云南4個規(guī)模化豬場豬瘟抗體水平監(jiān)測及免疫效果分析

劉永波，宋春蓮，謝相悅，吳常月，王志方，凌萬旭，顏宏奎，張慶偉，舒相華*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2.乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠，鄭州，450000；3.昆明偉牧得生物科技有限公司，昆明，650201；4.山東省東營市黃河三角洲動物樂園管理有限責(zé)任公司，東營，257091）

云南4個規(guī)模化豬場豬瘟抗體水平監(jiān)測及免疫效果分析

劉永波1，宋春蓮1，謝相悅1，吳常月1，王志方2，凌萬旭3，顏宏奎3，張慶偉4，舒相華1*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2.乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠，鄭州，450000；3.昆明偉牧得生物科技有限公司，昆明，650201；4.山東省東營市黃河三角洲動物樂園管理有限責(zé)任公司，東營，257091）

為檢測云南省某地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場豬瘟病毒抗體水平及免疫效果分析，通過監(jiān)測整體豬瘟抗體水平來制定有效的免疫程序，并對抗體效價不合格的豬只及時補種疫苗，對豬瘟的防控有重大意義。本試驗應(yīng)用豬瘟正向間接血凝試驗，檢測了云南省某地區(qū)4個規(guī)模化豬場283份血清的豬瘟抗體水平。結(jié)果表明，豬瘟血清抗體水平≧1∶8的有74份，免疫合格率為73.9%。哺乳仔豬檢測65份，豬瘟血清抗體水平≧1∶8的有22份，免疫合格率為66.2%。斷奶仔豬檢測74份，豬瘟血清抗體水平≧1∶8的有28份，免疫合格率為62.1%。育肥豬檢測75份，豬瘟血清抗體水平≧1∶8的有21份，免疫合格率為72%。母豬檢測69份，豬瘟血清抗體水平≧1∶8的有3份，免疫合格率為95.6%。所有豬群中斷奶仔豬免疫合格率最低，與臨床上斷奶仔豬豬瘟發(fā)病率較高相吻合。

豬瘟;抗體監(jiān)測;免疫

豬瘟，又稱古典豬瘟，是由豬瘟病毒引起豬的一種急性、發(fā)熱性、高度接觸性傳染病，以發(fā)病急、高熱稽留和毛細(xì)血管壁變性引起廣泛出血、梗塞和壞死等變化為特征，其流行廣泛，發(fā)病率和死亡率高，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大，因此備受世界各國關(guān)注，國際獸醫(yī)局也將其列入一類法定傳染病，并規(guī)定為國際重點檢疫對象[1]。近年來隨著養(yǎng)豬規(guī)模的擴大，飼養(yǎng)管理水平的參差不齊，豬瘟在各地的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，臨床表現(xiàn)以影響繁殖性能和隱形帶毒為主[2]，并伴隨其他繼發(fā)感染病，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大的損失。注射豬瘟疫苗以提高群體抗體水平是預(yù)防豬瘟發(fā)生的有效辦法[3]。但目前在疫苗免疫接種上普遍存在一個很大的誤區(qū)，即僅僅注重免疫密度，卻忽視了免疫接種的質(zhì)量[4]。免疫監(jiān)測可為被檢豬群是否需要繼續(xù)免疫注射提供依據(jù)，是提高豬群群體免疫質(zhì)量的關(guān)鍵。

本實驗將豬瘟抗原吸附在紅細(xì)胞上制成紅細(xì)胞致敏抗原，加入倍比稀釋的待檢血清，如紅細(xì)胞發(fā)生凝集，說明待檢血清中有相應(yīng)抗體與其結(jié)合，由此可推斷待檢豬體內(nèi)有抗豬瘟病毒抗體，再根據(jù)發(fā)生凝集孔的稀釋度數(shù)判斷待檢豬體內(nèi)的抗體水平。

1 材料與方法

材料來源：血清：樣品血清采自云南省某地區(qū)4個規(guī)?；i場（四個養(yǎng)豬場編號為I、II、III、IV，四個豬場所采血樣豬只均于三個月內(nèi)免疫），共283頭份，其中哺乳仔豬65頭份，斷奶仔豬74頭份，育肥豬75頭份，母豬69頭份。血液采集后3000轉(zhuǎn)10min離心，取上清液備用。

1.1 試劑及儀器

試劑：豬瘟間接血凝抗原，豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清，稀釋液，購自蘭州獸醫(yī)研究所。待檢血清。

儀器：96孔V型血凝板，購自蘭州獸醫(yī)研究所。一次性透明醫(yī)用手套，25、50微升微量移液器（17965，5～40μL：X15105，15～40μL：X18493，40～200μL：8排管E89364，5～50μL，芬蘭)，微量移液器槍頭，振蕩器，水浴鍋，恒溫箱，濕盒，無菌青霉素小瓶（用于分裝稀釋液和抗原液）。

1.2 方法與步驟

1.2.1 加稀釋液

96孔V型血凝板1-6排：用于檢測待檢血清，每排檢測一個樣品。每排1-10孔每孔加50微升稀釋液。

96孔V型血凝板第7排：1-3孔為陰性血清對照，5、6孔為稀釋液對照。1-3孔及5、6孔每孔加50微升稀釋液。

96孔V型血凝板第8排：陽性血清對照。1-12孔每孔加50微升稀釋液。

1.2.2 稀釋待檢血清

1號待檢血清：取50微升加入第1排第1孔，混合稀釋取50微升移致下一孔作倍比稀釋，致第10孔棄50微升。

2號待檢血清：取50微升加入第2排第1孔，同上。

1-10孔待檢血清稀釋梯度：1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1：1024

1.2.3 陰性對照血清的稀釋

取陰性血清50微升加入第7排第1孔，倍比稀釋，致第3孔棄50微升。陰性血清稀釋度：1∶2，1∶4，1∶8。5、6孔為稀釋液對照（只有稀釋液）。

1.2.4 陽性血清的稀釋

取陽性血清50微升加入第8排第1孔，倍比稀釋，致第12孔棄50微升。陽血清稀釋度：1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，......1∶4096。

1.2.5 加血凝抗原

被檢血清各孔、陰性血清各孔、陽性血清各孔、稀釋液對照孔均各加25豬間接血凝抗原（充分搖勻，瓶底應(yīng)無血球沉淀）。

1.2.6 振蕩混勻

將血凝板置于微量振蕩器上,振蕩1-2min。

1.2.7 反應(yīng)

蓋上玻板，室溫下或37℃下靜置1.5-2小時判定結(jié)果，或延至翌日判定。

1.3 結(jié)果判定

以呈現(xiàn)“++”血凝反應(yīng)的血清最高稀釋度作為該血清的間接血凝抗體效價。血凝反應(yīng)強度表示如下：

“++++”紅細(xì)胞全部凝集，形成一層均勻膜，布滿整個孔底。

“+++”紅細(xì)胞在孔底形成一層薄膜，面積比前者略小。

“++”紅細(xì)胞在孔底形成薄膜凝集，邊緣松散或呈鋸齒狀。

“+”紅細(xì)胞沉于孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圓點。

“±”紅細(xì)胞沉于孔底，但周圍不光滑或中心有空斑。

“-”紅細(xì)胞完全沉于孔底，呈光滑的圓點。

當(dāng)陽性血清抗體效價≥1：256、陰性血清≤1：8、稀釋液對照孔無自凝現(xiàn)象時，實驗成立。接種豬瘟疫苗的豬群免疫抗體效價≤1：16為免疫合格。

2 結(jié)果

2.1 各豬場豬瘟病毒抗體檢測結(jié)果I、II、III、IV四個豬場哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬和母豬豬瘟血清抗體水平測定結(jié)果見表1。

2.2 不同年齡段豬群豬瘟病毒抗體檢測結(jié)果哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬和母豬豬瘟血清抗體水平比較

表14 個規(guī)模化養(yǎng)豬場豬瘟血清抗體檢測結(jié)果

圖1 不同年齡段豬群豬瘟病毒抗體檢測結(jié)果

2.3 豬瘟血清抗體效價水平分布共檢測豬瘟抗體283份，免疫總合格率為73.9%，其中血清抗體水平≥1∶8的有74頭份。結(jié)果見表2。

表2 檢測豬血清豬瘟抗體效價分布

3 討論

3.1 隨著養(yǎng)豬規(guī)模的擴大及豬群的轉(zhuǎn)移，不少豬場因豬瘟的發(fā)生造成了重大的經(jīng)濟損失。發(fā)病豬群豬瘟血清抗體水平低下，不能保護豬群免受豬瘟強毒感染是關(guān)鍵所在。一般認(rèn)為，豬瘟抗體效價≦1∶8才能夠抵抗強毒感染[5]。本次調(diào)查結(jié)果顯示：在283份血清中，效價≧1∶8的有74份，免疫合格率為73.9%。高于何啟蓋等[6]的調(diào)查結(jié)果，總免疫合格率只有55.84%，但豬群免疫不合格的比例達(dá)26.1%，存在感染強毒的可能。

3.2 I豬場、II豬場、III豬場和IV豬場分別檢測72、75、66、70頭份，豬瘟病毒抗體效價總合格率分別為66.7%、64%、90.9%和75.7%。檢測結(jié)果顯示III豬場豬瘟免疫保護率最高，II豬場豬瘟免疫保護率最低。

3.3 不同年齡段的豬群豬瘟血清抗體水平差異較大。哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬和母豬血清抗體水平免疫合格率分別為66.2%、62.1%、72%和95.6%。4個豬場均為母豬的免疫效果比較好，斷奶仔豬最低，建議在斷奶前對哺乳仔豬進行豬瘟首免。

3.4 豬場普遍存在免疫率不高，其原因可能有以下幾種：(1)免疫機能差，注射疫苗后產(chǎn)生抗體的效果不理想；(2)注射疫苗時注射分量不夠，存在打“飛針”現(xiàn)象[7]；(3)疫苗質(zhì)量問題；(4)豬瘟持續(xù)感染種豬，易引起免疫耐受，導(dǎo)致免疫失敗[8]；(5)豬免疫抑制病的普遍存在也是造成豬瘟抗體水平低下的一個很重要的原因，如豬繁殖與呼吸道疾病綜合征。另外，已經(jīng)證實斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征病毒損害淋巴組織，引起廣泛的淋巴細(xì)胞減失，導(dǎo)致并發(fā)或繼發(fā)感染，可引起免疫抑制[9]。

3.5 建議這四個規(guī)模化豬場進行豬瘟免疫時應(yīng)加強以下幾個方面的工作：(1)檢測是否存在免疫抑制性疾病，如豬繁殖與呼吸道疾病綜合癥、豬圓環(huán)2型等疾病，淘汰存在免疫抑制性疾病的豬；(2)免疫功能低下的豬隔離觀察，特別是多次免疫仍達(dá)不到免疫要求的種母豬，可借鑒湯薇等[10]對低抗體水平母豬的淘汰方法；(3)注射疫苗時注射部位要準(zhǔn)確，注射用針頭型號應(yīng)視豬而定，大豬用粗長針頭，小豬用短細(xì)針頭，要確保將疫苗注射在肌肉層內(nèi)，防止疫苗滲漏；(4)購買質(zhì)量好的豬瘟疫苗；(5)將疫苗接種與免疫監(jiān)測有機結(jié)合，以免疫監(jiān)測結(jié)果為依據(jù)制定合理的免疫程序[11]，達(dá)到最佳免疫效果。

[1]Romelt,M.(Roemelt,Maria),Klingelhofer,I(Klingelhoefer Irene).Classical Swine Fever in wild boar in Rhineland-Palatinate∶evaluation ofthe official control measures from2005-2011.［J］.2015：507-516.

[2]陳志明.規(guī)?；i場豬瘟流行現(xiàn)狀與防控思路［J］. 2014,(6)∶66-68.

[3]寧宜寶，吳文福等.我國豬瘟流行新特點與疫苗免疫研究［J］2011，45(8)∶33-37.

[4]孫華偉,趙永前,茅愛華,蔣晨慧,張敬峰等.某規(guī)模豬場豬瘟抗體水平的跟蹤監(jiān)測與應(yīng)用.［J］2014(6)∶91-92.

[5]陳煥春,吳斌,何啟蓋,等.規(guī)?；i場疫病控制與凈化[M].北京∶中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.137-143

[6]何啟蓋,陳煥春,吳斌,等.規(guī)?；i場豬瘟、細(xì)小病毒、口蹄疫抗體水平監(jiān)測效果分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2000，22(1)∶5-9.

[7]陳浩波，鄭如膠.免疫失敗的原因分析及相應(yīng)對策［J］．廣西農(nóng)學(xué)報，2009，24（1）：50-52．

[8]王琴，寧宜寶.豬瘟免疫失敗主要原因的解析［J］．中國獸醫(yī)雜志，2005，41（6）：61-63．

[9]蔡寶祥.圓環(huán)病毒∶對畜禽免疫抑制的威脅.中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第五屆全國會員代表大會及第9次學(xué)術(shù)研討會論文集[C].煙臺，2001.14-18.

[10]湯薇，王永明，高林.集約化養(yǎng)豬場對隱性感染豬瘟的檢測與防制［J］．養(yǎng)豬，2000（2）：35-36．

[11]楊艷芹，樊福好.豬健康性能監(jiān)測與檢測數(shù)據(jù)的分析利用［J］．今日養(yǎng)豬，2006（6）：12-14．

S815.4

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1003-8655（2017）01-0084-03

劉永波（1989-），河南人，男，在讀碩士研究生，研究方向為動物疫病防控及中藥免疫學(xué)，757259269@qq.com.

舒相華（1973-），云南騰沖人，男，副教授，博士，研究方向為動物疫病防控及飼料毒物學(xué)，1633992175@qq.com.