三株球孢白僵菌對(duì)栗實(shí)象甲幼蟲的感染和致病力研究

陳春艷，謝映平，周西貝，王 旭，王 云

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原030006)

三株球孢白僵菌對(duì)栗實(shí)象甲幼蟲的感染和致病力研究

陳春艷，謝映平*，周西貝，王 旭，王 云

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原030006)

為了明確球孢白僵菌Beauveriabassiana3菌株TST05、FDB01、 SYN01對(duì)栗實(shí)象甲老熟幼蟲的感染、致死率、致死中時(shí)、以及胞外蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶的活性與毒力的關(guān)系，本研究采用3個(gè)菌株的孢子懸浮液(1.0×108孢子/mL)，浸蟲法感染栗實(shí)象甲幼蟲，統(tǒng)計(jì)連續(xù)8 d的校正死亡率；以栗實(shí)象甲幼蟲的蟲體作為菌株的唯一碳源制備液體培養(yǎng)基，測(cè)定培養(yǎng)過(guò)程中各菌株的脂肪酶、幾丁質(zhì)酶、類枯草桿菌蛋白酶(Pr1酶)連續(xù)8 d的酶活性變化。結(jié)果表明，球孢白僵菌3個(gè)菌株TST05、FDB01、SYN01感染栗實(shí)象甲幼蟲后，1-4 d內(nèi)表現(xiàn)出染病和死亡的癥狀，連續(xù)8 d累積校正死亡率分別為40%、44.4%、62.22%，菌株SYN01對(duì)栗實(shí)象甲的致死率最高，與其他兩菌株的差異顯著；菌株TST05、FDB01、SYN01的Pr1酶活性最大峰值分別為(175.56±0.7)U/mL、(172.74±2.32)U/mL、(195.71±5.41)U/mL。幾丁質(zhì)酶活性最大峰值分別為(12.58±0.58)U/mL、(13.06±1.16)U/mL、(15.12±0.32)U/mL。都是菌株SYN01的酶活性最大，而TST05和FDB01之間差異不顯著；球孢白僵菌3 個(gè)菌株的Pr1酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶在8 d內(nèi)的酶活性平均值與染菌幼蟲8 d累積校正死亡率的線性回歸方程分別為y=0.4641x+122.45(R2=0.8854)、y=0.034x+10.473(R2=0.9328)、y=0.0354x+2.4586(R2=0.1201)，說(shuō)明菌株的Pr1酶和幾丁質(zhì)酶活性與幼蟲死亡率之間呈顯著的線性相關(guān)，而菌株的脂肪酶活性與菌株對(duì)幼蟲的致死率不具有線性關(guān)系。綜合分析，菌株SYN01可以作為生物防治栗實(shí)象甲的病原菌種；Pr1酶與幾丁質(zhì)酶的活性可作為菌株的毒力因子。

板栗；栗實(shí)象甲；球孢白僵菌；毒力；胞外酶

板栗CastaneamollissimaBlume原產(chǎn)我國(guó)，栽培歷史悠久，2015年我國(guó)板栗總面積達(dá)到180萬(wàn)ha,年產(chǎn)量195萬(wàn)t,占世界板栗總產(chǎn)量的84%。板栗作為重要的生態(tài)經(jīng)濟(jì)林樹種，分布于全國(guó)26個(gè)省(區(qū)、市)，在山區(qū)脫貧致富和出口貿(mào)易中具有重要作用。但是板栗果實(shí)受栗實(shí)象甲CurculiodavidiFairmaire(屬鞘翅目Coleoptera，象甲科Curculionidae)的危害十分嚴(yán)重(魏敏宣和劉瑞江，2014)。栗實(shí)象甲在我國(guó)主要的板栗種植區(qū)均有發(fā)生，每年約有20%-45%的板栗果實(shí)受害，嚴(yán)重地區(qū)可達(dá)80%以上，造成經(jīng)濟(jì)損失巨大(袁少杰等，2010；李春野和孔凡濤，2012；黃莉?qū)帲?014)。

栗實(shí)象甲在我國(guó)大部分地區(qū)兩年一代。成蟲在板栗的嫩葉、新芽、幼果上取食，交配后產(chǎn)卵，卵產(chǎn)于板栗果實(shí)內(nèi)，待幼蟲孵化后，在板栗果實(shí)內(nèi)蛀食。蛀食后的板栗果實(shí)內(nèi)部蛀空，充滿蟲糞，無(wú)法食用，失去商品價(jià)值(遇文婧等，2015)。由于栗實(shí)象甲幼蟲鉆蛀在果實(shí)內(nèi)危害，防治十分困難。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)栗實(shí)象甲為害所采取的防治措施主要包括林業(yè)防治、人工防治、化學(xué)防治(屈頂柱等，2009；Speranzaetal.，2010)。其中林業(yè)防治和人工防治的措施具有費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、見效慢等缺點(diǎn)?；瘜W(xué)防治的樹冠噴藥對(duì)蛀入果實(shí)內(nèi)的幼蟲和入土的老熟幼蟲起不到防治效果，在山區(qū)不易操作并造成污染。最近幾年，國(guó)外試驗(yàn)利用線蟲、白僵菌、綠僵菌作為致病因子對(duì)栗實(shí)象甲進(jìn)行生物防治，有一定的效果(Kepenekcietal.，2004；Iharaetal.，2009)。我國(guó)目前有利用粉擬青霉菌防治栗實(shí)象甲取得一定的效果(孫紹芳等，2004)。

前期在山西省昔陽(yáng)縣的觀察發(fā)現(xiàn)，栗實(shí)象甲幼蟲脫果后，隱藏在林冠下土壤內(nèi)約20 cm深的土層中，滯育時(shí)間長(zhǎng)達(dá)8個(gè)月，才能化蛹，羽化為成蟲出土，這為利用昆蟲病原真菌作為生物制劑在土壤中進(jìn)行生物防治提供了可能。因此，本文選擇本實(shí)驗(yàn)室擁有的球孢白僵菌3個(gè)菌株SYN01、TST05、FDB01作為材料，研究了這3個(gè)菌株對(duì)栗實(shí)象甲的毒力，及與菌種的胞外酶(蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶)活性的關(guān)系，為生物防治提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 栗實(shí)象甲

本研究以山西省晉中市昔陽(yáng)縣洪川村的板栗林為試驗(yàn)園，觀察和采集栗實(shí)象甲。該地為山區(qū)環(huán)境，板栗面積133 ha，主要種植品種為大板紅，屬于多年生結(jié)果大樹。連續(xù)多年栗實(shí)象甲發(fā)生嚴(yán)重，果實(shí)受害率40%。根據(jù)生物學(xué)特性的觀察，在板栗收獲前期，于2015年9月下旬在試驗(yàn)園采回板栗蟲果300 kg，帶回實(shí)驗(yàn)室。

在實(shí)驗(yàn)室解剖蟲果，鏡檢觀察栗實(shí)象甲幼蟲在果實(shí)內(nèi)的蟲口密度和取食情況。統(tǒng)計(jì)板栗果實(shí)上的蟲孔數(shù)量、果內(nèi)幼蟲數(shù)量、幼蟲在果內(nèi)鉆蛀形成的孔和坑道、排泄的蟲糞、以及幼蟲的體長(zhǎng)等幾項(xiàng)指標(biāo)，分析幼蟲在果內(nèi)危害的時(shí)間長(zhǎng)短和發(fā)育進(jìn)度。并觀察栗實(shí)象甲幼蟲的自然脫果情況，收集脫果的老熟幼蟲，置于一定濕度的土中，作為染菌試驗(yàn)的幼蟲材料。

1.2 菌種

試驗(yàn)用的菌種材料是本實(shí)驗(yàn)室保存的3個(gè)球孢白僵菌菌株SYN01、TST05、FDB0，其中TST05菌株是本實(shí)驗(yàn)室2009年從山西省襄汾縣桃小食心蟲CarposinaniponensisWalsingham越冬幼蟲的自然染病蟲體上分離獲得，該菌株已保藏于北京中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)為CGMCC4526。FDB01菌株是本實(shí)驗(yàn)室2001年從東北吉林省伊通縣紅松林帕克阿扁松葉蜂Acantholydaparki幼蟲染病蟲體上分離獲得。SYN01菌株，購(gòu)買于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為CGMCC3.4428，原寄主為松毛蟲DendrolimuskikuchiiMatsumura。

孢子懸浮液的制備：用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，瓊脂粉20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL)制備平板，接種后置于人工氣候箱中(溫度25℃±1℃、相對(duì)濕度70%±10%、光照周期L ∶D=14 ∶10)培養(yǎng)8 d，然后將孢子刮于含有0.1% Tween-80的無(wú)菌水中，配置成濃度為1.0×108孢子/mL的孢子懸浮液。孢子濃度用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3 菌株對(duì)栗實(shí)象甲幼蟲的感染及致死率測(cè)定

從收集到的栗實(shí)象甲老熟幼蟲中挑選出形態(tài)大小相似的健康幼蟲，進(jìn)行染菌試驗(yàn)，每組30頭，設(shè)定 3重復(fù)。采用浸蟲法將幼蟲分別在菌株的孢子懸浮液(1.0×108孢子/mL)中浸濕 2 s，放于濾紙上，將多余的液體吸干。置于人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)(溫度25℃±1℃、相對(duì)濕度70%±10%、光照周期L ∶D=14 ∶10)，每天觀察幼蟲發(fā)病情況，并記錄拍照死亡情況，計(jì)算校正死亡率和致死中時(shí)。

1.4 菌株3種胞外酶活性的測(cè)定

1.4.1 專用培養(yǎng)基的制備

為了考察球孢白僵菌3菌株在感染栗實(shí)象幼蟲過(guò)程中，菌種分泌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶的活性，試驗(yàn)中制備了以栗實(shí)象甲幼蟲的蟲體作為培養(yǎng)球孢白僵菌唯一碳源的專用培養(yǎng)基。具體方法：將收集到的栗實(shí)象甲幼蟲反復(fù)沖洗后，在80℃的烘箱中烘干至恒重，將烘干的蟲體研磨成粉末，保存。準(zhǔn)確稱取0.1 g蟲體粉末，加入到30 mL基本培養(yǎng)液中(基本培養(yǎng)液組成：每1000 mL 蒸餾水水中含有1.5 g KH2PO4，0.6 g MgSO4，0.5 g KCL，1 mg FeSO4·7H2O，1 mg ZnSO4·7H2O)，于高壓滅菌鍋(LDZX-75KB)中121℃滅菌30 min，制備成以栗實(shí)象甲蟲體作為球孢白僵菌唯一碳源的專用培養(yǎng)基。

1.4.2 粗酶液的提取

3菌株分別進(jìn)行。 取3 mL 濃度為1.0×108孢子/mL孢子懸浮液接種到上述液體培養(yǎng)基中，每菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)。置于25℃，125 r/min低溫?fù)u床(MAXQ5000)中培養(yǎng)，每24 h取1 mL的培養(yǎng)液于1.5 mL的EP管，連取8 d， 4℃ 12000 g/min的冷凍離心機(jī)中離心20 min (Eppendorf-5804R)，取上清液即為粗酶液，準(zhǔn)確標(biāo)號(hào)，-80℃超低溫冰箱(DW-HL668)中保存。

1.4.3 類枯草桿菌蛋白酶(Pr1酶)活性的測(cè)定

參照St Leger等(1987)的方法并略作改動(dòng)：吸取30 μL粗酶液，30 μL底物(1.5×10-3mol/L 以Sul-Ala-Ala-pro-phe-PNA為反應(yīng)底物)，30 μL Tris-HCL(0.05 mol/L PH 8.0)分別加入到1.5 mL EP管中，標(biāo)號(hào)，充分混勻?？瞻讓?duì)照：將上述底物用30 μL二甲基亞砜代替。28℃水浴鍋反應(yīng)20 min，加入110 μL預(yù)冷的冰乙酸終止反應(yīng)。吸出200 μL加入酶標(biāo)板中，于多功能酶標(biāo)儀(型號(hào)M5)410 nm處測(cè)定OD值。以硝基苯胺含量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。每個(gè)酶活單位定義為每分鐘催化分解(Sul-Ala- Ala-pro-phe-PNA)生成1 μg硝基苯胺的酶量。

1.4.4 幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定

參照曹廣春(2007)的方法略做改動(dòng)。依次將制備好的0.1 mL膠體幾丁質(zhì)，0.1 mL酶液加入1.5 mL EP管中，標(biāo)號(hào)，充分混勻。37℃水浴鍋中加熱4 h。用離心機(jī)8000 r/min離心5 min，取出上清液，往里加入20 μL四硼酸鉀溶液，充分混勻，沸水浴加熱5 min，自來(lái)水冷卻至室溫，加入300 μL 10%二甲氨基苯甲醛試劑，37℃水浴鍋中保溫20 min，自來(lái)水冷卻至室溫。依次吸出200 μL 加入酶標(biāo)板中，于多功能酶標(biāo)儀585 nm處測(cè)定OD值。以N-乙酰氨基葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性。每個(gè)酶活性單位定義為每分鐘催化分解幾丁質(zhì)生成1 μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量。

1.4.5 脂肪酶活性測(cè)定

參照Silva等(2005)的方法。將制備好的200 μL的基質(zhì)液(由A液與B液組成，A液為10 mL 含有30 mg對(duì)硝基棕?cái)R酸的異丙醇；B液為90 mL 0.05 mol/L Tris-HCL緩沖液(PH=8.0)，含有100 mg阿拉伯膠和207 mg脫氧膽酸鈉)加入到1.5 mL EP管中，37℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，加入20 μL的酶液，充分混勻，37℃水浴鍋中加熱20 min，加入300 μL三氯乙酸(0.05 mol/L)，混勻，室溫反應(yīng)5 min終止反應(yīng)，加入320 μL NaOH(0.05 mol/L)；對(duì)照組先加入三氯乙酸再加入酶液。吸取200 μL反應(yīng)液加到酶標(biāo)板中，410 nm處測(cè)OD值。以對(duì)硝基苯酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。每個(gè)活性單位定義為每分鐘催化分解脂肪生成1 μg硝基苯酚酶量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用 IBM SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)結(jié)果采用單一變量方差分析(ANOVA)，Duncan法對(duì)不同數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 栗實(shí)象甲在板栗果實(shí)內(nèi)為害的3個(gè)階段

2015年9月20日將采集的有栗實(shí)象甲鉆蛀的板栗蟲果(圖1A)帶回實(shí)驗(yàn)室，在室內(nèi)經(jīng)過(guò)一個(gè)月的解剖和觀察。結(jié)果顯示，山西省晉中市昔陽(yáng)縣洪川村的板栗蟲果率達(dá)到40%，單個(gè)果實(shí)內(nèi)象甲幼蟲平均數(shù)量6.8頭，多為3-5頭，最多可達(dá)14頭。蟲口口徑一般以2.5 mm為主。栗實(shí)象甲在板栗內(nèi)的蟲體大小和為害可劃分為3個(gè)階段，即為害初期、中期、末期。為害初期(圖1B)的特點(diǎn)是，幼蟲還處于剛孵化后不久，蟲體小，透明，可隱約看到，伴隨一些白色粉末狀的蟲糞顆粒。為害中期(圖1C)，幼蟲發(fā)育較大，體長(zhǎng)8.5-12 mm，乳白色，無(wú)足，呈鐮刀形彎曲，頭部為黃褐色，口器黑褐色。一顆板栗果實(shí)內(nèi)有1到數(shù)頭幼蟲蛀食的隧道，隧道分布在果實(shí)的表面，直徑約3 mm，充滿白色蟲糞。為害末期(圖1D)，幼蟲發(fā)育到老熟階段，開始咬破板栗果殼，陸續(xù)脫果入土。此時(shí)果肉已經(jīng)被幼蟲取食，果實(shí)內(nèi)充滿顆粒狀蟲糞，果殼外表有幼蟲鉆出時(shí)留下的蟲孔(圖1E)。

圖1 受害板栗與栗實(shí)象甲幼蟲Fig.1 The infested Castanea mollissima and Curculio davidi larvae注：A, 板栗果實(shí)；f, 蟲果; B, 危害初期； 顯示l, 幼蟲; c, 糞道; C, 危害中期； c,坑道和蟲糞; D, 危害末期，板栗蟲果徹底失去價(jià)值; E, 老熟幼蟲鉆出果實(shí)后留下的蟲孔； wh,蟲孔; F, 收集到的老熟幼蟲。Note：A, C.mollissima fruit； f, the fruit infested by the Curculio davidi; B, the fruit in the early damage； l, larva; c, coprodaeum; C, fruit damaged in the medium term； showing c, coprodaeum; D, the damaged fruit without value; E, damaged fruit with holes caused by the C.davidi emerge； wh, wormhole; F, the mature larvae.

在9月20日剛采集回來(lái)的板栗蟲果中，栗實(shí)象甲的幼蟲和為害大部分還處于初期階段，少數(shù)處于中期和后期，經(jīng)過(guò)5 d時(shí)間，處于為害初期的幼蟲比例占60%-70%，處于中期的幼蟲占20%-30%，有個(gè)別的幼蟲老熟，開始脫果。25 d后，約80%-85%幼蟲發(fā)育為為第3階段，出現(xiàn)大量老熟幼蟲脫果，還有約10%-15%的幼蟲處于為害中期。大約一個(gè)月時(shí)間，絕大部分幼蟲完成脫果和入土，此時(shí)收集老熟幼蟲(圖1F)，進(jìn)行后續(xù)染菌試驗(yàn)。

2.2 染菌后栗實(shí)象甲幼蟲的外觀癥狀

用3個(gè)菌株TST05、SYN01、FDB01(孢子懸浮液濃度：1×108孢子/mL)對(duì)栗實(shí)象甲老熟幼蟲進(jìn)行染菌試驗(yàn)，連續(xù)觀察幼蟲的感染癥狀。結(jié)果顯示，從第2天開始，染菌幼蟲體表光澤度減弱，活動(dòng)力下降，蟲體表面相繼出現(xiàn)不同程度的褐色斑塊(如圖2B、2F、2J)；從第3天開始，蟲體顏色加深，個(gè)別幼蟲開始死亡(如圖2C、2G、2K)；從第4天開始，幼蟲相繼死亡，蟲體表面也相繼被覆白色的菌絲(如圖2D、2H、2L)。

圖2 栗實(shí)象甲幼蟲染菌后的癥狀Fig. 2 The symptoms of the diseased larvae of Curculio davidi infected with the three strains注：A-D, 幼蟲被TST05菌株感染后的第1-4天的外觀癥狀; E-H,幼蟲被SYN01菌株感染后的第1-4天的外觀癥狀;I-L, 幼蟲被FDB01菌株感染后的第1-4 天的外觀癥狀。Note: A-D, infected larvae with the strain of TST05 appeared symptoms in 1-4 d; E-H, infected larvae with the strain of SYN01 appeared symptoms in 1-4 d; I-L, infected larvae with the strain of FDB01 appeared symptoms in 1-4 d.

2.3 菌株對(duì)栗實(shí)象甲的致死效果

染菌后經(jīng)過(guò)連續(xù)8 d觀察并統(tǒng)計(jì)死亡率，結(jié)果顯示，3個(gè)菌株SYN01、FDB01、TST05的 1×108孢子/mL孢子懸浮液對(duì)栗實(shí)象甲幼蟲的感染均表現(xiàn)出較高致死率(圖3)。在1-3 d時(shí)，感染菌株TST05、FDB01和SYN01的幼蟲累計(jì)校正死亡率分別是5.55%、5.55%、10.00%； 第3-6天，3個(gè)菌株對(duì)幼蟲的的校正致死率分別為18%、31.11%、52.22%；第6-8天，3個(gè)菌株對(duì)幼蟲的累積校正死亡率分別為40%、44.4%、62.22%；由此可見，菌株SYN01對(duì)幼蟲的累計(jì)致死率在第3天就高于另外兩個(gè)菌株，第3天后其致死率急劇上升，在第6天就達(dá)到50%以上，一直到第8天，其致死率都顯著高于另外兩個(gè)菌株。菌株TST05與FDB01對(duì)幼蟲的致死率在前4 d都相近，4 d之后對(duì)幼蟲的致死率開始明顯增加，一直到第8天都處于快速增長(zhǎng)階段，其中，菌株FDB01對(duì)幼蟲的致死率在第5-8天期間都明顯高于TST05。通過(guò)計(jì)算3個(gè)菌株TST05、FDB01和SYN01對(duì)幼蟲的致死中時(shí)，分別為11.6 d 、8.77 d、6.22 d(表1)。說(shuō)明菌株SYN01對(duì)幼蟲的累積致死率最高，致死速度最快，菌株FDB01次之，TST05的致死率最低，致死速度也最慢，它們之間具有差異顯著性(P< 0.05)。

表1 3個(gè)菌株對(duì)栗實(shí)象甲幼蟲的校正死亡率回歸分析與致死中時(shí)

圖3 3個(gè)菌株對(duì)栗實(shí)象甲幼蟲校正死亡率Fig.3 The corrected lethallty rate of Curculio davidi larvae by the three strains

2.4 菌株胞外酶的活性及其與毒力的相關(guān)性

2.4.1 3菌株P(guān)r1酶的活性與毒力的相關(guān)性

3個(gè)菌株TST05、FDB01、 SYN01分別以栗實(shí)象甲幼蟲的蟲體作為唯一碳源的專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，逐日測(cè)定各菌株的類枯草桿菌蛋白酶的酶活變化。結(jié)果顯示(圖4)，菌株TST05、FDB01、 SYN01的蛋白酶活性在前6 d都呈現(xiàn)波動(dòng)性上升趨勢(shì)，到第6天出現(xiàn)最大峰值，分別為(175.56±0.7)U/mL、(172.74±2.32)U/mL、(195.71±5.41)U/mL。從酶活性的最大值與平均值看，菌株TST05與菌株FDB01的Pr1酶活性差異不顯著(P>0.05)，而菌株SYN01的Pr1酶活性最大值則明顯高于與其他兩株菌(P< 0.05)。用菌株的Pr1酶活性平均值與栗實(shí)象甲幼蟲染菌后連續(xù)8 d的累積死亡率之間作回歸分析，得到回歸方程式y(tǒng)=0.4641x+122.45 (R2=0.8854)，說(shuō)明菌株類枯草桿菌蛋白酶的活性與幼蟲染菌死亡率之間的線性相關(guān)性顯著。

圖4 3個(gè)菌株在栗實(shí)象甲蟲體培養(yǎng)基上的Pr1酶活性Fig.4 Pr1 activity of three strains cultured on the baked dry larvae media of Curculio davidi larvae

2.4.2 3菌株幾丁質(zhì)酶的活性與毒力的相關(guān)性

同樣，以栗實(shí)象甲幼蟲的蟲體作為唯一碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)3個(gè)菌株，測(cè)定各菌株幾丁質(zhì)酶的活性變化。 結(jié)果所示(圖5)，菌株TST05與菌株FDB01的幾丁質(zhì)酶活性在第1天就具有較高值，分別為(12.58±0.58)U/mL和(13.06±1.16)U/mL，菌株TST05在1-4 d呈下降趨勢(shì)，4-8 d呈波浪式變動(dòng)。菌株FDB01在第2-4天呈現(xiàn)低活性，4-7 d期間呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢(shì)。從酶活性最大值和平均值看，菌株FDB01與菌株TST05的差異不顯著(P> 0.05)；而菌株SYN01酶活性在第3天出現(xiàn)最大值(15.12±0.32)U/mL，并顯著高于另外兩個(gè)菌株(P< 0.05)。通過(guò)3個(gè)菌株幾丁質(zhì)酶活性平均值與栗實(shí)象甲幼蟲染菌后連續(xù)8 d 累計(jì)校正死亡率之間作線性回歸分析，得到回歸方程式為y=0.034x+10.473(R2=0.9328)，說(shuō)明菌株幾丁質(zhì)酶活性與幼蟲染菌死亡率之間的線性相關(guān)性極顯著。

圖5 3個(gè)菌株在栗實(shí)象甲蟲體培養(yǎng)基上幾丁質(zhì)酶活性Fig. 5 Chitinase activity of the three strains cultured on the baked dry larvae media of Curculio davidi larvae

2.4.3 3菌株脂肪酶的活性與毒力的相關(guān)性

同樣，以栗實(shí)象甲幼蟲的蟲體作為唯一碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)3個(gè)菌株，測(cè)定各菌株的脂肪酶活變化。結(jié)果顯示(圖6)，3個(gè)菌株的脂肪酶活性隨時(shí)間均表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì)。菌株TST05和FDB01的酶活性最大值出現(xiàn)在第2天，分別為(5.09±0.35)U/mL和(7.79±0.18)U/mL。第3-8天, 菌株TST05的脂肪酶活性呈現(xiàn)波動(dòng)性變化，并極顯著地小于另外兩個(gè)菌株(P< 0.05)。菌株FDB01的脂肪酶活性在第3-8天處于相對(duì)高的活性范圍，并呈現(xiàn)非常小的下降趨勢(shì)； 而菌株SYN01的脂肪酶活性在第1-4天期間呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在第4天達(dá)到酶活高峰值(6.8±0.91)U/mL后開始下降，第5-8天波動(dòng)比較平穩(wěn)，與菌株FDB01的酶活性比較接近，二者之間顯著差異(P>0.05)。從8 d脂肪酶平均值看，3個(gè)菌株之間差異性顯著(P< 0.05)。根據(jù)3個(gè)菌株脂肪酶活性平均值與染菌幼蟲連續(xù)8 d累積校正死亡率之間作線性回歸分析，得到回歸方程式為y=0.0354+2.4586，(R2=0.1201)，說(shuō)明菌株致死幼蟲過(guò)程與菌株脂肪酶的作用之間不具有直接線性相關(guān)性。

圖6 3個(gè)菌株在栗實(shí)象甲蟲體培養(yǎng)基上的脂肪酶活性Fig. 6 Lipase activity of the three trains cultured on the baked dry larvae media of Curculio davidi larvae

3 結(jié)論與討論

栗實(shí)象甲是我國(guó)板栗種植業(yè)的重要害蟲，以往防治主要采用樹冠噴灑化學(xué)殺蟲劑，防治交配和產(chǎn)卵期的成蟲，而對(duì)于在果實(shí)內(nèi)鉆蛀危害的幼蟲起不到防治效果，反而會(huì)污染環(huán)境。近年來(lái)，國(guó)外已經(jīng)有個(gè)別研究顯示白僵菌和綠僵菌對(duì)栗實(shí)象甲有一定的防治效果(Iharaetal.，2009)，但是國(guó)內(nèi)還沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)道。

應(yīng)用昆蟲病原真菌防治栗實(shí)象甲，是針對(duì)脫果后入土的老熟幼蟲在樹冠下土壤中棲息時(shí)間長(zhǎng)達(dá)8 月的習(xí)性，以白僵菌和綠僵菌作為生物制劑施用在土壤中，使幼蟲感染病菌得病死亡，以起到減少蟲口和防治目的。本研究通過(guò)觀察，掌握了在9月中旬到10月下旬期間，栗實(shí)象甲幼蟲在板栗內(nèi)的為害分為初期、中期、末期3個(gè)不同的階段，總結(jié)了每個(gè)階段幼蟲的大小和形態(tài)特征，以及果實(shí)上幼蟲蛀食的坑道和蟲糞特點(diǎn)。觀察到在此期間幼蟲取食和發(fā)育特別快，在10月下旬絕大部分幼蟲都能發(fā)育到老熟，鉆出果殼，脫果入土。并且發(fā)現(xiàn)脫果入土的老熟幼蟲，對(duì)土壤濕度要求比較高，一般在40%左右。這為科學(xué)利用白僵菌和綠僵菌作為生物制劑，在土壤中施用提供了科學(xué)依據(jù)。

為篩選出可用于防治栗實(shí)象甲的白僵菌菌株，本研究以本實(shí)驗(yàn)室擁有的3個(gè)球孢白僵菌菌株TST05、FDB01、SYN01對(duì)老熟幼蟲作感染試驗(yàn)，觀察了幼蟲的染病癥狀，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)菌株都可以使幼蟲染病死亡，幼蟲染菌后的癥狀包括：蟲體活動(dòng)減弱、體色變淡、體表出現(xiàn)色斑、體色變褐、出現(xiàn)死亡、體表出現(xiàn)菌絲和大量菌絲覆蓋蟲體。

病原真菌對(duì)害蟲的致死率是其篩選菌株的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，菌株SYN01對(duì)栗實(shí)象甲老熟幼蟲的致死率最高，感染后8 d 累積校正死亡率達(dá)到62.22%，致死中時(shí)6.22 d。 而菌株TST05與FDB01的8 d累積校正死亡率分別為40%與44.4%，二者無(wú)顯著差異(P> 0.05)，致死中時(shí)分別為11.6 d 和8.77 d。說(shuō)明SYN01對(duì)栗實(shí)象甲老熟幼蟲擁有更強(qiáng)的致死作用。

昆蟲病原真菌入侵昆蟲主要是通過(guò)體壁入侵，昆蟲體壁是昆蟲抵御外來(lái)微生物入侵的第一道屏障，昆蟲體壁主要成分是蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和脂肪(方衛(wèi)國(guó)，2003)。病原真菌要成功進(jìn)入血腔，就需要克服這些障礙，一般認(rèn)為這個(gè)過(guò)程是在真菌分泌胞外酶對(duì)體壁進(jìn)行降解，破壞體壁結(jié)構(gòu)，與真菌的芽管和菌絲產(chǎn)生的機(jī)械壓力形成的穿刺共同作用下完成的(St Legeretal.，1987)。許多研究表明在昆蟲病原菌入侵昆蟲表皮的過(guò)程中，產(chǎn)生的胞外酶的活性與病菌對(duì)昆蟲致病力密切相關(guān)(林海萍等，2008；Svedeseetal.，2013)。本研究以栗實(shí)象甲老熟幼蟲的表皮作為唯一碳源，模擬病原真菌入侵栗實(shí)象甲老熟幼蟲表皮過(guò)程，對(duì)病原真菌感染過(guò)程中分泌的蛋白質(zhì)酶，幾丁質(zhì)酶和脂肪酶進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示在模擬病原真菌入侵板栗象甲老熟幼蟲表皮過(guò)程中，菌株FDB01、TST05、SYN01的類枯草桿菌蛋白酶，幾丁質(zhì)酶和脂肪酶均表現(xiàn)出了先上升后下降的規(guī)律，表明在分解栗實(shí)象甲老熟幼蟲體壁過(guò)程中這3種酶均發(fā)揮著一定的作用。同時(shí)，這3株白僵菌所分泌的這3種酶在最大酶活性值以及最大酶活性出現(xiàn)的時(shí)間上表現(xiàn)出一定的差異，在一定程度上反映出了這3株白僵菌對(duì)栗實(shí)象甲老熟幼蟲作用的時(shí)間和毒力上的差異。

昆蟲病原真菌的胞外蛋白酶主要可以分為兩大類，一類是絲氨酸彈性凝乳蛋白酶Pr1(即類枯草桿菌蛋白酶)，另一類是絲氨酸類胰蛋白酶(Pr2)(St Legeretal.，1987)。其中Pr1是一種堿性蛋白水解酶，對(duì)昆蟲表皮表現(xiàn)出很強(qiáng)的特異性，而Pr2是多酶復(fù)合體的同工酶，對(duì)酪蛋白的活性很高，但是對(duì)昆蟲表皮蛋白質(zhì)的活性很低。因此，本研究選取類枯草桿菌蛋白酶作為指標(biāo)，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，在3個(gè)菌株TST05、FDB01、SYN01降解栗實(shí)象甲表皮過(guò)程中，Pr1的活性均有明顯的升高，其中菌株SYN01的酶活性平均值為(150.9032±10.29)U/mL，比其他兩個(gè)菌株的都高。經(jīng)過(guò)將Pr1酶與連續(xù)8 d的累計(jì)死亡率作線性回歸分析，R2=0.8854，線性相關(guān)性顯著，說(shuō)明病原菌在感染入侵昆蟲體壁過(guò)程中，菌種Pr1在降解昆蟲體壁的蛋白質(zhì)成分，對(duì)病菌入侵發(fā)揮了關(guān)鍵作用。Pr1的活性變化與幼蟲的染病死亡率之間的直線關(guān)系，說(shuō)明Pr1可以作為篩選病原真菌的一個(gè)毒力指標(biāo)，這與St Leger等(1987)和Mohanty等(2008)對(duì)其他昆蟲的研究結(jié)果是一致的。

病原真菌分泌的幾丁質(zhì)酶一般認(rèn)為包括兩大類，一類是幾丁質(zhì)酶，另一類是N-乙酰葡萄糖胺酶，其中幾丁質(zhì)酶是一種誘導(dǎo)酶，受到本身降解產(chǎn)物N-乙酰葡萄糖胺的誘導(dǎo)與抑制作用(St Legeretal.，1987)。昆蟲體壁中含有大量的幾丁質(zhì)，與蛋白質(zhì)形成嵌合結(jié)構(gòu)，是抵御外來(lái)微生物侵襲的重要屏障。Bernier等(1989)用昆蟲幾丁質(zhì)合成的抑制素和綠僵菌處理煙草天蛾Mandncasexta幼蟲，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)合成抑制素處理過(guò)的表皮更有利于綠僵菌的入侵，也說(shuō)明了幾丁質(zhì)酶對(duì)真菌入侵昆蟲起著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，在降解栗實(shí)象甲幼蟲體壁過(guò)程中菌株的幾丁質(zhì)酶活性都有升高，其中菌株SYN01的幾丁質(zhì)酶活性最大值為(15.12±0.32)U/mL，明顯高于菌株TST05的(12.58±0.58)U/mL 和菌株FDB01的(13.06±1.16)U/mL(P< 0.05)。幾丁質(zhì)酶活性的平均值與染菌幼蟲連續(xù)8 d累計(jì)校正死亡率作線性回歸分析，線性相關(guān)性顯著，R2=0.9328。說(shuō)明幾丁質(zhì)酶在白僵菌入侵栗實(shí)象甲老熟幼蟲過(guò)程中起著重要的作用，幾丁質(zhì)酶活性與菌株的毒力直接相關(guān)，可以作為篩選菌株的一個(gè)毒力指標(biāo)。

在本研究中脂肪酶酶活性有所提高，顯示脂肪酶參與了栗實(shí)象甲體壁的降解過(guò)程。其中菌株FDB01的酶活最大值為(7.79±0.18)U/mL，明顯高于TST05的(5.09±0.35)U/mL，但與菌株SYN01的(6.8±0.91)U/mL相比，無(wú)明顯差異。將脂肪酶平均值與8 d的累積校正死亡率做線性回歸分析，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.1201，說(shuō)明無(wú)明顯線性相關(guān)。馮明光等(1998)在研究白僵菌脂肪酶與菌株毒力相關(guān)性時(shí)，認(rèn)為脂肪酶不適宜作為菌株的一個(gè)毒力指標(biāo)，與本研究的結(jié)果一致。但是，本研究發(fā)現(xiàn)菌株的脂肪酶在1-4 d內(nèi)活性較高，而后期活性較低，說(shuō)明白僵菌的脂肪酶是在病菌感染的前期發(fā)揮作用，這與昆蟲表皮蠟質(zhì)處于昆蟲表皮的上層結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是一致的，當(dāng)病菌入侵昆蟲體壁時(shí)， 最先接觸的應(yīng)該是蠟質(zhì)層，然后才是蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)層。

綜上所述，本研究采用的球孢白僵菌3個(gè)菌株中，原寄主為松毛蟲的菌株SYN01對(duì)栗實(shí)象甲幼蟲的致死率和致死中時(shí)都明顯優(yōu)于其他兩個(gè)株菌，在降解象甲老熟幼蟲體壁過(guò)程的試驗(yàn)中，該菌株的蛋白酶和幾丁質(zhì)酶活性的最大值也均高于其他兩個(gè)株菌。而蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的酶活性與幼蟲累積校正死亡率之間呈顯著的線性相關(guān)關(guān)系。由此可以認(rèn)為，菌株SYN01是3個(gè)菌株中最佳的病原真菌菌株，可以考慮用于防治栗實(shí)象甲。

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Virulence of three strains ofBeauveriabassianainfectedCurculiodavidiFairmaire

CHEN Chun-Yan, XIE Ying-Ping*, ZHOU Xi-Bei, WANG Xu, WANG Yun

(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

This research is to explore the infection symptoms, lethallty rate, the median lethal time (LT50)of the larvae ofCurculiodavidiinfected with the three strains ofBeauveriabassiana(TST05, FDB01 and SYN01), and to explore the relationship between the activities of extracelluar enzymes and virulence of the three strains. The following methods were used. TheC.davidiwere infected by immersing the insects with conidial suspension (1.0 × 108conidia/mL)of the three strains. The corrected lethallty rates of the larvae were recorded every day. The baked dry larvae were used as the sole carbon source in the medium for fungal culturing, and the activities of threes extracellular enzymes, including lipase, protease (Pr1)and chintinase produced by the three strains were determined. The results showed the diseased symptoms and death of larvae started in 1-4 d after inoculation, and the cumulative mortality on 8 d of TST05, FDB01 and SYN01 were 40%， 44.4% and 62.22%, respectively. In which, the SYN01 strain caused the highest mortality rates of the larvae and showed significant difference compared to the strains TST05 and FDB01. The maximum peak values of Pr1 enzyme activities of the strains TST05, FDB01 and SYN01 were (175.56±0.7)U/mL, (172.74±2.32)U/mL and (195.71±5.41)U/mL, respectively. The maximum peak values of chitinase activity of the three strains were (12.58±0.58)U/mL, (13.06±1.16)U/mL and (15.12±0.32)U/mL, respectively. The Pr1 activities and chitinase activity of strain SYN01 were the highest in the three strains. And no difference existed between TST05 and FDB01. The relationships between the average values of Pr1 activity, chitinase activity and lipase activity of three strains in the period of 8 d and to the cumulative mortality of the infected larvae were analyzed, and the linear equations were y=0.4641+122.45 (R2=0.8854), y=0.034x+10.473 (R2=0.9328), y=0.0354x+2.4586 (R2=0.1201), respectively. It is indicated a significant linear relationship between Pr1 activity and chitinase activity of the strains and the larval mortality. Based on comprehensive analysis of the results, the strain SYN01 can be considered as a better pathogenic fungus for biological control ofCurculiodavidilarvae. Pr1 and chitinase activity can be used as virulence index for strain choice.

CastaneamollissimaBlume;CurculiodavidiFairmaire;Beauveriabassiana; virulence; extracellular enzymes

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140311017-6)

陳春艷，女，1991年生，山西臨汾人，在讀研究生，研究方向?yàn)槔ハx病原真菌與生物防治，E-mail：873871578@qq.com

*通訊作者Author for correspondence，E-mail：xieyingping@eyou.com

Received：2016-07-01；接受日期Accepted：2016-08-22

Q963； S893.3

A

1674-0858(2017)01-0198-09

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