法[M].第三版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[2] 謝聯(lián)輝.普通植物病理學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2006.

[3] KNAPP J E，CHANDLEE J M. RNA/DNA mini prep from a single sample of orchid tissue[J]. Biotechniques，1996，21：54-56.

[4] JUNG D S，NA Y J，RYU K H. Phylogenic analysis of Alternaria brassicicola producing bioactive metabolites[J]. J Microbiol，2002，40：289-294.

[5] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

Pathogen Identification and Biological Characteristic of Marginal Scorch