利用冷凍切片對球孢白僵菌侵染西花薊馬過程的觀察

張志建，鄭長英，趙川德，萬方浩，2，王俊平*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院, 山東省植物病蟲害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266109;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)

利用冷凍切片對球孢白僵菌侵染西花薊馬過程的觀察

張志建1，鄭長英1，趙川德1，萬方浩1，2，王俊平1*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院, 山東省植物病蟲害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266109;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)

為探索球孢白僵菌對西花薊馬的侵染，研究球孢白僵菌在西花薊馬體表和蟲體內(nèi)的侵染過程，采用冷凍切片與HE染色技術(shù)，對被球孢白僵菌侵染的西花薊馬成蟲進(jìn)行組織切片及HE染色。結(jié)果表明，接菌4 h,體表粘附的孢子開始萌發(fā)，8-12 h芽管繼續(xù)伸長并出現(xiàn)穿透體壁。18 h蟲菌體出現(xiàn)在西花薊馬體內(nèi)，球孢白僵菌成功侵入西花薊馬體內(nèi)。之后，西花薊馬體內(nèi)蟲菌體、菌絲明顯增多，各組織器官均受到感染，消化道、肌肉組織等發(fā)生病變。

西花薊馬；球孢白僵菌；冷凍切片；侵染；組織病理變化

西花薊馬Frankliniellaoccidentalis(Pergande)2003年在我國北京首次發(fā)現(xiàn)(張友軍,2003)。西花薊馬食性雜，在500多種植物上都有發(fā)現(xiàn)，對多種作物的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了巨大的危害，目前已成為我國露地和溫室蔬菜生產(chǎn)的重要害蟲(戴霖,2004; 任潔,2006;呂要斌 2011)。

目前，對西花薊馬的防治主要依靠化學(xué)防治并發(fā)現(xiàn)已經(jīng)對很多殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性(Kirk, 2003;張帆, 2015)。因此，探索其生物防治，尋求和完善對其的綜合防治策略，是解決西花薊馬問題的有效途徑。

球孢白僵菌Beauveriabassiana(Balsamo)Vuillemin是害蟲微生物防治的重要資源，在我國主要用來防治松毛蟲、玉米螟、水稻葉蟬、溫室白粉虱以及月季長管蚜等多種害蟲。此外，球孢白僵菌主要通過寄主體壁接觸感染而致死各類害蟲，極其適合于銼吸式口器的西花薊馬的微生物防治(Feng,1994)。

目前，白僵菌對甜菜夜蛾LaphygmaexiguaHübner、桃小食心蟲Carposinasasakii、油松毛蟲Dendrolimustabulaeformis、桑天牛Aprionagermari、煙粉虱Bemisiatabaci等多種昆蟲的組織病理學(xué)已進(jìn)行研究(劉召,2006;宋入梅,2006; 王曉紅,2009; 張艷梅,2011)。球孢白僵菌對西花薊馬的研究則注重于高毒力菌株的篩選(李銀平,2013;袁盛勇,2013;Xiong,2013)，而球孢白僵菌對西花薊馬的侵染過程未進(jìn)行系統(tǒng)的研究，只有金龜子綠僵菌對西花薊馬侵染過程的研究(Vestergaard,1999)。本研究旨在利用冷凍切片技術(shù)，研究球孢白僵菌對西花薊馬體壁和體內(nèi)組織侵染過程，為利用球孢白僵菌防治西花薊馬提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和昆蟲

球孢白僵菌BbYT 11菌株，保存于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。西花薊馬雌成蟲，采用新鮮蕓豆進(jìn)行飼養(yǎng)，培養(yǎng)條件為自然光照，溫度為25℃±1℃。

1.2 孢子懸浮液的配制

球孢白僵菌在SDAY培養(yǎng)基上于25℃，10 L ∶14 D的光照條件下培養(yǎng)7 d，無菌棒刮取分生孢子粉于1.5 mL Eppendorf 管中，加入適量含0.1%吐溫-80無菌水和3個(gè)直徑為8 mm的玻璃球，然后強(qiáng)力振蕩將分生孢子充分混勻，配成1.0×108個(gè)/mL孢子懸液，4℃保存，備用。

1.3 球孢白僵菌接種西花薊馬

采用噴霧法接菌。用自制取蟲器從養(yǎng)蟲瓶中取西花薊馬成蟲，置于底部鋪有濾紙的養(yǎng)蟲盒中，將1.0 mL 1.0×108個(gè)/mL球孢白僵菌BbYT 11孢懸液用Aldrich chromatography sprayer向西花薊馬噴霧，保鮮膜覆蓋封口，放于25℃±1℃、RH 90%、L ∶D=16 ∶8條件下飼養(yǎng)，每隔3 d更換新鮮蕓豆。

1.4 冷凍切片的制備

(1)防脫玻片制備：將載玻片經(jīng)洗滌劑浸泡24-48 h,流水沖洗烤干；后浸于重鉻酸鉀洗液中過夜，蒸餾水沖洗，烤干后浸泡95%的酒精中過夜，蒸餾水洗3次，烤干。然后將載玻片浸泡明膠硫酸鉻鉀溶液中3次，每次2 min，取出載玻片控盡液體后置入60℃-70℃烤箱中烘干1 h備用。

(2)西花薊馬接菌后分別于1 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h、56 h、72 h進(jìn)行取樣，將樣品經(jīng)10%中性甲醛4℃固定24 h,后經(jīng)蔗糖梯度溶液4℃脫水過夜。常規(guī)包埋，采用自動冷凍切片機(jī)(Thermo Microm HM 525)連續(xù)切片，厚度10 μm，采用HE方法進(jìn)行染色參照張艷梅(2011)方法并進(jìn)行改進(jìn)，后進(jìn)行顯微觀察，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢白僵菌在西花薊馬成蟲體表的入侵

接菌后球孢白僵菌分生孢子首先粘附在西花薊馬的體表，4 h后附著于體壁的分生孢子開始萌發(fā)，部分分生孢子長出短的芽管(圖1A)。接菌8 h，萌發(fā)的分生孢子增多，已經(jīng)萌發(fā)的分生孢子芽管伸長，部分開始定向體壁生長，開始穿透體壁(圖1B)。接菌12 h，穿透體壁的分生孢子增多，芽管繼續(xù)在體壁中伸長(圖1C)。接菌18 h，大量的分生孢子穿透西花薊馬的體壁。同時(shí)，西花薊馬體內(nèi)出現(xiàn)短棒狀的蟲菌體(圖1D)，表明球孢白僵菌已成功侵入西花薊馬體內(nèi)。

2.2 球孢白僵菌對西花薊馬成蟲體內(nèi)侵染

球孢白僵菌的蟲菌體在接菌18 h開始出現(xiàn)在西花薊馬體內(nèi)，24 h后西花薊馬體腔內(nèi)的蟲菌體增多(圖2A)。接菌36 h后，西花薊馬成蟲出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡蟲體的體腔內(nèi)有大量的蟲菌體(圖2B)；同時(shí)，活蟲體內(nèi)的各個(gè)組織之間出現(xiàn)蟲菌體(圖2C)。接菌48 h后，蟲體內(nèi)蟲菌體不斷增加，各組織器官均受到感染出現(xiàn)蟲菌體。同時(shí)，死亡蟲體內(nèi)出現(xiàn)菌絲(圖2D)。接菌56 h后，消化道、肌肉組織等組織發(fā)生病變(圖2E-F)，邊緣模糊不清，存在大量蟲菌體，并活蟲體內(nèi)出現(xiàn)少量菌絲(圖2G)，而死亡西花薊馬的體內(nèi)出現(xiàn)大量的菌絲(圖2H)。接菌64 h，西花薊馬活蟲體內(nèi)充滿蟲菌體，菌絲增多(圖3B)；死蟲體內(nèi)組織解離(圖3A)。接菌72 h，菌絲成功突破表皮向外生長，在西花薊馬體壁外產(chǎn)生分生孢子(圖3C-D)。

圖1 球孢白僵菌YT 11菌株在西花薊馬體表的侵染Fig. 1 Frozen sections of Frankliniella occidentalis infected with Beauveria bassiana YT 11 strain on the integument注：A，球孢白僵菌A菌株接菌4 h后, 分生孢子萌發(fā)；B，接菌8 h, 向體壁生長的芽管；C，接菌12 h, 孢子芽管穿透體壁, 在體壁中伸長；D，接菌18 h，西花薊馬體內(nèi)開始出現(xiàn)蟲菌體。Note: A, within 4 h after inoculation, the conidia germinated and produced germ tubes; B, after 8 h post treatment, germ tubes grew to cuticle; C, at 12 h post-inoculation, the germinated conidia were penetrating the integument; D, after 18 h treated, the hyphal bodies were observed in the insects.

3 結(jié)論與討論

冰凍切片是利用低溫把組織迅速冷凍到達(dá)一定的硬度, 利用恒溫切片機(jī)進(jìn)行切片的一種方法,常用于組織化學(xué)、免疫定位及原位雜交等研究(李建霞,2013)。本試驗(yàn)過程中采用石蠟切片的方法，切片制作及染色過程繁瑣，耗時(shí)長；因而采用冷凍切片方法，發(fā)現(xiàn)較石蠟切片方法過程簡潔快速，縮短試驗(yàn)時(shí)間，提高效率。在組織切片染色過程中，樣品脫片問題是影響試驗(yàn)的重要技術(shù)環(huán)節(jié)(楊秀靜,2014)。為解決樣品脫片問題，本試驗(yàn)在以下方面進(jìn)行改進(jìn)：(1)載玻片均采用明膠硫酸鉻鉀處理，制作防脫玻片：參照于德欽(2009)方法并改進(jìn)，由于組織大小不同，調(diào)整浸泡明膠硫酸鉻鉀溶液的時(shí)間為2 min/次,防脫效果較好。(2)在制成冷凍切片后，應(yīng)先將切片室溫晾置約2 h，避免立即進(jìn)行染色，否則在染色過程中會造成樣品大量脫片，但最好在7 h之內(nèi)染色，否則會造成樣品在染色過程中上色困難。(3)HE染色過程中，將切片置于酒精燈上烤3-5 s，后95%乙醇固定5 min。采用上述方法后對防止冷凍切片脫片問題非常有效，從而能更好的用于組織病理學(xué)變化的觀察。

圖2 西花薊馬感染球孢白僵菌YT 11菌株后體內(nèi)組織變化Fig.2 The pathological changes of Frankliniella occidentalis infected by Beauveria bassiana YT 11注：A，接菌24 h, 西花薊馬體內(nèi)增多的蟲菌體；B，侵染36 h, 死亡西花薊馬體內(nèi)的蟲菌體；C，接菌48 h, 活蟲體內(nèi)組織間的蟲菌體；D，接菌 48 h, 死亡蟲體內(nèi)開始出現(xiàn)的菌絲；E，接菌56 h, 被侵染的消化道中的蟲菌體；F，接菌56 h, 被侵染肌肉組織中的菌絲；G-H，接菌56 h, 活蟲與死亡蟲體內(nèi)的菌絲。Note: A, after 24 h post treatment, the hyphal bodies increased; B, the hyphal bodies in the dead insect at 36 h post inoculation; C, the hyphal bodies were among the tissues in the live insect; D, after 48 h treated, the hyphae occurred in the dead F. occidentalis; E, after 56 h inoculation, the hyphal bodies shown in the alimentary canal; F, at 56 h post-inoculation, the hyphae invaded the muscle tissue; G-H, the hyphae were observed in live and dead insects.

圖3 西花薊馬感染球孢白僵菌YT 11菌株后期體內(nèi)與體表變化Fig.3 The post changes of Frankliniella occidentalis infected by Beauveria bassiana YT 11注：A，接菌64 h, 組織解離的死亡西花薊馬；B，接菌64 h, 充滿蟲菌體與菌絲的西花薊馬活蟲；C、D，接菌72 h, 菌絲突破體壁, 覆蓋蟲尸并成功在體表產(chǎn)孢。Note: A, the tissues were disintegrated in the dead insect; B, the live hosts were full with hyphae and hyphal bodies; C、D, the hyphae broke the integument, covered insect and successfully produced the conidia on the surface.

分生孢子的粘附與萌發(fā)是昆蟲病原真菌入侵的第一步，也是成功入侵的基礎(chǔ)。綠僵菌侵染蟲體時(shí)分生孢子萌發(fā)行為和致病性受寄主表皮組成物質(zhì)如碳水化合物、脂肪酸等物質(zhì)的影響(Butt,1995;Drauzio,2004)，蟲體體表結(jié)構(gòu)也對白僵菌的入侵行為有重要影響，王曉紅等(2009)發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌侵入桑天牛Aprionagermari幼蟲表皮時(shí)，有一定的選擇性：在不適宜的體表處，孢子具有先平行生長，待遇到合適的侵入點(diǎn)再開始入侵，而本試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌對西花薊馬體壁不同結(jié)構(gòu)區(qū)域入侵時(shí)具有選擇性。有研究發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌接種菲島玉米蠟蟬Peregrinusmaidis后72 h分生孢子大量萌發(fā)；而球孢白僵菌侵染煙粉虱，接菌10 h后孢子開始萌發(fā)(Toledo,2010)。從而表明球孢白僵菌在不同寄主的體壁的萌發(fā)速度存在明顯差異，而本研究在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菌株BbYT11在接種西花薊馬4 h后分生孢子已開始萌發(fā)，有研究發(fā)現(xiàn)煙粉虱Bemisiatabaci表皮內(nèi)脂類物質(zhì)對白僵菌的萌發(fā)有一定的抑制作用(劉召，2006)，而趙成銀(2001)等分析研究西花薊馬體壁，未發(fā)現(xiàn)對球孢白僵菌分生孢子萌發(fā)的抑制脂類物質(zhì)。

通過金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae對西花薊馬侵染過程的研究，表明接種后12 h產(chǎn)生附著胞，3 d后才在蟲體血腔中定殖(Vestergaard,1999)。Wu等(2014)研究表明球孢白僵菌接種西花薊馬24 h后，分生孢子萌發(fā)，芽管定向體壁生長，36 h才開始侵入體壁。BbYT 11菌株處理西花薊馬4 h后，部分分生孢子萌發(fā)并長出芽管，部分芽管開始定向穿透體壁出現(xiàn)在侵染8 h。至接菌18 h，大量的分生孢子萌發(fā)穿透體壁，蟲體內(nèi)開始出現(xiàn)蟲菌體。產(chǎn)生這種差異的原因可能是不同菌株間毒力存在較大差異。

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Microsc opicobservations of the process ofBeauveriabassianainfectingFrankliniellaoccidentalisthrough frozen sections

ZHANG Zhi-Jian1, ZHENG Chang-Ying1, ZHAO Chuan-De1, WAN Fang-Hao1,2, WANG Jun-Ping1*

(1. Key Laboratory of Integrated Crop Pest Management of Shandong Province, College of Agronomy and Plant Protection, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong Province, China; 2. Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

The pathological changes ofFrankliniellaoccidentalisinfected byBeauveriabassianawere observed using frozen sections with hematoxylin-eosin (H & E)staining. The result showed that the conidia began to germinate which adhesion on the cuticle after inoculated 4 h. Within 8-12 h after inoculation, the germ tubes continued to elongation and appeared penetrating the integument. At 18 h post inoculation, the hyphal bodies succeeded to be observe in the internal tissue and began to reproduce in the hemocoele. And then, the hyphal bodies and hyphae increased,tissues and organs were infected, muscle tissue and alimentary cancal began to undergo pathological changes.

Frankliniellaoccidentalis；Beauveriabassiana；frozen sections；infect；histopathological changes

國家自然科學(xué)基金(31201777)；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金(630609)；山東省“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用型人才培養(yǎng)特色名校建設(shè)工程大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目

張志建，女，1990年生，山東濰坊人，碩士研究生，主要從事農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治研究

*通訊作者Author for correspondence，E-mail: junpingwang@qau.edu.cn

Received：2015-12-31；接受日期Accepted：2016-03-15

Q965;S476

A

1674-0858(2017)01-0181-06

張志建，鄭長英，趙川德，等.利用冷凍切片對球孢白僵菌侵染西花薊馬過程的觀察[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2017,39(1):181-186.