銀杏內(nèi)酯B抑制高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究

陳 坤，張 明，陳北冬，趙艷陽(yáng)，吳 偉，齊若梅

(北京醫(yī)院/北京老年醫(yī)學(xué)研究所，國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

銀杏內(nèi)酯B抑制高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究

陳 坤，張 明，陳北冬，趙艷陽(yáng)，吳 偉，齊若梅

(北京醫(yī)院/北京老年醫(yī)學(xué)研究所，國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

目的 探討銀杏內(nèi)酯B對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)的分子機(jī)制。方法 使用臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞作為細(xì)胞模型，分為對(duì)照組、高糖組、銀杏內(nèi)酯B處理組。用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，Annexin Ⅴ試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，熒光試劑盒檢測(cè)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平，Western blot 檢測(cè)Bax, Bcl-2, caspase-3的表達(dá)以及p53的磷酸化。結(jié)果 高糖(30 mmol·L-1)處理組內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)量明顯降低，遷移率為(66.6±15.6)%，而銀杏內(nèi)酯B(0.6 g·L-1)處理增加了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移數(shù)量，遷移率為(94.8±11.4)%。高糖處理導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平增高2.75倍，與高糖處理組比較，0.6 g·L-1銀杏內(nèi)酯B完全抑制了高糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。流式細(xì)胞儀分析表明，高糖刺激內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率為(53.8±2.6)%，銀杏內(nèi)酯B處理組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率為(44.0±3.1)%。對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的分析表明，高糖組Bax、caspase-3表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低，銀杏內(nèi)酯B處理抑制了Bax、caspase-3表達(dá)，并增加了Bcl-2表達(dá)。此外，高糖處理增加了內(nèi)皮細(xì)胞p53表達(dá)及磷酸化，而銀杏內(nèi)酯B抑制高糖刺激的p53活化。結(jié)論 銀杏內(nèi)酯B能抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，改善內(nèi)皮細(xì)胞遷移功能，對(duì)高糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

銀杏內(nèi)酯B；高糖；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；ROS；細(xì)胞凋亡；p53

糖尿病在我國(guó)發(fā)病率逐年增高，其心血管并發(fā)癥是造成患者致死致殘的主要原因。高糖(high glucose, HG)能夠損傷內(nèi)皮細(xì)胞, 導(dǎo)致多種炎癥蛋白表達(dá)增加及血管炎癥反應(yīng)[1-2]，但其機(jī)制尚不完全清楚。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞程序性死亡，是細(xì)胞為適應(yīng)微環(huán)境變化而激活的死亡過(guò)程。參與細(xì)胞凋亡這一過(guò)程的蛋白主要有Caspase家族、Bax、Bcl-2以及p53。其中Bax可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2則抑制細(xì)胞凋亡，它們都可以通過(guò)Caspase發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用[3]。研究表明，高糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與線粒體功能失調(diào)，DNA損傷以及ROS產(chǎn)生過(guò)多相關(guān)[4]。對(duì)糖尿病小鼠的研究表明，細(xì)胞內(nèi)能量與應(yīng)激感受器AMPK具有抑制ROS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用[5]。盡管研究已經(jīng)證實(shí)高糖能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但分子機(jī)制尚未完全闡明。

銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B，GB)是銀杏葉提取物，是血小板活化因子(PAF)受體的拮抗劑[6]。我們以及其他學(xué)者的研究表明，銀杏內(nèi)酯B能夠抑制血小板聚集和炎癥因子釋放[7]，能夠減輕氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[8-9]。還有研究顯示，銀杏內(nèi)酯B能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的比例來(lái)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10-11]。然而，銀杏內(nèi)酯B是否能夠抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡尚不清楚。本研究觀察了銀杏內(nèi)酯B對(duì)高糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞遷移變化、ROS產(chǎn)生以及細(xì)胞凋亡的影響，并分析相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 銀杏內(nèi)酯B購(gòu)自江蘇大觀園商貿(mào)公司，純度為95% (批號(hào)：BAT2007115)。Ⅰ型膠原酶、明膠購(gòu)自Sigma公司；胰蛋白酶、特級(jí)胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；Medium 199培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco(Invitrogen公司)；葡萄糖購(gòu)自Amresco公司；抗Bax、Bcl-2、caspase-3、phospho-p53、p53、β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、兔抗山羊二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司。Transwell小室購(gòu)自Corning公司；Annexin Ⅴ、FITC凋亡試劑盒購(gòu)自Dojindo公司；活性氧檢測(cè)試劑盒(S0033)購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取新鮮臍帶，用Ⅰ型膠原酶(1 g·L-1)灌注到臍靜脈20 min，收集灌注液離心。將內(nèi)皮細(xì)胞在含20%特級(jí)胎牛血清的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入100 kU·L-1青霉素和100 kU·L-1鏈霉素，在含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞傳至3代供實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 Western blot 方法檢測(cè)蛋白表達(dá) 將細(xì)胞分為對(duì)照組、高糖組(30 mmol·L-1)、銀杏內(nèi)酯B(0.2、0.4、0.6 g·L-1)處理組。實(shí)驗(yàn)前換用含0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基同步化處理內(nèi)皮細(xì)胞12 h，然后分別加入0.2、0.4、0.6 g·L-1銀杏內(nèi)酯B孵育1 h，加入30 mmol·L-1葡萄糖孵育細(xì)胞6 h。棄培養(yǎng)基，加入蛋白裂解液，收集蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取20 μg蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。用含5%的牛血清白蛋白封閉，室溫，1 h，洗膜。分別加入稀釋的特異性的抗體(1 ∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜。用含0.5% Tween 20的PBS洗膜3次，每次5 min，加二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h。洗膜3次，加入ECL發(fā)光液，用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀成像。

1.4 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞分為對(duì)照組、高糖組、銀杏內(nèi)酯B(0.6 g·L-1)處理組。用Fibronectin 包被Transwell小室濾膜， 37℃，1 h。分別在Transwell小室內(nèi)加入100 μL、小室外加入600 μL細(xì)胞培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中平衡1 h。去除小室內(nèi)培養(yǎng)基，接種100 μL細(xì)胞懸液(4×108·L-1)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)前換用含0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基同步化處理內(nèi)皮細(xì)胞12 h，用0.6 g·L-1銀杏內(nèi)酯B孵育細(xì)胞1 h，高糖刺激細(xì)胞12 h。用PBS洗小室3次。用4%多聚甲醛固定10 min，0.5%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗3次。取下濾膜，置于載玻片上。在顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞，用CCD成像，每組隨機(jī)選5個(gè)視野，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5 Annexin Ⅴ-FITC試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞分為對(duì)照組、高糖組、銀杏內(nèi)酯B(0.6 g·L-1)處理組。用0.1%胰酶消化內(nèi)皮細(xì)胞，加入20%胎牛血清，用PBS洗2遍，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107·L-1，將2 mL細(xì)胞懸液加入到6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h。用銀杏內(nèi)酯B(0.6 g·L-1)孵育1 h，用葡萄糖(30 mmol·L-1)處理細(xì)胞6 h，收集細(xì)胞。將待測(cè)細(xì)胞調(diào)整為1×109·L-1，加入5 μL FITC-Annexin Ⅴ和5 μL PI，輕輕混勻，室溫避光15 min。再加入400 μL Binding buffer懸浮細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀(BD, FACSCalibur)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。

1.6 活性氧(ROS)測(cè)定 將細(xì)胞分為對(duì)照組、高糖組、銀杏內(nèi)酯B(0.2、0.4、0.6 g·L-1)處理組。于6孔板中培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前同步化處理細(xì)胞12 h。然后分別加入0.2、0.4、0.6 g·L-1銀杏內(nèi)酯B孵育1 h，加入葡萄糖(30 mmol·L-1)刺激細(xì)胞6 h。使用熒光探針DCFH-DA(1 ∶1 000)孵育內(nèi)皮細(xì)胞，37℃，30 min，洗滌內(nèi)皮細(xì)胞3次。用CARY Eclipse 熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm下測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 銀杏內(nèi)酯B對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響 本研究評(píng)價(jià)了高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，以及銀杏內(nèi)酯B對(duì)其作用的影響。Transwell的結(jié)果顯示，高糖(30 mmol·L-1)處理組內(nèi)皮細(xì)胞的遷移數(shù)量明顯減少，遷移率為(66.6±15.6)%，銀杏內(nèi)酯B組的內(nèi)皮細(xì)胞遷移率為(94.8±11.4)%，二組比較差異有顯著性(P<0.05)(Fig 1)。表明銀杏內(nèi)酯B可以改善高糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞遷移功能損傷。

2.2 銀杏內(nèi)酯B對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響 為了探討高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，我們分析了高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生。結(jié)果顯示，30 mmol·L-1高糖刺激組ROS產(chǎn)生增加了2.75倍，與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)。銀杏內(nèi)酯B(0.2、0.4、0.6 g·L-1)以劑量依賴的方式抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生(Fig 2)。0.6 g·L-1銀杏內(nèi)酯B完全抑制了高糖增加的ROS產(chǎn)生，與高糖組比較二者差異有顯著性(P<0.05)。

2.3 銀杏內(nèi)酯B對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 我們使用免疫熒光觀察了高糖和銀杏內(nèi)酯B對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，高糖處理組細(xì)胞凋亡明顯增加，凋亡率為(211.6±25.9)%，而銀杏內(nèi)酯B(0.6 g·L-1)處理抑制了高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，凋亡率為(137.1±29.3)%，二組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)而使用流式細(xì)胞儀分析了細(xì)胞凋亡率，利用Annexin Ⅴ、PI標(biāo)記凋亡細(xì)胞。結(jié)果顯示，高糖 (30 mmol·L-1)刺激組細(xì)胞凋亡率為(53.8±2.6)%,而銀杏內(nèi)酯B(0.6 g·L-1)處理組細(xì)胞凋亡率為(44.0±3.1)%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(Fig 3)。

Fig 1 Effect of ginkgolide B on cell transmigrationin high glucose-treated HUVECs

A：Ginkgolide B recovered the transmigration in high glucose-treated HUVECs(×400)；B：Analysis of HUVECs transmigration(n=3).#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vshigh glucose-treated cells

Fig 2 Effect of ginkgolide B on ROSgeneration in high glucose-treated HUVECs

The level of ROS was measured by fluorescence spectrophotometer. Ginkgolide B inhibited high glucose-induced ROS production(n=3).#P<0.05vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vshigh glucose-treated cells

Fig 3 Effect of ginkgolide B on apoptosisin high glucose-treated HUVECs

A：Ginkgolide B inhibited apoptosis in high glucose-treated HUVECs(Green fluorescence labeled apoptotic cells); B：Apoptosis was measured by flow cytometry;C：Analysis of apoptosis by immunofluorescence;D：Analysis of apoptosis by flow cytometry(n=3).#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vshigh glucose-treated cells.

2.4 銀杏內(nèi)酯B對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3表達(dá)的影響 利用Western blot 方法分析Bax、Bcl-2、caspase-3表達(dá)。結(jié)果顯示，在使用高糖(30 mmol·L-1)刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，Bax增加了34.7%，而B(niǎo)cl-2表達(dá)降低了36.4%。銀杏內(nèi)酯B處理抑制了Bax表達(dá)，并增加Bcl-2表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯示二組之間有明顯差異(P<0.05)。對(duì)caspase-3的分析表明，高糖刺激內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3表達(dá)增加了兩倍， 而銀杏內(nèi)酯B (0.6 g·L-1)完全抑制了高糖誘導(dǎo)的caspase-3表達(dá)，與高糖組比較二者差異有顯著性(P<0.05)(Fig 4)。

Fig 4 Effect of ginkgolide B on Bax，Bcl-2 and caspase-3 expressions in high glucose-treated HUVECs

A:Bax，Bcl-2 and Caspase-3 expressions were detected by Western blot；B，C:Density analysis of protein expression(n=3).#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vshigh glucose-treated cells

2.5 銀杏內(nèi)酯B對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞p53的影響 研究表明p53參與調(diào)控細(xì)胞凋亡，為了評(píng)價(jià)銀杏內(nèi)酯B抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否與p53相關(guān)，我們分析了p53的表達(dá)和磷酸化。結(jié)果表明，高糖(30 mmol·L-1)處理的內(nèi)皮細(xì)胞p53蛋白表達(dá)量增加了23.2%，其磷酸化水平增加了兩倍，而銀杏內(nèi)酯B(0.6 g·L-1)完全抑制了高糖刺激的p53表達(dá)及磷酸化(Fig 5)，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 5 Effect of ginkgolide B on expression andphosphorylation of p53 in high glucose-treated HUVECs

A：Ginkgolide B suppressed the expression and phosphorylation of p53 induced by high glucose；B：Density analysis of p53 expression；C：Density analysis of p53 phosphorylation(n=3).#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vshigh glucose-treated cells

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是糖尿病血管合并癥的重要病理變化[12]。血糖升高可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷[13]。但到目前為止，高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制并不完全清楚。有文獻(xiàn)指出內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷與細(xì)胞氧化代謝產(chǎn)物聚積和線粒體功能紊亂相關(guān)[14]，也有研究認(rèn)為糖尿病導(dǎo)致的血管慢性炎癥狀態(tài)是血管穩(wěn)態(tài)失衡的重要原因[15]。

銀杏內(nèi)酯B是銀杏葉提取物，具有抗炎、抗血栓等多種生物保護(hù)作用[2]。我們先前的研究已經(jīng)證實(shí)[16]，銀杏內(nèi)酯B能夠抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥蛋白表達(dá)。但銀杏內(nèi)酯B能否改善高糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞遷移抑制和細(xì)胞凋亡還不清楚。本研究首先觀察了高糖損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能的現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)正常狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞具有較好的遷移能力，但是高糖處理?yè)p傷了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移功能，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)量減少，而銀杏內(nèi)酯B逆轉(zhuǎn)了這種現(xiàn)象，表明銀杏內(nèi)酯B具有改善內(nèi)皮細(xì)胞遷移功能的作用。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的代謝產(chǎn)物，在某些特定情況下可以反映細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。它在生理?xiàng)l件下可以參與細(xì)胞代謝，作為第二信使參與維持細(xì)胞功能。但在病理?xiàng)l件下，ROS的產(chǎn)生過(guò)多則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖刺激內(nèi)皮細(xì)胞之后，ROS水平明顯增高，0.2 g·L-1的銀杏內(nèi)酯B有效地抑制高糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，0.6 g·L-1銀杏內(nèi)酯B處理則完全抑制了高糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，表明高糖刺激引起了細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，而銀杏內(nèi)酯B具有較好的抗氧化作用。

細(xì)胞凋亡是能夠反映細(xì)胞損傷的一種重要表現(xiàn)形式。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖能夠明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而使用銀杏內(nèi)酯B能夠抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Bax、Bcl-2是Caspase上游分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。生理狀態(tài)下Bcl-2/ Bax保持相對(duì)平衡。病理?xiàng)l件下當(dāng)Bax上調(diào)、Bcl-2下調(diào)則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3]。本研究結(jié)果顯示，高糖刺激下內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率明顯增加，凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)增高、Bcl-2表達(dá)降低，而銀杏內(nèi)酯B逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象。

Caspase-3是參與細(xì)胞凋亡過(guò)程中的信號(hào)分子，它的活化可以被Bcl-2阻斷，從而產(chǎn)生抑制凋亡的作用[3]。本研究結(jié)果也證實(shí)高糖增加了caspase-3表達(dá)，而銀杏內(nèi)酯B抑制了其表達(dá)。大量研究顯示[18]，p53在凋亡中起到了重要的調(diào)控作用。研究表明，野生型p53是抑癌基因，其功能在于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制持續(xù)性的細(xì)胞增殖，它可以激活Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而起到調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用。我們的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)高糖處理增加了p53的表達(dá)和磷酸化，提示p53可能參與高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而銀杏內(nèi)酯B對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用可能與抑制p53活化相關(guān)。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯B能夠抑制高糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡，其分子機(jī)制與調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax、抑制caspase-3表達(dá)以及p53活化相關(guān)。銀杏內(nèi)酯B對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，這些結(jié)果對(duì)于糖尿病血管病變的防治具有重要意義。

(致謝：本文在北京老年醫(yī)學(xué)研究所免疫室完成，在此對(duì)參與此工作的研究人員加以致謝！)

[1] Uusitupa M，Schwab U.Diet,inflammation and prediabetes-impact of quality of diet[J].CanJDiabetes，2013，37:327-31.

[2] 孫文佳，孫 杰，陳北冬，等.銀杏內(nèi)酯B抑制高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞TLR4及炎癥蛋白表達(dá)[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2015，31(5)：636-40.

[2] Sun W J，Sun J，Chen B D，et al. Effect of ginkgolide B on TLR4 and inflammatory protein expression in high glucose treated human umbilical vein endothelial cells[J].ChinPharmalcolBull，2015，31(5):636-40.

[3] Chao D T，Korsmeyer S J. BCL-2 family: regulators of cell death[J].AnnuRevImmunol，1998，16:395-419.

[4] Yang L，Wu L，Du S，et al.1,25(OH)2D3 inhibits high glucose-induced apoptosis and ROS production in human peritoneal mesothelial cells via the MAPK/P38 pathway[J].MolMedRep，2016，14(1):839-44.

[5] Duan P，Hu C，Quan C，et al. 4-Nonylphenol induces apoptosis, autophagy and necrosis in Sertoli cells: Involvement of ROS-mediated AMPK/AKT-mTOR and JNK pathways[J].Toxicology，2016，341-3:28-40.

[6] Touvay C，Vilain B，Taylor J E,et al. Proof of the involvement of platelet activating factor(paf-acether) in pulmonary complex immune systems using a specific paf-acether receptor antagonist: BN 52021[J].ProgLipidRes，1986，25(1-4):277-88.

[7] Liu X，Yan Y，Bao L，et al. Ginkgolide B inhibits platelet release by blocking Syk and p38 MAPK phosphorylation in thrombin-stimulated platelets[J].ThrombRes，2014，134(5):1066-73.

[8] Shu Z M，Shu X D， Li H Q，et al. Ginkgolide B protects against ischemic stroke Via modulating microglia polarization in mice[J].CNSNeurosciTher，2016，22(9):729-39.

[9] Zhou T，You W T，Ma Z C，et al. Ginkgolide B protects human umbilical vein endothelial cells against xenobiotic injuries via PXR activation[J].ActaPharmacolSin，2016，37(2):177-86.

[10]Gu J H，Ge J B，Li M，et al. Inhibition of NF-kappaB activation is associated with anti-inflammatory and anti-apoptotic effects of Ginkgolide B in a mouse model of cerebral ischemia/reperfusion injury[J].EurJPharmSci，2012，47(4):652-60.

[11]Song Y，Zeng Z，Jin C，et al. Protective effect of ginkgolide B against acute spinal cord injury in rats and its correlation with the Jak/STAT signaling pathway[J].NeurochemRes，2013，38(3):610-9.

[12]Johnstone M T，Creager S J，Scales K M，et al. Impaired endothelium-dependent vasodilation in patients with insulin-dependent diabetes mellitus[J].Circulation，1993，88(6):2510-6.

[13]Lontchi-Yimagou E，Sobngwi E，Matsha T E，et al. Diabetes mellitus and inflammation[J].CurrDiabRep，2013，13(3):435-44.

[14]Roberts A C，Porter K E.Cellular and molecular mechanisms of endothelial dysfunction in diabetes[J].DiabVascDisRes，2013，10(6):472-82.

[15]Uusitupa M，Schwab U. Diet, inflammation and prediabetes-impact of quality of diet[J].CanJDiabetes，2013，37(5):327-31.

[16]馬麗娜，陳北冬，趙艷陽(yáng)，等.銀杏內(nèi)酯B對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究 [J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29(2)：189-93.

[16]Ma L N，Chen B D，Zhao Y Y，et al. Protective effect of ginkgolide B on ox-LDL stimulated endothelial cells[J].ChinPharmalcolBull，2013，29(2):189-93.

[17]Lassegue B，San Martin A， Griendling K K. Biochemistry, physiology, and pathophysiology of NADPH oxidases in the cardiovascular system[J].CircRes，2012，110(10):1364-90.

[18]Kruiswijk F，Labuschagne C F，Vousden K H. p53 in survival, death and metabolic health: a lifeguard with a licence to kill[J].NatRevMolCellBiol，2015，16(7):393-405.

Ginkgolide B inhibits apoptosis in high glucose-stimulated human umbilical vein endothelial cells

CHEN Kun,ZHANG Ming,CHEN Bei-dong,ZHAO Yan-yang,WU Wei,QI Ruo-mei

(TheMOHKeyLaboratoryofGeriatrics，BeijingHospital/BeijingInstituteofGeriatrics,NationalCenterofGerontology，Beijing100730,China)

Aim To investigate the effect of ginkgolide B on apoptosis in high glucose-treated endothelial cells.Methods Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) were used in the present study. The level of transmigration of HUVECs was analyzed by Transwell experiment. Apoptosis was detected by flow cytometry. Reactive Oxygen Species(ROS) was measured by immunofluorescence kit. The protein expression was analyzed by Western blot.Result High glucose treatment resulted in a reduction in transmigration of HUVECs and ginkgolide B recovered the phenomenon in glucose-treated endothelial cells. The level of ROS generation was increased in high glucose-treated group, whereas ginkgolide B inhibited ROS generation. Immunofluorescence data showed high glucose increased apoptosis, whereas ginkgolide B inhibited apoptosis in high glucose-treated HUVECs. Moreover, the expressions of Bax and caspase-3 were increased and Bcl-2 was reduced in high glucose-treated group. In contrast, ginkgolide B abolished the expressions of Bax and caspase-3 and increased Bcl-2 expression. Moreover, high glucose enhanced the expression and phosphorylation of p53, while ginkgolide B suppressed the expression and phosphorylation of p53 induced by high glucose.Conclusions Ginkgolide B can inhibit apoptosis and improve transmigration function in high glucose-treated HUVECs. Ginkgolide B has protection against high glucose-induced endothelial cell injury.

ginkgolide B；glucose；HUVECs；ROS；apoptosis；p53

時(shí)間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.034.html

2016-10-24,

2016-12-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81471051，81270379，81070231)

陳 坤(1991-)，男，碩士，研究方向：心血管疾病基礎(chǔ)，Tel:010-58115047,E-mail：chenkunbut@163.com； 齊若梅(1957-)，女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)脈粥樣硬化、血栓學(xué)的分子機(jī)制，通訊作者，Tel:010-58115047,E-mail：ruomeiqi@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.017

A

1001-1978(2017)03-0378-06

R284.1；R322.123；R329.25；R341；R587.1；R977.6