• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用

      2017-03-14 23:19:50
      大醫(yī)生 2017年9期
      關(guān)鍵詞:拷貝數(shù)分子生物學(xué)染料

      陳 曦

      1 PCR技術(shù)的基本原理

      PCR擴(kuò)增即聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù),是在體外特異性地?cái)U(kuò)增某個(gè)基因的方法。在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后,可以通過(guò)凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析,也可以通過(guò)放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描來(lái)進(jìn)行定量的分析。無(wú)論定性還是定量分析,分析的都是 PCR 終產(chǎn)物[1]。但是在很多研究中感興趣的是未經(jīng)PCR 信號(hào)放大之前的起始模板量。例如想知道某一轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達(dá)量。在這種需求下熒光定量 PCR 技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào)。隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積,熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),可通過(guò)監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而繪制成一條熒光擴(kuò)增曲線。

      2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的熒光檢測(cè)

      可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的熒光化學(xué)方法多種多樣,主要分為特異性的雜交探針和非特異性的熒光染料。雜交探針?lè)椒ㄐ柙O(shè)計(jì)與靶序列特異雜交的探針,并標(biāo)記特殊熒光,如分子信標(biāo)和Taqman等。非特異性的熒光染料則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增的增加,如DNA結(jié)合染料SYBR-Green I。探針類(lèi)由于增加了探針的識(shí)別步驟,特異性更高,但成本較高,且探針與模板結(jié)合有一定的要求(PCR反應(yīng)溫度、反應(yīng)液組成等)[2]。熒光染料法價(jià)格低廉,簡(jiǎn)單易行。SYBR-Green I是目前最為常用的熒光染料,其作用原理為:SYBR-Green I是一種只與雙鏈DNA小溝結(jié)合的染料,并不與單鏈DNA鏈結(jié)合,而且在游離狀態(tài)不發(fā)出熒光,只有摻入DNA雙鏈中才可發(fā)光。因此,在PCR系統(tǒng)中,隨著特異性PCR產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增,每個(gè)循環(huán)的延伸階段,染料摻入雙鏈DNA中,其熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān),可以對(duì)目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量,同時(shí)還可以測(cè)定擴(kuò)增的目的DNA片段的融解溫度。

      3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的定量方法

      絕對(duì)定量方法:獲得的結(jié)果為起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù),通常利用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)推算未知樣本的量。選擇合適的已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品,系列稀釋后作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)和反應(yīng)獲得的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。絕對(duì)定量的前提是要有一組穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品,可以是含有目的基因的質(zhì)粒DNA,也可以是比擴(kuò)增片段長(zhǎng)的純化PCR產(chǎn)物,但前提是所有的作為標(biāo)準(zhǔn)品的核酸都必須保證穩(wěn)定。但由于標(biāo)準(zhǔn)品和目的基因不在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增,所以無(wú)法檢測(cè)也不能補(bǔ)償可能出現(xiàn)的目的基因反應(yīng)體系中的影響因素。

      常用的相對(duì)定量計(jì)算方法是比較Ct法。使用該方法進(jìn)行基因表達(dá)定量時(shí),來(lái)自于同一樣品的目的基因和內(nèi)參基因都要進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng),其結(jié)果由目的基因與內(nèi)參基因Ct之間的差值ΔCt來(lái)反應(yīng)。比較常用的有2-ΔΔCt方法[3]。

      目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR已經(jīng)稱(chēng)為分子生物學(xué)科研領(lǐng)域的主要技術(shù)手段,極大地簡(jiǎn)化了核酸定量檢測(cè)的過(guò)程。自動(dòng)化操作提高了工作效率,反應(yīng)快速、重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。例如隨著生物芯片技術(shù)和熒光探針定量技術(shù)的結(jié)合,熒光定量PCR在醫(yī)學(xué)檢測(cè)及其他各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用前景將更加廣闊。

      [1] 陳莊,鄧存良,吳剛.分子生物學(xué)基本技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].科學(xué)出版社,2015.23-25.

      [2] 魏群.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].高等教育出版社,2015.48-55.

      [3] 葉棋濃.現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)及實(shí)驗(yàn)技巧[M].化學(xué)工業(yè)出版社,2015.176-179.

      猜你喜歡
      拷貝數(shù)分子生物學(xué)染料
      新染料可提高電動(dòng)汽車(chē)安全性
      線粒體DNA拷貝數(shù)變異機(jī)制及疾病預(yù)測(cè)價(jià)值分析
      中國(guó)染料作物栽培史
      胎兒染色體組拷貝數(shù)變異與產(chǎn)前超聲異常的相關(guān)性分析
      染料、油和水
      本科生分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教學(xué)改革初探
      新型含1,2,3-三氮唑的染料木素糖綴合物的合成
      ABO亞型Bel06的分子生物學(xué)鑒定
      成軍:從HCV入手,探索脂類(lèi)代謝分子生物學(xué)新機(jī)制
      DNA序列拷貝數(shù)變化決定黃瓜性別
      阿荣旗| 确山县| 武冈市| 延津县| 红河县| 武宣县| 上蔡县| 翁牛特旗| 克东县| 上蔡县| 东阳市| 新巴尔虎左旗| 阿坝县| 呼和浩特市| 页游| 洛川县| 临高县| 申扎县| 黑龙江省| 贵港市| 红安县| 裕民县| 曲阳县| 玉山县| 太仆寺旗| 高邮市| 佛坪县| 平陆县| 雷山县| 孝感市| 平湖市| 丹巴县| 平武县| 昌都县| 沙田区| 长沙市| 静乐县| 达尔| 洛浦县| 五寨县| 文安县|