齊多夫定對(duì)J亞群禽白血病病毒的體內(nèi)外抑制作用

姜春樂(lè)，郭秀清，遲靜

（1.桃村獸醫(yī)站，山東 煙臺(tái) 265300；2.臨朐縣畜牧局，山東 濰坊 262600；3.煙臺(tái)市牟平區(qū)畜牧獸醫(yī)工作站，山東 煙臺(tái) 264100）

齊多夫定對(duì)J亞群禽白血病病毒的體內(nèi)外抑制作用

姜春樂(lè)1，郭秀清2，遲靜3

（1.桃村獸醫(yī)站，山東 煙臺(tái) 265300；2.臨朐縣畜牧局，山東 濰坊 262600；3.煙臺(tái)市牟平區(qū)畜牧獸醫(yī)工作站，山東 煙臺(tái) 264100）

禽白血病病毒與人的HIV同屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，鑒于已有多種藥物在控制HIV中起到了重要作用，本研究試圖探索此類藥物在輔助禽白血病病毒凈化中的可行性，分別在體內(nèi)和體外觀察了齊多夫定對(duì)J亞群禽白血病病毒的抑制作用。首先通過(guò)在培養(yǎng)液中添加不同藥物濃度連續(xù)傳代以及利用CCK法測(cè)定細(xì)胞活性的方法，確定了在培養(yǎng)液中添加藥物不超過(guò)5μg/ml的藥物濃度對(duì)于DF-1細(xì)胞的復(fù)制沒(méi)有影響。體外試驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)在培養(yǎng)液中添加5μg/ ml的藥物時(shí)可以顯著抑制J亞群禽白血病病毒在DF-1細(xì)胞上的復(fù)制，與不添加藥物組差異顯著；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在10mg/只/d連續(xù)用藥7d情況下感染J亞群禽白血病病毒雞群在前六周內(nèi)病毒血癥完全消除。本研究證實(shí)了齊多夫定在體內(nèi)和體外對(duì)J亞群禽白血病病毒均具有明顯的抑制作用，這有助于在檢測(cè)淘汰的同時(shí)通過(guò)藥物的輔助加速不同雞群中禽白血病病毒的凈化進(jìn)程。

禽白血病病毒；齊多夫定；體內(nèi)；體外；抑制作用

禽白血病(Avian leukemia,AL)是由禽白血病病毒/肉瘤病毒群病毒引起的禽類多種良性和惡性腫瘤性疾病，臨床上多以免疫抑制、生長(zhǎng)抑制和多器官組織出現(xiàn)腫瘤等為主要特征[1]。根據(jù)病毒囊膜蛋白和與病毒的宿主特異性相關(guān)的 gp85蛋白抗原性差異，禽白血病毒可分為A-J共10個(gè)亞群，其中只有A、B、C、D、E和J亞群能感染雞[2-3]。

在上世紀(jì)80年代以前，A、B亞群ALV是引起雞群淋巴性白血病和各類型腫瘤的主要亞群，但在80年代中期，西方大型種雞公司已基本消除了雞群中A、B亞型ALV的感染。而從上世紀(jì)90年代起，J亞群禽白血病在白羽肉雞中廣泛流行，給肉雞業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)過(guò)幾十年的凈化措施，國(guó)際上多數(shù)大型種雞公司也已基本凈化了ALV-J感染。由于中國(guó)在禽白血病方面一直未進(jìn)行全面的凈化措施，我國(guó)不同雞群中禽白血病病毒感染仍較普遍，其中J亞群多見(jiàn)報(bào)道[4-8]，并且還不斷有新的K亞群出現(xiàn)[9-10]。

禽白血病病毒與人的HIV同屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，與HIV一樣，目前尚無(wú)有效的商品化疫苗用于ALV的預(yù)防。鑒于ALV主要通過(guò)垂直傳播，國(guó)際上主要通過(guò)凈化措施來(lái)控制 ALV，檢測(cè)和淘汰ALV陽(yáng)性種雞。目前，國(guó)際上用于原種雞群的最優(yōu)凈化方案是對(duì)核心雞群全部采血接種 DF-1細(xì)胞，9d后檢測(cè)P27抗原，凡陽(yáng)性者全部淘汰。但是這一程序需要較高的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平，也不適于大量樣品的檢測(cè)。

在HIV的控制中，通過(guò)多種藥物及其組合已經(jīng)較好的控制了HIV。我們有興趣知道類似的藥物是否可以通過(guò)控制HIV類似的策略來(lái)阻斷或者至少降低ALV-J的感染。為此，本研究觀察了齊多夫定對(duì)J亞群禽白血病病毒在體內(nèi)和體外的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒與抗體 對(duì)內(nèi)源性E亞群ALV有抗性的DF-1細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC，其基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM（pH7.2，GIBCO，USA），生長(zhǎng)液中添加10%胎牛血清（FBS），維持液中添加2%FBS。ALVJ的NX0101株是2001年由本實(shí)驗(yàn)室從中國(guó)的寧夏回族自治區(qū)某父母代種雞場(chǎng)分離到的野毒株[11]，其傳染性克隆rNX0101由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存[12]。rNX0101在DF-1細(xì)胞上增殖后，上清液按照Reed-Muench法方法測(cè)定其TCID50為10-2.5TCID50/0.1mL。

1.2 藥物與疫苗 藥物齊夫多定（AZT）為葛蘭素威爾康公司生產(chǎn)的藥物原粉。在細(xì)胞上使用時(shí)，用細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM配制所需藥物濃度；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中使用時(shí)，用生理鹽水配制所需藥物濃度。雞新城疫滅活疫苗以及 H9亞型禽流感滅活疫苗均購(gòu)自梅里亞公司。

1.3 不同濃度AZT對(duì)DF-1細(xì)胞復(fù)制和活性的影響 AZT濃度過(guò)高會(huì)對(duì)DF-1細(xì)胞引起損傷，導(dǎo)致ALV-J的復(fù)制受到影響。為了確定對(duì)DF-1細(xì)胞復(fù)制的安全藥物濃度，本研究通過(guò)在不同藥物濃度培養(yǎng)液中連續(xù)傳代和CCK細(xì)胞毒性測(cè)定兩種方法來(lái)評(píng)估藥物的安全使用范圍。首先在細(xì)胞培養(yǎng)液中分別添加 120、100、60、40、20、5、3、2、1、0.5μg/ml的AZT，然后將上述不同濃度AZT培養(yǎng)液進(jìn)行DF-1細(xì)胞的連續(xù)傳代，至少傳代15代以上，表示該藥物濃度對(duì)DF-1細(xì)胞的復(fù)制沒(méi)有影響。此外，通過(guò) CCK-8試劑盒（Vazyme Biotech， China）測(cè)定了不同藥物濃度對(duì)DF-1細(xì)胞的活性影響，具體操作參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)[13]。

1.4 不同濃度AZT對(duì)ALV-J在DF-1細(xì)胞復(fù)制的抑制作用 在一個(gè)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種同等數(shù)量的DF-1細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)成為單層后1～20孔每孔接種rNX0101株500個(gè)TCID50，剩余21～24孔不添加藥物作為空白細(xì)胞對(duì)照。2h后1～4孔換為維持液A，其中含有5μg/ml的AZT，5～8孔、9～12孔、13～16孔分別更換為含有 3、2、1μg/ml AZT的維持液，17～20孔不添加藥物。接種ALV-J培養(yǎng)7d后，收取24個(gè)孔細(xì)胞上清液，以ALV-p27抗原ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定CEF細(xì)胞中的p27抗原并記錄各個(gè)孔的S/P值，同時(shí)對(duì)不同組的細(xì)胞上清液按照Reed-Muench法方法測(cè)定其TCID50。

1.5 不同濃度AZT對(duì)海蘭褐生產(chǎn)性能的影響 從經(jīng)過(guò)ALV凈化的種雞場(chǎng)購(gòu)買80只1日齡海蘭褐商品代蛋雞，1日齡頸靜脈采血分離病毒，經(jīng)鑒定無(wú)ALV、REV和MDV感染，將其分為A、B、C、D 4個(gè)組。其中A組不服用藥物，作為空白對(duì)照組；B組從1日齡起每只雞每天肌肉多點(diǎn)5mg AZT，連續(xù)用藥 7d；C組從 1日齡起每只雞每天肌肉多點(diǎn)10mg AZT，連續(xù)用藥7d；D組從1日齡起每只雞每天肌肉多點(diǎn)20mg AZT，連續(xù)用藥7d。7日齡時(shí)免疫H9亞型禽流感滅活疫苗和新城疫滅活疫苗。分別在第 14、21、28、35、42、49、56、63d時(shí)對(duì)各組稱重，并同時(shí)采集血清以血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HI）分別測(cè)定針對(duì)H9亞型禽流感滅活疫苗和新城疫滅活疫苗抗體，觀察不同藥物濃度對(duì)海蘭褐雞體重和免疫機(jī)能的影響。

1.6 不同劑量AZT對(duì)ALV-J在海蘭褐雞內(nèi)復(fù)制的抑制作用 從經(jīng)過(guò)ALV凈化的種雞場(chǎng)購(gòu)買80只1日齡海蘭褐商品代蛋雞，1日齡頸靜脈采血分離病毒，經(jīng)鑒定無(wú)ALV、REV和MDV感染，將其分為A、B、C、D 4個(gè)組，其中A組為空白對(duì)照組；B組從1日齡起每只雞每天口服5mg，連續(xù)服藥7d；C組從1日齡起每只雞每天口服10mg，連續(xù)服藥7d；D組僅攻毒ALV-J不用藥。在首次用藥后 2h對(duì) B、C、D三個(gè)組均以 rNX0101感染，104TCID50/只。從第 一 周起每 周 采 集 抗 凝 血 ，4°1500rpm離心后接種CEF細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，檢測(cè)各組病毒血癥的陽(yáng)性情況。

2 結(jié)果

2.1 不同AZT添加濃度對(duì)DF-1細(xì)胞復(fù)制和活性的影響 當(dāng)在培養(yǎng)液中加入濃度高于 5μg/ml的AZT時(shí)，DF-1細(xì)胞均無(wú)法正常傳代；當(dāng)在培養(yǎng)液中加入濃度3μg/ml及以下的AZT時(shí)，DF-1細(xì)胞可連續(xù)傳代40代以上（表1）。在培養(yǎng)液中分別添加5、3、2、1、0.5μg/ml的AZT，使用CCK-8試劑盒測(cè)定藥物濃度對(duì)細(xì)胞活性，在450nm下分別測(cè)定細(xì)胞的吸光度，連續(xù)觀察160h，以吸光度值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫軸，繪制折線圖（見(jiàn)圖 1），顯示所用藥物濃度都對(duì)細(xì)胞活性有輕微影響，但差異不明顯。

表1 添加不同濃度AZT對(duì)DF-1細(xì)胞傳代的影響

圖1 不同藥物濃度下吸光度值

2.2 不同AZT添加濃度對(duì)ALV-J在DF-1細(xì)胞復(fù)制的抑制作用 接種NX0101的DF-1細(xì)胞在分別含有 5、3、2、1、0.5μg/ml AZT的維持液中培養(yǎng) 7d后，收獲細(xì)胞上清液，以 ALV-p27抗原ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定CEF細(xì)胞中的p27抗原并記錄各個(gè)孔的S/P值，以ELISA檢測(cè)的S/P值為縱軸，AZT添加濃度為橫軸繪制柱形圖 （圖2），可明顯觀察到AZT明顯的抗病毒作用。同時(shí)對(duì)各組病毒含量（TCID50）進(jìn)行了測(cè)定（表2）。結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加，rNX0101的復(fù)制受到的抑制作用隨之增強(qiáng)。

表2 不同藥物添加濃度對(duì)ALV-J在DF-1細(xì)胞復(fù)制的抑制作用

圖2 不同藥物添加濃度對(duì)ALV-J在DF-1細(xì)胞復(fù)制的抑制作用

2.3 不同濃度AZT對(duì)海蘭褐雞生產(chǎn)性能的影響 給海蘭褐雞每天分別服用5、10mg AZT和20mg，并連續(xù)使用7d，觀察發(fā)現(xiàn)使用5mg和10mg AZT雖然造成了雞比空白對(duì)照組的體重輕微下降，但差異不明顯（圖3），20mg組有明顯死亡發(fā)生，這可能與對(duì)幼年小雞注射過(guò)量液體有關(guān)，對(duì)于該組我們?cè)诤罄m(xù)的實(shí)驗(yàn)中將不予討論。在免疫H9亞型禽流感滅活疫苗和新城疫滅活疫苗后4、6、8周后測(cè)定針對(duì)H9亞型禽流感滅活疫苗和新城疫滅活疫苗抗體顯示服用藥物對(duì)兩種疫苗抗體滴度與空白對(duì)照組差異不顯著，在某些情況下甚至?xí)哂诳瞻讓?duì)照組（表3、表 4）。

圖3 每周各組體重平均值柱狀圖

表3 用藥組和不用藥組在免疫新城疫后HI抗體滴度的影響

表4 用藥組和不用藥組在免疫禽流感H9疫苗后HI抗體滴度的影響

2.4 不同劑量AZT對(duì)ALV-J在海蘭褐雞內(nèi)復(fù)制的抑制作用 未使用AZT的ALV-J感染組從第一周至第九周表現(xiàn)為持續(xù)病毒血癥陽(yáng)性，并維持在一個(gè)較高的水平。而使用10mg AZT的感染組到42d為止均未出現(xiàn)病毒血癥。使用5mg AZT的感染組盡管前6周沒(méi)有完全消除ALV-J的感染，但病毒血癥陽(yáng)性率也明顯低于不用AZT的感染組，但病毒血癥在第九周時(shí)完全消失（表5）。

表5 不同日齡病毒分離陽(yáng)性率

3 討論

近年來(lái)，不同雞群感染ALV的報(bào)道在中國(guó)越來(lái)越多，特別是在一些地方品系雞群中ALV感染的陽(yáng)性率非常高，腫瘤類型也多種多樣[14-15]。鑒于目前尚未有商品化的疫苗能夠用于控制ALV，一些種雞場(chǎng)不得不針對(duì)ALV開(kāi)始實(shí)施嚴(yán)格的凈化措施。目前，國(guó)際上用于原種雞群的最優(yōu)凈化方案是對(duì)核心雞群全部采血接種DF-1細(xì)胞進(jìn)行外源性ALV的分離鑒定并全部淘汰陽(yáng)性，這已經(jīng)成為種雞群凈化的國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)。但是在執(zhí)行這一標(biāo)準(zhǔn)時(shí)遇到了很多困難，因?yàn)樵谥袊?guó)很多雞群中ALV陽(yáng)性率過(guò)高導(dǎo)致凈化中淘汰過(guò)多嚴(yán)重影響了進(jìn)化的進(jìn)程[16]。

ALV與人獲得性免疫缺陷病毒（HIV）同屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科，它們的基因組結(jié)構(gòu)非常相似，即5'-gag-pol-env-3'，其中pol基因編碼位于核芯中的反轉(zhuǎn)錄酶（RT）和整合酶（IN，P32），RT具有依賴RNA和依賴 DNA的聚合酶活性，IN是病毒核酸整合進(jìn)宿主細(xì)胞所必須的，能將病毒核酸整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體基因組中。針對(duì)這一特性，目前已經(jīng)有很多藥物應(yīng)用于HIV的控制，如目前廣泛使用的AZT[17-19]。AZT的分子結(jié)構(gòu)與脫氧胸腺嘧啶核苷酸結(jié)構(gòu)很相似，逆轉(zhuǎn)錄酶錯(cuò)將其利用，但因其脫氧核糖的第3位缺少羥基，不能與另一核糖核苷酸上第5位羥基與磷酸酯化相連，不能形成3,5-磷酸二酯鍵，DNA鏈的編碼被中斷，因而抑制了病毒的復(fù)制。泰國(guó)一項(xiàng)大規(guī)模的研究結(jié)果顯示，在妊娠晚期和分娩期給予葛蘭素威爾康公司生產(chǎn)的AZT使HIV的母嬰傳染率降低一半[20]。這種策略是否可以用于同樣主要依靠垂直傳播的ALV的控制呢？本研究從體內(nèi)和體外兩個(gè)方面觀察了AZT對(duì)ALV-J復(fù)制的抑制作用。

在進(jìn)行這一研究前確保所使用的藥物濃度不會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞或動(dòng)物機(jī)體造成過(guò)度損傷是十分必要的，如果細(xì)胞狀態(tài)較差會(huì)導(dǎo)致ALV-J在細(xì)胞上不能復(fù)制，而這種抑制并不是藥物本身對(duì)ALV-J的抑制作用。目前常用的方法是用CCK測(cè)定使用藥物后的細(xì)胞活性，利用這一方法測(cè)定結(jié)果顯示在添加5μg/ml濃度以下情況下，DF-1細(xì)胞的活性幾乎不受影響。此外，本研究還通過(guò)DF-1細(xì)胞在添加不同濃度AZT的細(xì)胞培養(yǎng)液中連續(xù)傳代來(lái)不同濃度對(duì)DF-1細(xì)胞復(fù)制的影響，結(jié)果顯示在添加3μg/ml的培養(yǎng)液中DF-1細(xì)胞可以連續(xù)傳代40代以上。在雞體中我們觀察了不同藥物濃度對(duì)雞體重以及免疫機(jī)能的影響，結(jié)果顯示在每天使用5mg情況下雞的體重與免疫機(jī)能幾乎不受影響。在此基礎(chǔ)上我們分別通過(guò)在DF-1細(xì)胞接種ALV-J和給海蘭褐雞感染ALV-J后使用不同濃度AZT的方式評(píng)估了AZT在體內(nèi)和體外對(duì)ALVJ復(fù)制的抑制作用，結(jié)果顯示不管是體內(nèi)還是體外AZT均能夠顯著抑制ALV-J的復(fù)制。

考慮到AZT在控制 HIV過(guò)程中產(chǎn)生的大量耐藥毒株的報(bào)道[21-22]，本研究建議 AZT的使用不能維持過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間特別是不能一直持續(xù)用藥，為此本研究?jī)H用藥7d即停止喂藥，即便如此，AZT對(duì)ALV-J的抑制作用仍然是非常明顯的，很多ALV-J感染雞在后期的連續(xù)觀察中病毒血癥為陰性。特別是當(dāng)每只雞服用3mg AZT情況下，所有雞在63d時(shí)病毒血癥全部轉(zhuǎn)為陰性。

需要強(qiáng)調(diào)的是，藥物的使用不能夠替代針對(duì)ALV的凈化，因?yàn)樗鼰o(wú)法確保使感染雞的病毒血癥100%消除。因此它的作用主要是針對(duì)一些感染率極高的品系，如中國(guó)一些非常寶貴的地方品系雞群，在進(jìn)行凈化的同時(shí)以藥物降低病毒血癥陽(yáng)性率來(lái)加速凈化的進(jìn)程，因此僅可以作為凈化措施的補(bǔ)充。這一措施還有一個(gè)潛在的優(yōu)勢(shì)是，通過(guò)藥物的使用降低了ALV的病毒血癥水平，這有助于雞體產(chǎn)生針對(duì)ALV的抗體加速清除ALV。

[1] SAIF Y M,BARNES H J,GLISSON J R,et al.Disease of poultry [M].11th ed.Iowa:Iowa State University Press,2003:64-81.

[2] COFFIN J M.Structure and classification of Retroviruses [M]Levy J A (Ed).The Retroviridate.New York: Plenum Press,1992,vol.1:19-49.

[3] 高玉龍，秦立廷，王笑梅.家禽病毒性免疫抑制病流行特點(diǎn)與防控對(duì)策[J].中國(guó)家禽，2012，34(15):5-11.

[4] 崔治中，張志，杜巖．我國(guó)肉用型雞群中J亞群白血病流行現(xiàn)狀的調(diào)查 ［J］．中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，24（4）：292-294.

[5] XU B,DONG W,YU C,et al.Occurrence of avian leukosis virus subgroup J in commercial layer flocks in China [J].Avian Pathol,2004,33(1):13-17.

[6] CHENG Z Q，ZHANG L，LIU S D，et al.Emerging of avian leukosis virus subgroup J in a flock of Chinese localbreed[J].J Microl,2005 45(4):584-587.

[7] 王輝，崔治中．蛋雞 J亞群白血病病毒的分離鑒定及序列分析［J］．病毒學(xué)報(bào),2008，24:369-375.

[8] 趙冬敏，張青嬋，崔治中．蘆花雞中B亞群禽白血病病毒的分離與鑒定［J］．病毒學(xué)報(bào)，2010，26(1):53-57.

[9] 王鑫，趙鵬，崔治中.我國(guó)地方品種雞分離到的一個(gè)禽白血病病毒新亞群的鑒定[J].病毒學(xué)報(bào)，2012，28 (6):609-614.

[10] Cui N,Su S,Chen Z,Zhao X,Cui Z.Genomic sequence analysis and biological characteristics of a rescued clone of avian leukosis virus strain JS11C1, isolated from indigenous chickens.JGen Virol. 2014 Nov;95 (Pt 11):2512-22.doi:10.1099/vir. 0.067264-0.Epub 2014 Jul 9.

[11]Cui Z，Du Y，Zhang Z，et al.Comparison of Chinese field strains of avian leukosis subgroup J viruses with prototype strain HPRS-103 and United States strains[J].Avian Dis，2003，47(4):1321-1330.

[12]張紀(jì)元，崔治中，丁家波，等.J亞群白血病病毒NX0101株感染性克隆化病毒的構(gòu)建及其致病性[J].微生物學(xué)報(bào),2005(3)：437-440,485.

[13] 熊建文，肖化，張鎮(zhèn)西.MTT法和CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性之測(cè)試條件比較 [J].激光生物學(xué)報(bào)，2007，16（5）：560-562.

[14] 朱美真，吳玉寶,崔治中.地方品系雞中一株 A亞群雞白血病病毒的分離和鑒定 ［J］.中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2009,17(4):31-35.

[15] 邊曉明，李德慶，趙鵬，等.三群商品代蛋雞 J亞群白血病跟蹤觀察 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46(2): 409-416.

[16] 崔治中.雞白血病及其鑒別診斷和預(yù)防控制[J].中國(guó)家禽，2010,32(8):1-12.

[17] Lin TS,Schinazi RF,Chen MS,Kinney-Thomas E,Prusoff WH.Antiviral activity of 2',3'-dideoxycytidin-2'-ene(2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrocytidine)against human immuno deficiency virus in vitro[J].Biochem Pharmacol.1987 Feb 1;36(3):311-6.

[18] Jablon L.Azidothymidine(AZT)[M].Conn Med.1987 Jul;51(7):453-4.

[19] Hopkins S.Zidovudine treatment for AIDS[J].Nurs Times，1987，83(39):64-5.

[20] 馬振英.短期用齊多夫定治療和阻斷HIV的母嬰傳染[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè).1998，25(5):305.

[21] Jing Zhanga,Tingjun Houb,Wei Wangc,and Jun S. Liua.Detecting and understanding combinatorial mutation patterns responsible for HIV drug resistance[J].PNAS,2010 107(4):1321-1326.

[22] Bianca Bruzzone,a Antonio Di Biagio,b Laura Sticchi,a,c Renata Barresi,a Francesco Saladini,d Giancarlo Icardi,a, c Maurizio Settie.Feasibility and Reproducibility of HIV-1 Genotype Resistance Test in Very-Low-Level Viremia[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2014,58(12):7620-7621.

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