二甲基苯蒽/佛波酯兩步化學(xué)法誘導(dǎo)小鼠皮膚癌的模型優(yōu)化

孫佳惠，單慧，潘蕭羽，顧玉超*

(1.中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，教育部海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2. 青島黃海學(xué)院基礎(chǔ)教學(xué)部，山東 青島 266427)

二甲基苯蒽/佛波酯兩步化學(xué)法誘導(dǎo)小鼠皮膚癌的模型優(yōu)化

孫佳惠1，單慧1，潘蕭羽2，顧玉超1*

(1.中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，教育部海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2. 青島黃海學(xué)院基礎(chǔ)教學(xué)部，山東 青島 266427)

目的 對兩步化學(xué)誘導(dǎo)法建立BALB/c小鼠皮膚癌模型進(jìn)行方法優(yōu)化。方法 將BALB/c小鼠背部剃毛暴露出約2 cm×2 cm的皮膚，小鼠隨機(jī)分為空白對照組和4個模型組，4個模型組第1周分別涂1、2、4、7次100 μg/100 μL DMBA/丙酮液，后續(xù)均1周涂兩次4 μg/100 μL TPA/丙酮液，記錄小鼠體重、成瘤時間、成瘤數(shù)量，并在12周后處死小鼠取腫瘤組織及瘤旁組織做HE染色分析。結(jié)果 1周涂1次DMBA成瘤周期長；1周兩次成瘤周期短，質(zhì)量高；1周4次會損傷皮膚但不影響腫瘤的形成；1周7次對皮膚傷害較大并導(dǎo)致小鼠死亡。結(jié)論 采用第1周涂兩次DMBA啟動，后續(xù)用TPA連續(xù)誘導(dǎo)建立BALB/c小鼠皮膚癌模型操作簡便，成瘤期短，癌變率高，與人類皮膚癌發(fā)生發(fā)展相似，可用于建立研究皮膚癌較為理想的實(shí)驗(yàn)動物模型。

皮膚癌；兩步化學(xué)法；小鼠；二甲基苯蒽；佛波酯

SUN Jia-hui1, SHAN Hui1, PAN Xiao-yu2, GU Yu-chao1*

皮膚癌系表皮角質(zhì)形成細(xì)胞惡性增生的結(jié)果，是人類最常見的惡性腫瘤。動物模型已成為腫瘤相關(guān)研究的重要工具[1]。目前皮膚癌造模方法主要有化學(xué)誘發(fā)、光誘發(fā)[2]兩種方法，最常用的是DMBA/TPA兩步化學(xué)誘導(dǎo)法[3]。

本實(shí)驗(yàn)主要針對BALB/c小鼠的兩步化學(xué)誘導(dǎo)皮膚癌造模方法進(jìn)行了優(yōu)化。雖然KM小鼠是我國生產(chǎn)量、使用量最大的遠(yuǎn)交群小鼠，且經(jīng)常被用在皮膚癌造模中，但在前期使用KM小鼠的實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)成瘤的過程中，其個體間差異較大，無法獲得均一性很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，我們選擇了近交系小鼠BALB/c進(jìn)行了此次皮膚癌誘導(dǎo)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，鑒于BALB/c小鼠的基因純合性和遺傳穩(wěn)定性，其有較為均一的表現(xiàn)型，且在腫瘤發(fā)病率、形態(tài)學(xué)特點(diǎn)、對藥物的反應(yīng)等方面的均衡一致要強(qiáng)于遠(yuǎn)交系小鼠。

另外，在前期使用BALB/c小鼠進(jìn)行皮膚癌造模的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)采用經(jīng)典的兩步化學(xué)誘導(dǎo)法可以有效地誘導(dǎo)皮膚癌的發(fā)生。而且DMBA作為啟動劑，在誘導(dǎo)皮膚癌發(fā)生的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。但DMBA劑量過低，即使后續(xù)加大TPA劑量也很難誘導(dǎo)皮膚癌的發(fā)生，而過高的DMBA劑量又會對小鼠皮膚產(chǎn)生刺激，甚至傷害皮膚表層，使皮膚出現(xiàn)破損、結(jié)痂、發(fā)炎流膿的現(xiàn)象。因此，DMBA的涂藥劑量對成瘤質(zhì)量、成瘤時間、小鼠荷瘤數(shù)等有重要影響。由于BALB/c小鼠體型小、免疫力弱，更需要對BALB/c小鼠皮膚癌造模的最適DMBA給藥量進(jìn)行探究，以期用最合適的DMBA給藥量，快速誘導(dǎo)出皮膚癌又盡量避免對小鼠皮膚的傷害，建立與腫瘤自發(fā)形成規(guī)律最貼合的皮膚癌模型以用于后續(xù)針對皮膚癌的科學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與飼養(yǎng)條件

4～5周齡雌性SPF級近交系BALB/c小鼠50只，體重12～16 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]。整個過程按照SPF級動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)在青島海洋生物醫(yī)藥研究院動物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行飼養(yǎng)，[SYXK(魯)2015-0011]。飼養(yǎng)條件：每籠5只。飼料：普通繁殖鼠料。溫度：25～30 ℃。濕度：50%～70%。

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，全部小鼠背部備皮，暴露約2 cm × 2 cm皮膚，24 h后隨機(jī)分組備用。

1.2 主要試劑

7，12一二甲基苯蒽(DMBA)分子式：C20H16，相對分子量：256.34，含量≥95%，產(chǎn)品編號 D3254。購自美國Sigma公司。佛波酯(TPA)分子式：C36H56O8，分子量：616.83，含量≥99%，產(chǎn)品編號P1585。購自美國Sigma公司。丙酮分子式：C3H6O，分子量：58.08，含量：≥99.0%，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒：產(chǎn)品編號: C0105，購自碧云天生物技術(shù)有限公司。其余試劑為市售分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及處理

50只BALB/c雌性小鼠，每組10只，計(jì)算機(jī)隨機(jī)分為5組。正常對照組：背部皮膚用1 mL注射器每周2次涂抹丙酮溶液，每次100 μL；1號模型組：背部脫毛處理后，第1周涂1次(星期一)DMBA/丙酮液100 μg/100 μL，從第2周開始每周涂兩次TPA/丙酮液，每次4 μg/100 μL。2號模型組：背部脫毛處理后，第1周涂兩次(星期一、四，即隔3 d涂1次)DMBA/丙酮液100 μg/100 μL，從第2周開始每周涂兩次TPA/丙酮液4 μg/100 μL。3號模型組：背部脫毛處理后，第1周涂4次(星期一、三、五、七，即隔2 d涂1次)DMBA/丙酮液100 μg/100 μL，從第2周開始每周涂兩次TPA/丙酮液4 μg/100 μL。4號模型組：背部脫毛處理后，第1周每天涂1次DMBA/丙酮液100 μg/100 μL，從第2周開始每周涂兩次TPA/丙酮液4 μg/100 μL。

所有小鼠每周背部脫毛1次。各組小鼠經(jīng)上述處理后均繼續(xù)觀察至12周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。所有小鼠異戊巴比妥鈉麻醉后使用頸椎脫臼法處死。

1.3.2 一般觀察

每天觀察小鼠皮膚的改變及腫瘤生長情況；每周測量并記錄小鼠體重及背部腫瘤的數(shù)量和瘤體直徑，在鼠體平面示意圖上標(biāo)明部位，并拍照記錄。腫瘤直徑大于1 mm視為陽性。按體積計(jì)算方式(1)進(jìn)行：

(1)

其中：A為腫瘤最大直徑，B為垂直于A的直徑。

描繪時間一平均荷瘤數(shù)動態(tài)變化曲線。腫瘤發(fā)生率=各組荷瘤動物數(shù)/該組存活動物數(shù) × 100%；每鼠平均荷瘤數(shù)=各組小鼠乳頭狀瘤發(fā)生總數(shù)/該組存活小鼠數(shù)。

死亡小鼠為處理誘癌實(shí)驗(yàn)開始后非處死計(jì)劃內(nèi)死亡的小鼠，注意記錄其死亡時間及數(shù)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算小鼠死亡率。死亡小鼠經(jīng)解剖觀察其肝、肺及腸道等器官，了解其死亡原因，必要時行病理檢查，明確死因。

1.3.3 腫瘤組織病理學(xué)染色

取背部荷瘤組織和非荷瘤組織各1 cm × 1 cm大小，迅速放入4%多聚甲醛中固定后常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)石蠟切片，厚度3 μm。腫瘤組織染色采用HE染色法。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。采用兩因素析因設(shè)計(jì)定量資料的方差分析，組間分析采用兩兩比較的方法進(jìn)行。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

第1周對小鼠進(jìn)行不同頻率的皮膚癌誘發(fā)劑DMBA的涂抹后，第2周繼續(xù)進(jìn)行TPA涂抹時，3號、4號模型組涂藥處出現(xiàn)了明顯的毛發(fā)脫落，皮膚表層潰爛，皮下組織暴露、皺褶，繼而流膿結(jié)痂(圖1B)，3號模型組在第5周時涂藥處結(jié)痂并逐漸脫落，但皮膚仍觸摸略硬，第6周時基本恢復(fù)，與空白對照組小鼠背部皮膚無明顯差異(圖1A)。4號模型組在第3周時全部死亡，涂藥處皮膚發(fā)黑，經(jīng)鑒定應(yīng)為皮膚遭到過度損傷后感染引發(fā)炎癥，最終死亡。1號、2號模型組小鼠皮膚始終正常，無明顯皮膚損傷現(xiàn)象。2、3號模型組在第4周開始出現(xiàn)肉眼可見腫瘤，而1號模型組于第7周開始成瘤(圖1C)。

2.2 體重、腫瘤指標(biāo)

經(jīng)12周實(shí)驗(yàn)，模型組小鼠的體重變化率均低于空白對照組，3號模型組與空白對照組差異有顯著性，而4號模型組由于DMBA劑量過大導(dǎo)致小鼠在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)全部死亡(表1)。

本方法成瘤結(jié)果見表2，1個月后1號模型組腫瘤發(fā)生率為零，而2號模型組的腫瘤發(fā)生率略高于3號模型組，3個月后，2號模型組的腫瘤發(fā)生率最高，其次是3號模型組、1號模型組。這說明兩步化學(xué)誘導(dǎo)法可成功誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，但1周涂1次DMBA的1號模型組腫瘤發(fā)生比較晚，且部分小鼠直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束也未能成瘤。1周涂4次DMBA的3號模型組雖然皮膚受到損傷，但仍有腫瘤的發(fā)生，但腫瘤發(fā)生率低于1周涂兩次DMBA的2號模型組。

由時間—平均荷瘤數(shù)動態(tài)變化曲線(圖2)也可直觀地看出，1號模型組成瘤時間明顯晚于2號、3號模型組，2號、3號模型組成瘤時間相似，但3號模型組的成瘤率又明顯低于2號模型組，這證明2號模型組無論是在成瘤時間還是成瘤數(shù)量上都明顯優(yōu)于其他，這與之前的結(jié)論是相一致的。

表1 小鼠體重變化

注：與空白對照組比較，**為P<0.01

Note. Compared with the control group:**P<0.01.

表2 小鼠背部腫瘤組織生長情況

注：A. 正常皮膚；B. 皮膚流膿結(jié)痂；C. 皮膚成瘤。圖1 小鼠皮膚一般觀察Note. (A) Healthy skin. (B) Suppuration and eschar in the skin. (C) Skin tumors.Fig.1 Gross appearance of the mouse skin

注：A. 皮膚腫瘤；B. 正常皮膚。 圖3 小鼠皮膚組織鏡下觀察 (HE染色，×4)Fig.3 Histology of the mouse skin. (A) Skin tumor. (B) Heathy skin. HE staining，×4

圖2 對照組和模型組小鼠時間-平均荷瘤數(shù)動態(tài)變化曲線Fig.2 The dynamic growth curve of time-tumor number in the control and model groups

2.3 病理學(xué)檢測

誘導(dǎo)性腫瘤的發(fā)展過程主要分為乳頭狀瘤1, 2, 3期，微浸潤性鱗狀細(xì)胞癌1， 2, 3期及完全浸潤鱗狀細(xì)胞癌。經(jīng)12周誘導(dǎo)后處死小鼠，取背部荷瘤組織及瘤旁組織進(jìn)行HE染色發(fā)現(xiàn)，所誘導(dǎo)腫瘤基本都處于乳頭狀瘤3期(圖3)。

3 討論

皮膚癌是皮膚惡性腫瘤的統(tǒng)稱，各國皮膚癌發(fā)病率差異較大，其中白色人種發(fā)病率較高，如新西蘭就是其中之一。在我國以沿海地區(qū)及高山地區(qū)較多見。近年來，因臭氧層破壞加重，造成全球范圍內(nèi)皮膚癌發(fā)病率逐年上升，并呈年輕化趨勢。因此，皮膚癌防治已成為皮膚病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[4]。

小鼠皮膚癌模型是最為簡便的小鼠腫瘤模型，而化學(xué)誘導(dǎo)法也最為接近日常致癌劑的接觸而導(dǎo)致癌癥發(fā)生的過程，因此小鼠化學(xué)誘導(dǎo)法皮膚癌腫瘤模型是研究一些抗腫瘤藥物藥效的最為常用的一種腫瘤模型[5]。DMBA/TPA模型模擬的是鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生，該模型用DMBA作為啟動劑，在致癌基因Ha-ras的第61個密碼子上使A突變成T，造成不可逆轉(zhuǎn)的特異性突變，用于皮膚癌的初始化。TPA作為促癌劑，促進(jìn)腫瘤的生長[6,7]。兩步法誘導(dǎo)產(chǎn)生的大多是乳頭狀瘤，本次實(shí)驗(yàn)的病理檢測結(jié)果也表明所誘導(dǎo)腫瘤基本都處于誘導(dǎo)性腫瘤分期中的乳頭狀瘤3期。

本實(shí)驗(yàn)針對兩步化學(xué)誘導(dǎo)皮膚癌造模方法進(jìn)行了優(yōu)化，采用遺傳背景單一的BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DMBA對BALB/c小鼠的皮膚有顯著地刺激作用，并且DMBA的涂藥劑量對成瘤質(zhì)量、成瘤時間、小鼠荷瘤數(shù)等有重要影響。第1周涂DMBA 1次，2次，4次均可以誘導(dǎo)成瘤，但涂7次可以使BALB/c小鼠皮膚潰爛致死。其中第1周涂DMBA兩次對小鼠皮膚影響不大，且1個月即可成瘤，成瘤時間短，腫瘤發(fā)生率高。該皮膚癌優(yōu)化模型造模時間短，成瘤率高，個體間差異小，實(shí)用性強(qiáng)，對需要皮膚癌小鼠模型的實(shí)驗(yàn)有重要的參考價值，對臨床防治皮膚癌的研究也具有重要應(yīng)用意義。

[1] 饒子亮，黃威，鄭佳琳，等．兩種人乳腺癌裸鼠移植模型的建立 [J]．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(5): 5-8．

[2] 王紅麗，陳苑，胡銀霞，等. 皮膚光損傷腫瘤模型的建立 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2013，23(9): 49-51.

[3] Aldaz CM, Conti CJ, Chen A, et al．Promoter independence as a feature of most skin papillomas in SENCAR mice [J]. Cancer Res. 51(3): 1045-1050.

[4] Abel EL，Angel JS，Kiguehi K，et al. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin：Fundamentals and applications [J]．Nat Protoc，2009，4(9): 1350-1362．

[5] Ishikawai T，Kumar IP，Machado HB，et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis [J]．Mol Oncol，2010，4(2): 119-125.

[6] Carver BS, Pandolfi PP．Mouse modeling in oncologic preetinical and translational research [J]．Clin Cancer Res，2006，12(18): 5305-5311．

[7] Kemp CJ. Multistep skin cancer in mice as a model to study the evolution of cancer cells [J]. Semin Cancer Biol, 2005, 15: 460-473.

Optimization of the establishment protocol of a mouse model of

MBA/TPA-induced skin cancer

(1. School of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China; Key Laboratory of Marine Drugs, Ministry of Education; Qingdao 266003, China; 2. Basic Teaching Department of Qingdao Huanghai University, Qingdao 266427)

Objective To induce skin cancer in BALB/c mice using DMBA as initiator and TPA as tumor promoter. Through optimizing the doses and frequencies of DMBA administration to establish a stable skin cancer model with less time and causing less skin damage. Methods Shaving the back of mice to expose a piece of skin around 2 cm × 2 cm. The mice were divided into a blank control group and four treatment groups randomly. These four groups were given 1, 2, 4, 7 times 100 μg/100 μL DMBA/acetone, respectively, in the first week, and twice 4 μg/100 μL TPA/acetone per week in the next 11 weeks. The body weight changes, time of tumor formation and number of tumors formed were recorded during the experiment. The mice were sacrificed at 12th week and samples of tumor tissue and adjacent normal skin tissue were taken for pathological examination using HE staining. Results Tumors were observed at the 7th week in the group with once DMBA administration in the first week and at the 4th week in the group with twice DMBA administration in the first week. Skin cancers were formed also in the group with 4-time DMBA administration in the first week, however, with significantly more severe skin damages. The mice receiving DMBA everyday in the first week died at the 3th week. Conclusions The best induction protocol for skin cancer in BALB/c mice should be twice DMBA in the first week followed by twice TPA in the next few weeks. This protocol has the advantages of easy operation, short modeling time, high cancer formation rate, and presents a similar process of human skin carcinogenesis, thus, it can be used as a useful animal model for skin cancer research.

Skin cancer; Multi-step tumorigenesis; Mice; DMBA; TPA

GU Yu-chao， E-mail: guych@126.com

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號81272264)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(201562028)。

孫佳惠(1993-)女，碩士研究生，研究方向：藥理學(xué)。Email: pharmacy_sjh@163.com

顧玉超(1981-)男，副教授，Email: guych@126.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 01-0031-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.01.006

2016-06-07