副干酪乳桿菌發(fā)酵提高羊骨酶解液體外抗氧化活性的研究

龐豐平，霍乃蕊

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

副干酪乳桿菌發(fā)酵提高羊骨酶解液體外抗氧化活性的研究

龐豐平1，霍乃蕊2*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

[目的]通過乳酸菌發(fā)酵提高羊骨粉酶解液的體外抗氧化活性。[方法]用副干酪乳桿菌對羊骨粉的堿性蛋白酶酶解液進(jìn)行發(fā)酵，對酶解液和發(fā)酵液的各項(xiàng)水解指標(biāo)和體外抗氧化活性進(jìn)行比較。[結(jié)果]酶解液經(jīng)過發(fā)酵，水解度由31.25 % 提高到50.79 %，提高了62.5%；Ca2+含量由1.25 g·L-1提高到2.75 g·L-1，提高了120.00 %；短肽含量由11.24 g·L-1提高到19.83 g·L-1，提高了 76.42 %；羥脯氨酸含量由2.13 g·L-1提高到3.25 g·L-1，提高了52.58 %。經(jīng)測定DPPH清除率由39.63 %提高到43.75 %；對羥自由基和超氧陰離子的清除率分別由44.12 %、52.09 %提高到82.49 %和71.82 %。[結(jié)論]對酶解液發(fā)酵可進(jìn)一步提高骨膠原蛋白的水解度，增加短肽含量，并且能促進(jìn)游離Ca2+的釋放,體外抗氧化活性也相應(yīng)增強(qiáng)，研究結(jié)果為畜骨的高值利用和新型保健品的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)支持。

羊骨酶解液； 副干酪乳桿菌副干酪亞種； 水解度； 游離Ca2+； 體外抗氧化活性

我國為畜牧大國，畜骨資源很豐富。畜骨中含有豐富的鈣質(zhì)，主要以羥磷灰石晶體[Ca10(PH4)6(OH)2]和無定型磷酸氫鈣[CaHPO4]兩種形式存在,很難被人體吸收利用[1]。畜骨中的蛋白質(zhì)是主要呈三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白，很難被機(jī)體消化吸收。酶解不僅可以提高骨膠原蛋白的生物利用度，還可促使游離Ca2+的釋放, 使其由骨礦形式轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄遭}，利于機(jī)體的吸收[2]。酶解生成的膠原肽與釋放的部分Ca2+結(jié)合可生成生物利用度更高的肽鈣螯合物[3]。酶解液中的游離氨基酸和多肽等可促進(jìn)發(fā)酵微生物的生長和代謝,使多肽進(jìn)一步降解為短肽，并釋放出更多的Ca2+。肽鏈越短，其生物學(xué)活性將越強(qiáng)[4]。副干酪乳桿菌副干酪亞種具有產(chǎn)蛋白酶的能力，是用于生產(chǎn)高鈣雞骨泥的菌種，其自身還是調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的益生菌。

堿性蛋白酶是水解骨膠原蛋白效果最好的酶種[5]?；裟巳锏萚6]以羊骨為底物用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶制備復(fù)合酶解物,通過碳粒廓清試驗(yàn)、噻唑藍(lán)法以及定量溶血法檢測不同劑量酶解物對小鼠非特異性免疫、細(xì)胞免疫以及體液免疫功能的影響，探究了其免疫活性。王凱等[7]研究了羊骨膠原酶解液具有抗氧化活性，動(dòng)物試驗(yàn)在單酶酶解的基礎(chǔ)上得出了酶解液具有體內(nèi)抗氧化活性的結(jié)論。本研究先制備羊骨粉的堿性蛋白酶酶解液，創(chuàng)新性的用副干酪乳桿菌副干酪亞種對酶解液進(jìn)行發(fā)酵，探究發(fā)酵進(jìn)一步提高水解度和短肽得率、促進(jìn)Ca2+釋放的可能性，并對發(fā)酵前后的抗氧化活性進(jìn)行比較，為畜禽資源的進(jìn)一步開發(fā)以及新型保健品的研制提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

副干酪乳桿菌副干酪亞種(Lactobacillusparacaseisubsp.paracasei)購于中國菌種保藏中心；羊骨粉以新鮮羊骨自制；菌株活化培養(yǎng)基為 MRS肉湯(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；馴化培養(yǎng)基為不同比例的MRS培養(yǎng)基與羊骨酶解液的混合物。

1.1.2 試劑

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)；堿性蛋白酶(Activity≥200 000 U·g-1；4-二甲氨基苯甲醛、異硫氰酸苯酯等其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器

高速萬能粉碎機(jī)(廣州雷邁機(jī)械)；722G可見分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司制造)；PHS-3C 型精密pH 計(jì)(上海雷磁分析儀器廠)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(香港力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán))；Lambda 850紫外可見分光光度計(jì)(美國PerkinElmer公司)等。

1.2 方法

1.2.1 酶解液的制備

羊骨粉濃度為9%(W/V)，90 ℃水浴殺菌15 min，冷卻至酶解所需溫度，將pH調(diào)至9，加入4.25%(E/S)的堿性蛋白酶，45 ℃水解325 min[4]，沸水浴10 min滅酶制得酶解液。

1.2.2 菌種馴化

菌種先在MRS肉湯中活化，然后逐漸增大MRS肉湯中羊骨酶解液的比例，使其由9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9增加至0∶10[8]，馴化時(shí)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液起始pH為7，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h后以1%的接種量移種。

1.2.3 乳酸菌發(fā)酵條件的確定

馴化后的菌種培養(yǎng)液(OD6000.965)以1%的接種量接入酶解液，調(diào)節(jié)pH，200 r·min-1震蕩發(fā)酵。單因素試驗(yàn)時(shí)，酶解液起始pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5；溫度為30、33、36、39、42和45 ℃；發(fā)酵時(shí)間為10、15、20、25、30和35 h。

1.2.4 水解指標(biāo)的測定

將酶解液和發(fā)酵液離心取上清，測定小肽含量[9]，水解度[10]和羥脯氨酸(Hyp)含量[11]。

1.2.5 游離Ca2+的測定

EDTA滴定法[12]。

1.2.6 體外抗氧化活性測定

取1.5 mL發(fā)酵上清液加入1.5 mL DPPH溶液(0.1 mol·L-1) 混合均勻，室溫避光反應(yīng) 30 min，517 nm下測定吸光值A(chǔ)1，空白組以等體積 95%乙醇代替DPPH溶液，記作A2; 對照組以等體積去離子水代替樣品記作A0，DPPH清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究所有試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取其平均值，利用軟件SPSS 19.0(SPSS Inc,Chicago,Illinois,USA)對結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵條件的選擇

副干酪乳桿菌在不同溫度、pH、時(shí)間發(fā)酵，發(fā)酵液的水解度測定結(jié)果如圖1所示。

圖1 發(fā)酵溫度、pH和時(shí)間對羊骨酶解液水解度的影響Fig.1 Effect of fermenting temperature,pH and time on the degree of hydrolysis of sheep bone hydrolysate

由圖1可以看出，不同條件下水解度均先升高后降低，由此確定的較適發(fā)酵溫度為36 ℃、酶解液起始pH為7，發(fā)酵時(shí)間為30 h。

2.2 發(fā)酵對水解指標(biāo)及游離鈣含量的影響

對發(fā)酵前后酶解液中的各水解指標(biāo)進(jìn)行測定并對結(jié)果進(jìn)行比較和方差分析，由圖2可以看出，副干酪乳桿菌發(fā)酵可使羊骨酶解液的水解度和游離Ca2+極顯著提高(P<0.01)，同時(shí)酶解液中的短肽含量和羥脯氨酸含量也顯著增加(P<0.05)。Hyp由2.13 g·L-1提高到3.25 g·L-1;游離Ca2+由1.25 g·L-1提高到2.75 g·L-1；水解度由31.25%提高到50.79%；小肽含量由11.24 g·L-1提高到19.83 g·L-1。發(fā)酵前后指標(biāo)相比可知，各指標(biāo)都有上升的趨勢且發(fā)酵處理對Hyp、小肽含量有著顯著影響(P<0.05)；對游離Ca2+、水解度有極顯著影響(P<0.01)。

圖2 酶解液發(fā)酵前后各水解指標(biāo)及Ca2+含量的變化Fig.2 Changes of hydrolysis-related indices and Ca2+ content before and after fermentation

2.3 發(fā)酵對體外抗氧化活性的影響

對發(fā)酵前后的酶解液進(jìn)行抗氧化活性的測定并進(jìn)行方差分析，結(jié)果見圖3。

圖3 抗氧化活性各指標(biāo)測定及方差分析結(jié)果Fig.3 The measuing results of each index antioxidant activity and analysis of variance

由圖3可以看出，與酶解樣品相比，盡管差異不顯著，但發(fā)酵樣品對DPPH清除率由39.63%提高到43.75%；對羥自由基和超氧陰離子的清除率極顯著提高(P<0.01)，分別由44.12%、52.09%提高到82.49%和71.82%。

3 討論與結(jié)論

對羊骨酶解液進(jìn)一步發(fā)酵，可使其水解度和游離鈣離子的釋放量進(jìn)一步增加，本研究以對羊骨粉水解效果最好的酶種堿性蛋白酶，在通過響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝條件下先對羊骨粉進(jìn)行水解，然后以具有蛋白酶分泌作用且經(jīng)過馴化培養(yǎng)的副干酪乳桿菌對酶解液進(jìn)行發(fā)酵，使水解度、游離Ca2+以及短肽含量分別提高了62.53%、120.00%和76.42%，其增幅很大，其測定值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶解處理或?qū)悄嘀苯影l(fā)酵處理。利用枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌對豬骨泥進(jìn)行雙菌液態(tài)發(fā)酵[15]，水解度僅為42.5%，游離鈣離子含量為1.16 g·L-1，由于沒有對骨泥先行酶解，故沒有達(dá)到本研究的50.79%(水解度)和2.75 g·L-1(游離Ca2+)。陳丹[16]等探討了超微粉碎牦牛骨泥經(jīng)發(fā)酵和酶解對游離鈣和氨基酸態(tài)氮含量的影響，也沒有對酶解和發(fā)酵進(jìn)行組合研究。目前對骨泥酶解液進(jìn)一步發(fā)酵處理來提高其水解度和促進(jìn)鈣離子釋放的研究還不多，本研究還探討了發(fā)酵對體外抗氧化活性的提高作用，并測定了骨蛋白的特征性氨基酸羥脯氨酸和短肽含量的變化。發(fā)現(xiàn)發(fā)酵處理后的羊骨小分子短肽比例大大提高，含有更多可以作為電子供體的底物，能夠與自由基結(jié)合轉(zhuǎn)化為狀態(tài)比較穩(wěn)定的物質(zhì)終止自由活性鏈反應(yīng)[17]，從而使羊骨泥的抗氧化活性得以提高。酶解和發(fā)酵組合處理后的骨泥，其營養(yǎng)價(jià)值和功能特性進(jìn)一步提高?？傊畬γ附庖哼M(jìn)一步發(fā)酵可提高骨膠原蛋白的水解度，并且促進(jìn)游離Ca2+的釋放，增加短肽含量，其體外抗氧化活性也相應(yīng)增強(qiáng)，為新型保健品的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)支持，同時(shí)為畜骨深度開發(fā)和功能性食品研制提供了依據(jù)。

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(編輯：馬榮博)

Study ofLactobacillusparacaseifermentation of sheep bone enzymatic hydrolysate to improve its antioxidant activityinvitro

Pang Fengping1, Huo Nairui2*

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China； 2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

[Objective] The study was aimed to improve theinvitroantioxidant ability of sheep bone hydrolysate by fermentation with lactic acid bacteria.[Methods] The hydrolysate of sheep bone was firstly prepared by alkaline protease, then the resulted hydrolysate was fermented byLactobacillusparacaseiparacasei.Before and after fermentation, the related indices of hydrolyzing andinvitroantioxidant ability were determined. [Results] Through fermentation, the degree of hydrolyzing increased by 62.53 % from 31.25 % to 50.79 %; the level of free Ca2+increased by 120.00 % from 1.25 g·L-1to 2.75 g·L-1；the content of small peptides increased by 76.42 % from 11.24 g·L-1to 19.83 mg·mL-1; the content of hydroxyproline increased by 52.58 % from 2.13 g·L-1to 3.25 g·L-1. The scavenging ability for the free radical of DPPH increased from 39.63 % to 43.75 %；for,superoxide anion and hydroxyl radical, increased from 44.12 %,52.09 % to 82.49 % and 71.82 % respectively. [Conclusion] Fermentation can furtherly increase the degree of hydrolyzing, the level of small peptide and free Ca2+of the sheep bone hydrolysate, the in vitro antioxidant ability was also enhanced correspondingly.The result provides the experimental supporting for the development of new type healthy product and the high value apllication of animal bone.

Sheep bone hydrolysate，Lactobacillusparacaseisubsp.paracasei， Degree of hydrolysis， Free calcium ions，Invitroantioxidant activity

2016-06-01

2016-07-27

龐豐平(1991-)，男(漢)，山西臨汾人，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)

*通信作者：霍乃蕊，博士，教授，Tel：0354-6289236；E-mail:tgnrhuo@163.com

國家自然科學(xué)基金(31201347)；山西省回國留學(xué)人員項(xiàng)目(2014-042)

TS251.94

A

1671-8151(2017)02-0126-04