還腦益聰方提取物含藥血清對(duì)APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞γ分泌酶活性及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

韋 云，劉美霞，梁曉東，劉劍剛，李 浩，魏 蕓

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院1.西苑醫(yī)院、2.老年病研究所，北京 100091;3.北京化工大學(xué)化工資源有效利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100029)

◇復(fù)方藥物藥理學(xué)◇

還腦益聰方提取物含藥血清對(duì)APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞γ分泌酶活性及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

韋 云1,2，劉美霞1,2，梁曉東1，劉劍剛1，李 浩1,2，魏 蕓3

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院1.西苑醫(yī)院、2.老年病研究所，北京 100091;3.北京化工大學(xué)化工資源有效利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100029)

目的 觀察中藥復(fù)方-還腦益聰方提取物(Huannao Yicong decoction，HYD)含藥血清對(duì)β-淀粉樣前蛋白swe基因(APPswe)人類早老素(PSEN1dE9，PS1)和早老蛋白1dE9基因(PSEN1dE9)人鼠淀粉樣前蛋白融合體(APPswe，APP)雙基因轉(zhuǎn)染人胚腎293(human embryonic kidney 293，HEK293)細(xì)胞γ分泌酶活性及相關(guān)蛋白的影響，分析含藥血清影響γ分泌酶活性相關(guān)蛋白的作用機(jī)制。方法 以人APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染(HEK293)人胚腎細(xì)胞株為載體，將其分為5組，分別為空白組，7.5%HYD含藥血清組，15%HYD含藥血清組，HYD直接給藥組，γ分泌酶抑制劑-DAPT組，復(fù)蘇傳代后采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8(cell counting kit-8，CCK-8)法檢測(cè)HYD含藥血清(大鼠灌胃10 d，取血清并進(jìn)行血藥成分檢測(cè))對(duì)人APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)活力和超微結(jié)構(gòu)的影響；透射電鏡觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；雙熒光素酶基因檢測(cè)γ分泌酶活性；蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)γ分泌酶組件及相關(guān)蛋白早老素1(Presenilin 1，PS1)、鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白(GTP binding protein，CDC42)、熱休克蛋白70羧基端作用蛋白(carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein，CHIP)、前咽缺陷蛋白-1α(anterior pharynx defective-1α，Aph-1α)和低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的表達(dá)。結(jié)果 15%HYD含藥血清組對(duì)細(xì)胞株的增殖作用高于其余各血清濃度組(P<0.05，P<0.01)；透射電鏡顯示模型組線粒體膜不完整，有輕微腫脹，線粒體嵴模糊，胞質(zhì)內(nèi)有較多的脂褐素沉積，其余各組數(shù)量均有一定程度的好轉(zhuǎn)和減輕。γ分泌酶活性結(jié)果，給藥后24 h和48 h，與模型組比較，直接給藥組、DAPT組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與DAPT組比較，15% HYD含藥血清組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。γ分泌酶結(jié)果與模型組比較，各給藥組的PS1蛋白、CDC42蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，CHIP蛋白表達(dá)和Aph-1α蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而HYD直接給藥組HIF-1α蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 HYD含藥血清具有改善人APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、抑制γ分泌酶活性的作用，其機(jī)制涉及促進(jìn)CDC42蛋白的表達(dá)，抑制PS1蛋白水解生成PS1 CTF/NTF 異二聚體，同時(shí)抑制HIF-1α蛋白的生成，進(jìn)而降低γ分泌酶的活性。

阿爾茨海默??；γ分泌酶；還腦益聰方提取物；含藥血清； 人APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；中藥復(fù)方

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的主要病理特征包括大腦皮質(zhì)彌漫性萎縮，顳葉和海馬部位的神經(jīng)元丟失，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)、老年斑(senile plaques，SPs)形成和細(xì)胞外淀粉樣斑塊沉積等[1-2]，是以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。有研究發(fā)現(xiàn)，淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)或早老蛋白-1(presenilin-1，PS1)/γ分泌酶發(fā)生突變時(shí)，都可以增加β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)的生成，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生[3]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)AD的治療藥物主要包括改善腦循環(huán)藥物、促腦代謝劑、乙酰膽堿酯酶抑制劑、M1膽堿受體激動(dòng)劑、促乙酰膽堿釋放劑等，雖然一定程度上能夠減輕AD的癥狀，但對(duì)損傷和丟失的神經(jīng)細(xì)胞作用有限，中藥復(fù)方治療AD具有多靶點(diǎn)、多途徑、多層次的藥效特點(diǎn)，更加楔合AD多因性的發(fā)病機(jī)制。課題組近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，以何首烏(Fleeceflower Root，Radix Polygoni Multiflori)、人參(Panax ginseng，Panax Ginseng C.A.Meyer)、川芎(Ligusticum chuanxiong，Rhizoma Chuanxiong P.E)、黃連(Golden Thread，Rhizoma Coptidis)、石菖蒲(rhizoma acori graminei，Acorus tatarinowii)組成的還腦益聰方(Huannao Yicong Fang, HNYCF)可以明顯提高AD模型小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，抑制機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和抗炎等作用[4-5]。同時(shí)，課題組與北京化工大學(xué)合作，優(yōu)化、固定了HNYCF的制備工藝[6]并制備了其提取物(Huannao Yicong Direction extract,HYD)，使其有效組分的含量可控。

“Aβ毒性級(jí)聯(lián)假說(shuō)”認(rèn)為，γ分泌酶是產(chǎn)生 Aβ的限速酶，直接關(guān)系到AD的發(fā)病與否，其相關(guān)調(diào)控通路在AD病機(jī)研究中已成為熱點(diǎn)。為探討HYD直接干預(yù)AD的藥理作用，本研究以γ分泌酶中PS1(presenilin 1,PS1)和前咽缺陷蛋白-1α(anterior pharynx defective-1α，Aph-1α)蛋白兩個(gè)組件為切入點(diǎn)，以人APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(HEK293)為載體，通過(guò)中藥血清藥理學(xué)的方法觀察HYD含藥血清對(duì)AD細(xì)胞模型超微結(jié)構(gòu)的影響，及γ分泌酶相關(guān)通路中PS1、鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白(GTP binding protein ，CDC42)、熱休克蛋白70羧基端作用蛋白(carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein ，CHIP)、Aph-1α和低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)蛋白表達(dá)的變化，探討HYD治療AD的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞株與藥物 健康大鼠(Sprague Dawley，SD)30只，♂，體質(zhì)量(230±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證編號(hào)：SCXX(京)2011-0004，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物室。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，室溫(22～25)℃，濕度(50～70)%，灌胃過(guò)程中動(dòng)物自由攝食和飲水。人APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(批號(hào)：08795844564308)購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。中藥飲片由河北省安國(guó)市神農(nóng)中藥飲片有限公司提供，北京化工大學(xué)負(fù)責(zé)制備其提取物。

1.2 細(xì)胞的體外培養(yǎng)與傳代 細(xì)胞接種于包被好的25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 2～3 d換液1次。細(xì)胞融合至80%左右，吸去培養(yǎng)液，用PBS沖洗1次，輕輕加入1 mL 0.25% 胰酶消化液，消化1～2 min，待細(xì)胞變圓開(kāi)始脫落時(shí)，立即加入2 mL含10%胎牛血清(Hyclone，批號(hào)：SV30087.02)的杜氏培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)高糖(Hyclone，批號(hào)：SH30022.01B)終止消化并反復(fù)吹打至細(xì)胞懸液，離心1000 r·min-1，4 min，小心棄去上清液，加入DMEM(高糖)完全培養(yǎng)液3～4 mL，反復(fù)吹打，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種于2～3只包被好的T25培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)3～4代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 含藥血清的制備 大鼠隨機(jī)分為2組，即HYD組，20只，HYD按人臨床等效劑量的5倍灌胃(18.9 g生藥/kg體質(zhì)量)；空白對(duì)照組，10只，等量蒸餾水灌胃。每天1次，連續(xù)10 d。末次灌胃前12 h禁食不禁水，末次給藥2 h[7-11]后水合氯醛(20%，0.9 mL·kg-1體質(zhì)量)麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置2 h，離心1 000 r·min-1，30 min，分離血清并同組混勻，過(guò)濾除菌，分裝，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。隨機(jī)取3管含藥血清送檢。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》和《北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》的要求。

1.4 分組與給藥 人APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株培養(yǎng)后分為5組。① 模型組：15%的空白血清孵育細(xì)胞株；②7.5%含藥血清組：7.5%含藥血清組孵育細(xì)胞株；③15%含藥血清組：15%含藥血清組孵育細(xì)胞株；④直接給藥組：0.316 g·L-1HYD孵育細(xì)胞株，加15%的空白血清；⑤γ分泌酶抑制劑——(2S)-N[-N(-3，5-二氟苯乙?；?-L-丙氨酰]-2-苯基甘氨酸叔丁酯{N-[N-(3，5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT}組：0.15 nmol·L-1DAPT(美國(guó)Selleck生物公司提供，批號(hào)：S2215)孵育細(xì)胞株，加15%的空白血清。

1.5 透射電鏡觀察 收集各組細(xì)胞，2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定后，0.01 mol·L-1的PBS洗5 min，1% 鋨酸固定1 h，0.01 mol·L-1的PBS洗5min，丙酮梯度(50%、70%、80%、90%、100%)逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂812(Epon812)浸滲，平板包埋，超薄切片(RM2235型，徠卡切片機(jī)，Leica slicer ，Germany)，3% 醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染。應(yīng)用透射電鏡100 kV (H7650型，透射電鏡，HITACHI，Japan)進(jìn)行觀察，拍片。

1.6 γ分泌酶活性檢測(cè) 細(xì)胞中加入250 μL的裂解緩沖液(passive lysis buffer)，重懸細(xì)胞，搖床上搖15 min，離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速離心15 s，取上清至EP管中，-80℃凍存?zhèn)溆?。檢測(cè)時(shí)，首先加入100 μL的熒光素酶檢測(cè)試劑Ⅱ(Luciferase Assay Buffer Ⅱ)，再加入20 μL的樣品，吹打混勻，儀器讀數(shù)(即熒光素酶luciferase值)；再加入100 μL停止緩沖液(stop & Glo Buffer)，震蕩混勻，儀器讀數(shù)(即海腎renilla值)。兩者的比值即為結(jié)果。

1.7 Western blot檢測(cè) 各組細(xì)胞用放射免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(Pierce，美國(guó))提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)6%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，雞PS1 IgG(1 ∶1 000，批號(hào)：AB5757，Millipore)，兔抗鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白CDC42 IgG(1 ∶500，批號(hào)：07-1466，Millipore)，兔多抗CHIP IgG(1 ∶500，批號(hào)：sc-66830，Santa)，兔抗APH1 IgG (1 ∶500，批號(hào)：AB9214，Millipore)，兔抗HIF-1αIgG(1 ∶200，批號(hào)：ab51608，Abcam)4℃孵育過(guò)夜，山羊抗兔(1 ∶5 000，批號(hào)：s004，凡星博奧)，兔抗雞IgG(1 ∶5 000，批號(hào)：E030180-01，EARTH)孵育1 h，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行吸光度(A)測(cè)定。以目的條帶與內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白(β-actin，1 ∶5 000，批號(hào)：TDY041，天德悅)的平均A比值表示PS1、CDC42、CHIP、APH1α、HIF-1α蛋白表達(dá)的水平。

2 結(jié)果

2.1 HYD有效組分測(cè)定 采用水提醇沉合并醇提的方式并與揮發(fā)油混合獲取HYD[12]，每克HYD相當(dāng)于生藥3.2 g。高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法建立指紋圖譜(Fig 1)，發(fā)現(xiàn)HYD提取物中含有大黃素(Emodin)、二苯乙烯苷(stilbeneglycoside，THSG)、人參皂苷(ginsenoside，G)Re、Rb1、Rg1、阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)和小檗堿(berberine hydrochloride，BHC1)7種主要成分[13]。同時(shí)，我們檢測(cè)了HYD含藥血清的有效組分，在送檢的3個(gè)含藥血清樣品中，HYD中的7種活性成分并沒(méi)有全部檢測(cè)出來(lái)。其中，Sample 1#中檢測(cè)到了THSG、BHC1及Emodin，Sample 2#中檢測(cè)到了G-Re，Sample 3#中只檢測(cè)到了BHC1及G-Rb1，含量在10～100 ng·L-1之間(Tab 1)。

2.2 不同濃度HYD含藥血清對(duì)細(xì)胞株活性的影響 據(jù)含藥血清添加量的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[14]，設(shè)空白對(duì)照組(0%)及5個(gè)濃度組(2.5%、5%、l0%、15%、20%)對(duì)比觀察。CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性。與空白血清組比較，僅15%含藥血清明顯增加細(xì)胞活性(P<0.01)。不同的含藥血清濃度對(duì)細(xì)胞活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.737，P<0.01)，見(jiàn)Fig 2。

Fig 1 HPLC fingerprint of HYD extract

1：FA；2：THSG；3：BHC1；4：G-Rg1；5：G-Rb1；6：G-Re；7：Emodin

Fig 2 Cytotoxicity of different levels of drug

**P<0.01vsmodel group

2.3 HYD含藥血清對(duì)γ分泌酶活性的影響 給藥24 h后，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.583，P=0.017<0.05)；與模型組比較，直接給藥組、DAPT組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與DAPT組比較，15%含藥血清組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥后48 h各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.028，P=0.000<0.01)；與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與DAPT組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。組內(nèi)比較，與給藥前比較，15%含藥血清組給藥48 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；直接給藥組和DAPT組給藥后24 h和48 h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)Fig 3。

Tab 1 Detection of HYD extract and Medicated serum

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05,##P<0.01vsDAPT group

2.4 HYD含藥血清對(duì)γ分泌酶相關(guān)組件表達(dá)的影響

2.4.1 HYD含藥血清對(duì)人APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株P(guān)S1蛋白表達(dá)電泳圖的影響 PS1蛋白表達(dá)組間比較，給藥后24 h組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.907，P=0.479>0.05)。給藥后48 h組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.669，P=0.003<0.05)；與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。組內(nèi)比較，與給藥前比較，僅DAPT組48 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)Fig 4。

2.4.2 HYD含藥血清對(duì)人APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株CHIP蛋白表達(dá)灰度值的影響 CHIP蛋白表達(dá)組間比較，給藥后24 h組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.183，P=0.944>0.05)。給藥后48 h組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.386，P=0.816>0.05)。組內(nèi)比較，與給藥前比較，僅DAPT組48 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)Fig 5。

1: Model group；2: 7.5% Serum group；3: 15% Serum group；4: HYD directly group；5: DAPT group.*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

2.4.3 HYD含藥血清對(duì)人APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株CDC42蛋白表達(dá)灰度值的影響 CDC42蛋白表達(dá)組間比較，給藥后24 h組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.360，P=0.834>0.05)。給藥后48 h組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.412，P=0.266>0.05)；與模型組比較，直接給藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組內(nèi)比較，僅DAPT組24 h較給藥前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)Fig 6。

1: Model group；2: 7.5% Serum group；3: 15% Serum group；4: HYD directly group；5: DAPT group.*P<0.05vsmodel group

2.4.4 HYD含藥血清對(duì)人APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株Aph-1α蛋白表達(dá)灰度值的影響 Aph-1α蛋白表達(dá)組間比較，給藥后24 h組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.175，P=0.949>0.05)。給藥后48 h組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.660，P=0.627>0.05)。組內(nèi)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)Fig 7。

2.4.5 HYD含藥血清對(duì)人APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株HIF-1α蛋白表達(dá)灰度值的影響 HIF-1α蛋白表達(dá)組間比較，給藥后24 h組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.202，P=0.934>0.05)。給藥后48 h組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.338，P=0.291>0.05)；與模型組比較，僅直接給藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組內(nèi)比較，僅DAPT組24 h較給藥前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)Fig 8。

1: Model group；2: 7.5% Serum group；3: 15% Serum group；4: HYD directly group；5: DAPT group.*P<0.05vsmodel group

2.5 APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株超微結(jié)構(gòu)的改變

2.5.1 線粒體 模型組線粒體膜不完整，有輕微腫脹，線粒體嵴模糊不清；其余各組線粒體膜基本完整，腫脹均有一定改善，線粒體嵴較前清晰。見(jiàn)Fig 9。

2.5.2 脂褐素 模型組胞質(zhì)內(nèi)有較多的脂褐素沉積；其余各組數(shù)量均有一定程度的減少。見(jiàn)Fig 10。

3 討論

自從1984年美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病、語(yǔ)言交流障礙和卒中研究所—老年性癡呆及相關(guān)疾病學(xué)會(huì) (NINCDS-ADRDA)提出AD的診斷和治療標(biāo)準(zhǔn)以來(lái)，直至2013年第5版精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第5版(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders , fifth edition，DSM-5)才問(wèn)世，可見(jiàn)AD相關(guān)研究進(jìn)展的緩慢，已成為醫(yī)務(wù)工作者急需要解決的難題。迄今為止，尚沒(méi)有一項(xiàng)臨床研究被證實(shí)是有效的療法，不是因?yàn)闆](méi)有達(dá)到預(yù)期的療效，就是選擇了不合適的臨床評(píng)估方法[15]。隨著系統(tǒng)生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)AD并不是由單一信號(hào)通路所介導(dǎo)的，調(diào)控疾病網(wǎng)絡(luò)某一節(jié)點(diǎn)的單靶點(diǎn)藥物不能滿足AD的治療需求，中藥復(fù)方的多靶點(diǎn)、多角度、多途徑的治療特點(diǎn)在此極具優(yōu)勢(shì)。HNYCF作為治療AD的有效處方，復(fù)方藥物不僅立法契合中醫(yī)藥“虛損-瘀毒”的病因病機(jī)，相應(yīng)的作用靶點(diǎn)也針對(duì)性的指向AD的主要病理因素，從神經(jīng)保護(hù)到突觸可塑性的調(diào)節(jié)、從神經(jīng)炎癥到調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分布都有涉及[4-5，13]，同時(shí)，制備工藝穩(wěn)定，有效組分明確及含量相對(duì)固定。本實(shí)驗(yàn)在明確含藥血清中的藥物組分的基礎(chǔ)上，采用含藥血清對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行干預(yù)，避免了HYD自身的理化性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的干擾，更利于從分子水平闡明HYD作用機(jī)制。研究中HYD與其含藥血清檢測(cè)出的有效組分不盡一致，可能與動(dòng)物腸胃黏膜的吸收消化，或者化合物在體內(nèi)以化合物鍵連接的方式形成了復(fù)合物，抑或與藥物代謝的周期相關(guān)。

1: Model group；2: 7.5% Serum group；3: 15% Serum group；4: HYD directly group；5: DAPT group.

1: Model group；2: 7.5% Serum group；3: 15% Serum group；4: HYD directly group；5: DAPT group.*P<0.05vsmodel group

雖然參與AD發(fā)病的病因是多元的，但是“Aβ毒性級(jí)聯(lián)假說(shuō)”[16]始終占據(jù)著重要的位置，此假說(shuō)認(rèn)為腦組織中β-淀粉樣蛋白(Aβ)聚集而成的老年斑是導(dǎo)致AD的首要原因[17]，因此抑制Aβ生成是AD最重要的治療措施之一[15]。γ分泌酶是一個(gè)至少由PS、單過(guò)性跨膜蛋白(nicastrin，NCT)、Aph-1、早老蛋白增強(qiáng)子-2(presenilin enhancer-2，Pen-2)等4個(gè)亞基按照1 ∶1 ∶1 ∶1的比例組合而成的復(fù)合物[18]，是催化Aβ生成的終末水解酶，在Aβ產(chǎn)生中起著關(guān)鍵的作用，γ分泌酶活性及相關(guān)調(diào)控通路可能成為AD中藥干預(yù)療效的良好評(píng)價(jià)體系。本研究發(fā)現(xiàn)空白組細(xì)胞的γ分泌酶活性在24 h有下降的趨勢(shì)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[19]，但是48 h時(shí)γ分泌酶活性又出現(xiàn)反彈，可能與細(xì)胞的持續(xù)增殖有關(guān)。藥物干預(yù)后，與給藥前比較，15%血清組48 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而直接給藥組24 h和48 h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示HYD可抑制γ分泌酶的活性。

Fig 9 Changes of mitochondrial structure observed in different groups

A: Model group；B: 7.5% Serum group；C: 15% Serum group；D: HYD directly group；E: DAPT group

Fig 10 Changes of lipofuscin among different groups

A: Model group；B: 7.5% Serum group；C: 15% Serum group；D: HYD directly group；E: DAPT group

本次研究?jī)H圍繞PS1和Aph-1兩條蛋白通路進(jìn)行分析。目前已證實(shí)PS1 水解生成的PS1 CTF/NTF 異二聚體是γ分泌酶的催化活性中心，其發(fā)生突變，會(huì)使γ分泌酶活性明顯下降或完全喪失[20-21]。CHIP和CDC42蛋白是由廈門大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院神經(jīng)退行性疾病及衰老研究中心用酵母雙雜交法篩選出來(lái)的與PS1有相互作用的重要細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，CHIP兼有輔助伴侶分子和E3泛素連接酶活性，能夠穩(wěn)定PS1蛋白，進(jìn)而增強(qiáng)γ分泌酶活性，致Aβ總量增多；CDC42可能與在PS1、APP的轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)控PS1的轉(zhuǎn)錄等過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組細(xì)胞分泌的PS1、CHIP蛋白含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增多，而CDC42蛋白有逐漸減少的趨勢(shì)，擬合AD隨年齡增長(zhǎng)腦內(nèi)神經(jīng)元進(jìn)行性減少，錯(cuò)誤折疊的蛋白進(jìn)行性增加，病情進(jìn)行性加重的病理特征。給藥48 h后，各給藥組的PS1蛋白含量較空白組均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，直接給藥組CDC42蛋白表達(dá)較空白組下降(P<0.05)，CHIP蛋白表達(dá)沒(méi)有差異。APH1是γ分泌酶復(fù)合體組裝過(guò)程中的“支架”，能夠穩(wěn)定有活性的PS蛋白，其中APH-1α在有活性的PS/γ分泌酶復(fù)合體形成中發(fā)揮重要的作用，其缺失可引起Aβ的生成減少。HIF-1的激活是APH-1α影響γ分泌酶活性的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑[22]，APH-1α啟動(dòng)子含有HIF-1的結(jié)合位點(diǎn)，HIF-1α亞基的活性和表達(dá)決定了HIF-1的生理活性。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組細(xì)胞株分泌的APH-1α和HIF-1α蛋白表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，提示細(xì)胞內(nèi)的血氧循環(huán)進(jìn)行性失調(diào)，雖然細(xì)胞內(nèi)有自身的保護(hù)機(jī)制但是不足以抵抗疾病的病理進(jìn)展，γ分泌酶活性升高，Aβ的產(chǎn)生相應(yīng)增加，兩者作用相互促進(jìn)。給藥48h后，直接給藥組的HIF-1α蛋白表達(dá)較空白組明顯降低(P<0.05)，提示HYD可以通過(guò)改善AD 細(xì)胞模型的血氧循環(huán)，影響PS1的穩(wěn)定性，進(jìn)而降低γ分泌酶的切割活性以及與酶底物間的有效結(jié)合。

同時(shí)，本研究也對(duì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)[23]，AD 患者的認(rèn)知能力與神經(jīng)纖維纏結(jié)、老年斑的形成并沒(méi)有直接的關(guān)系，而是與腦內(nèi)線粒體等細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的變化有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，APP存在于線粒體膜的表面，而Aβ主要分布在線粒體的基質(zhì)和嵴上，也可與線粒體外膜和線粒體內(nèi)膜相互作用[24]，這提示AD腦組織的病理改變與Aβ的異常分泌密切相關(guān)，Aβ可能通過(guò)未知的機(jī)制進(jìn)入線粒體并與相關(guān)的蛋白結(jié)合，引起線粒體功能的紊亂，損傷神經(jīng)元的軸突轉(zhuǎn)運(yùn)，從側(cè)面也驗(yàn)證了“Aβ毒性級(jí)聯(lián)假說(shuō)”的重要性。通過(guò)各組超微結(jié)構(gòu)的比較也可發(fā)現(xiàn)，模型組中線粒體嵴溶解斷裂，線粒體腫脹數(shù)量減少，胞質(zhì)內(nèi)脂褐素增加，用藥后細(xì)胞異常的超微結(jié)構(gòu)都有不同程度的恢復(fù)，線粒體嵴增加，脂褐素減少等等，說(shuō)明HYD對(duì)人APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)有明顯的改善作用，可能與減少Aβ的異常分泌，進(jìn)而增強(qiáng)腦的能量代謝，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，提高神經(jīng)細(xì)胞活力有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，HYD含藥血清具有改善人APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、抑制γ分泌酶活性，其機(jī)制可能與促進(jìn)γ分泌酶相關(guān)CDC42蛋白的表達(dá)，抑制PS1蛋白水解生成PS1 CTF/NTF 異二聚體，同時(shí)抑制HIF-1α蛋白的生成有關(guān)，進(jìn)而降低γ分泌酶的活性有關(guān)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心王毅博士、馬淑樺博士指導(dǎo)下完成，謹(jǐn)致謝意！)

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Effect of Huannao Yicong Decoction extract on activity of γ secretase and γ secretase-related regulation pathway of human APP/PS1 double transgenic cell line

WEI Yun1,2，LIU Mei-xia1,2，LIANG Xiao-dong1，LIU Jian-gang1，LI Hao1,2，WEI Yun3

(1.XiyuanHospitalofChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China;2.InstituteofGeriatricsofChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China;3.StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering,BeijingUniversityofChemicalTechnology,Beijing100029,China)

Aim To observe the effect of concise prescriptions of Chinese medicine Huannao Yicong Decoction(HYD) on regulatory pathway of secretase in APP/PS1 double transgenic cell line(HEK293),and to investgate its mechanism. Methods The proliferation of AD cell model and the toxicity of each investigational drugs were ebserved by CCK-8; the changes in microscopic structure of each group were observed by(Transmission electron microscope，TEM); the activities of gamma-secretes was observed by Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit ,and then the expression of presenilin 1(PS1),carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein(CHIP),GTP binding protein(CDC42), anterior pharynx defective-1α(APH-1α),Hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α) were detected by Western blot. Results 15% HYD serum increased the cell activity compared to blank serum(P<0.01).Under TEM,human APP/PS1 Double Transgenic cell line’s mitochondria showed swelling and degenerat, and lipofuscin was deposited;after 48 h of medication,the swelling of mitochondria was reduced and crista was clear, and the number of lipofuscin was reduced. For the activity of γ secretase, after 24 h medication, compared to control group, HYD directly group and DAPT group obviously inhibited the activity of γ secretase(P<0.05 orP<0.01), compared to DAPT group,only 15% serum containing HYD group had significant difference(P<0.05); after 48 h medication, compared to control group,the other group all showed significant difference(P<0.05 orP<0.01).For the influence of PS pathway, after 48 h medication, compared to control group,the other group all inhibited the PS1protein expression(P<0.05 orP<0.01), HYD directly group could activate the CDC42 protein expression(P<0.05); compared to 0 h midicaiton,DAPT group inhibited the CHIP protein expression at the point of 48 h(P<0.05) and activated the CDC42 protein expression at the point of 24 h. For the influence of Aph-1 pathway, there was no significant difference for Aph-1α(P>0.05); compared to control group,HYD directly group inhibited the HIF-1α protein expression after 48h medication(P<0.05); compared to 0h midicaiton, DAPT group inhibited the HIF-1α protein expression at the point of 24 h(P<0.05).Conclusions HYD can treat AD through protecting the mitochondrial function，reducing the formation of lipofuscin，inhibiting the activity of γ secretase by down-regulating the activity of HIF-1α，decreasing the stability and activity of PS1 by promoting the expression of CDC42. This shows that HYD has good research and development prospect as an effective drug for prevention and treatment of AD.

Alzheimer’s disease(AD)；γ secretase；extract of Huannao Yicong Decoction；serum containing drug；human APP/PS1 double transgenic cell line；Chinese medicine compound

時(shí)間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.048.html

2016-10-12,

2016-12-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81573819)；北京市科技計(jì)劃課題“十病十藥”研發(fā)項(xiàng)目資助課題(No Z141100002214003)；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No 7162169)

韋 云(1981-)，女，博士后，主治醫(yī)師，研究方向：老年病的中西醫(yī)結(jié)合臨床研究，E-mail：weiyun_0913@163.com; 李 浩(1965-)，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：老年病的中西醫(yī)結(jié)合臨床研究，通訊作者，E-mail：xyhplihao1965@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.024

A

1001-1978(2017)03-0417-10

R-332；R285.5；R322.81；R338.64；R341；R394.2；R745.7；R977.6