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    寬筋藤多糖的提取純化

    2014-09-22 11:32:50王庶文慧姚晶盧永昌
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年10期
    關(guān)鍵詞:多糖蛋白質(zhì)

    王庶+文慧+姚晶+盧永昌

    摘要:對(duì)寬筋藤(Tinospora sinensis)多糖進(jìn)行提取純化研究,采用正交試驗(yàn)確定了影響寬筋藤多糖的提取因素主次順序?yàn)樘崛囟?、提取時(shí)間、料液比,即在提取溫度為90 ℃,提取90 min,料液比1∶10(m/V, g∶mL)的條件下提取,寬筋藤粗多糖提取率為3.94%,其中還原性多糖含量為20.40%,蛋白質(zhì)含量為8.21%;去除蛋白質(zhì)的方法中TCA法最適宜寬筋藤粗多糖的純化,能去除86.83%的蛋白質(zhì),還原性多糖保留率為68.67%。

    關(guān)鍵詞:寬筋藤(Tinospora sinensis);多糖;蛋白質(zhì);TCA法

    中圖分類號(hào):R284.2;O657.32文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2014)10-2389-03

    Extraction and Purification of Tinospora sinensis Polysaccharide

    WANG Shu,WEN Hui,YAO Jing,LU Yong-chang

    (College of Chemistry and Life Sciences,Qinghai University for Nationalities,Xining 810007,China)

    Abstract: To study the extraction and purification of the polysaccharide from Tinospora sinensis,the extraction temperature, extraction timeand solid-liquid ratio was determined by phenol-sulfuric acid method. The optimal conditions were temperature 90 ℃, extracting 90 min twice with solid-liquid ratio 1∶10. The extraction rate of polysaccharide from Tinospora sinensis was 3.94%. The content of polysaccharide was 20.40%. The content of protein was 8.21%. The removal rate of protein was 86.83% and the retention rate of polysaccharide was 68.67% by TCA method.

    Key words: Tinospora sinensis; polysaccharides; protein; TCA method

    基金項(xiàng)目:青海省科技廳國(guó)際交流項(xiàng)目(2012-H-811)

    寬筋藤(Tinospora sinensis)為防己科青牛膽屬植物中華青牛膽(Tinospora sinensis)的莖,是藏藥中的常用藥材。藏藥藥典《晶珠本草》中記載,其功效為清除隆熱癥[1,2]。多糖是構(gòu)成生命的基本物質(zhì)之一,近年來(lái)大量研究表明,植物多糖具有提高機(jī)體免疫功能,抗腫瘤,抗病毒,抗凝血,抗衰老等作用[3-10]。目前關(guān)于寬筋藤多糖的提取純化研究鮮見(jiàn)報(bào)道,本研究通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)探討了寬筋藤多糖的最佳提取條件,比較了Sevag法、TCA法,TCA-正丁醇法等對(duì)寬筋藤粗多糖中蛋白質(zhì)的去除效果,為寬筋藤多糖的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用打好基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1儀器、試劑與材料

    T6型新銳可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器);KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);SHBIII型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司),EYELA-N1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)明儀器有限公司),TD3型低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

    葡萄糖,牛血清白蛋白,苯酚,硫酸,考馬斯亮藍(lán)G,磷酸,無(wú)水乙醇,氯化鈉,三氯乙酸,正丁醇,氯仿均為分析純。

    寬筋藤于2012年9月采自青海省互助北山,經(jīng)青海民族大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院毛繼祖教授鑒定為藏藥寬筋藤。

    1.2方法

    1.2.1比色法測(cè)定還原性多糖及蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

    1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。精確稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.100 0 g定容至100 mL容量瓶中,得1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,從中準(zhǔn)確移取10 mL定容至100 mL,得0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)操作液。

    精密稱取0.100 0 g牛血清白蛋白,用0.15 mol/L NaCl溶液定容至100 mL容量瓶中,得1 mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,從中準(zhǔn)確移取10 mL定容至100 mL,得0.1 mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)操作液。

    2)還原性多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。采用苯酚-硫酸法,分別移取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)操作液置于10 mL容量瓶中并用去離子水補(bǔ)充至1 mL,加入2 mL 5%苯酚溶液,用98%濃硫酸定容至10 mL,搖勻,沸水浴加熱20 min后冷卻至室溫。以0 mL空白對(duì)照作為參比溶液,用1 cm比色皿在490 nm處測(cè)定吸光度A,以吸光度A為縱坐標(biāo),葡萄糖濃度c為橫坐標(biāo),得到回歸方程為Y(A)=0.009+6.002X(c),R2=0.998 4。結(jié)果表明,葡萄糖在0.01~0.10 mg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

    3)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。采用考馬斯亮藍(lán)法,分別移取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)操作液置于10 mL容量瓶中并用0.15 mol/L NaCl溶液補(bǔ)充至1 mL,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液(稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)溶于50 mL 95%乙醇中,加入100 mL 85%磷酸,用去離子水定容至1 L),靜置10 min。以0 mL空白對(duì)照作為參比溶液,用1 cm比色皿,在595 nm處測(cè)定吸光度A,以吸光度A為縱坐標(biāo),蛋白質(zhì)濃度c為橫坐標(biāo),得到回歸方程為Y(A)=0.002+6.084X(c),R2=0.995 3。結(jié)果表明,蛋白質(zhì)在0.01~0.10 mg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

    1.2.2寬筋藤多糖的提取及含量測(cè)定準(zhǔn)確稱取10.00 g寬筋藤粉末,用100 mL石油醚超聲脫脂2次,過(guò)濾,加入100 mL去離子水在90 ℃下熱回流提取90 min,提取兩次,過(guò)濾,合并兩次濾液并濃縮至30 mL,加入70 mL無(wú)水乙醇,靜置8 h,過(guò)濾得寬筋藤粗多糖。粗多糖提取率按公式(1)計(jì)算。

    粗多糖提取率=×100%(1)

    其中,m1為過(guò)濾所得粗多糖質(zhì)量,m2為取用寬筋藤藥材質(zhì)量。

    將寬筋藤粗多糖重新溶解并定容至250 mL,移取0.10 mL置于10 mL容量瓶中并用去離子水補(bǔ)充至1 mL,加入2 mL 5%苯酚溶液,用98%濃硫酸定容至10 mL。以空白對(duì)照為參比溶液,用1 cm比色皿在490 nm處測(cè)定吸光度A。寬筋藤還原性多糖含量按公式(2)計(jì)算。

    寬筋藤還原性多糖含量=(2)

    其中,A1為吸光度,V1為稀釋體積。

    移取上述0.50 mL寬筋藤粗多糖溶液液置于10 mL容量瓶中并用0.15 mol/L NaCl溶液補(bǔ)充至1 mL,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液靜置10 min。以0 mL空白對(duì)照作為參比溶液,用1 cm比色皿,在595 nm處測(cè)定吸光度A2。寬筋藤蛋白質(zhì)含量按公式(3)計(jì)算。

    寬筋藤蛋白質(zhì)含量= (3)

    其中,A2為吸光度,V2為稀釋體積。

    1.2.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇提取溫度,提取時(shí)間,料液比作為考察因素,各因素下設(shè)3個(gè)水平(表1),按L9(34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),以還原性多糖質(zhì)量作為標(biāo)準(zhǔn)確定最佳提取條件。

    1.2.4Sevag法等對(duì)寬筋藤粗多糖中蛋白質(zhì)的去除

    1)稱取0.203 4 g寬筋藤粗多糖粉末定容至200 mL容量瓶中,測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

    2)Sevag法去除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL氯仿、1 mL正丁醇混合液進(jìn)行萃取操作,分液,重復(fù)6次,將水相濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中,測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

    3)TCA法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入25 mL 10%三氯乙酸溶液,靜置一夜,離心去除沉淀,將溶液濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中,測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

    4)TCA-正丁醇法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL 10%三氯乙酸溶液、20 mL正丁醇混合液進(jìn)行萃取操作,分液,將水相濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中,測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

    蛋白質(zhì)去除率=×100%

    其中,m1為寬筋藤粗多糖中總蛋白質(zhì)的質(zhì)量,m2為去除蛋白質(zhì)后寬筋藤粗多糖中蛋白質(zhì)的質(zhì)量。

    還原性多糖保留率=×100%

    其中,m3為寬筋藤粗多糖中還原性多糖的質(zhì)量,m4為去除蛋白質(zhì)后寬筋藤粗多糖中還原性多糖的質(zhì)量。

    2結(jié)果與分析

    2.1寬筋藤多糖的最佳提取條件

    正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知各因素對(duì)多糖提取率的影響依次為提取溫度、提取時(shí)間、料液比(m/V,g:mL)。最佳提取組合為A3B3C2,即提取溫度90 ℃、提取時(shí)間90 min、料液比1∶10,此條件下寬筋藤粗多糖提取率為3.94%,其中還原性多糖含量為20.40%,蛋白質(zhì)含量為8.21%。

    2.2Sevag法等對(duì)寬筋藤多糖中蛋白質(zhì)的去除效果

    未除去蛋白質(zhì)的寬筋藤粗多糖溶液中還原性多糖含量為20.40%,蛋白質(zhì)含量為8.21%。Sevag法處理寬筋藤粗多糖溶液6次后,蛋白質(zhì)去除率為43.11%,還原性多糖保留率為83.86%;TCA法處理寬筋藤粗多糖溶液后,蛋白質(zhì)去除率為86.83%,還原性多糖保留率為68.67%;TCA-正丁醇法處理寬筋藤粗多糖溶液后,蛋白質(zhì)去除率為56.29%,還原性多糖保留率為65.06%。試驗(yàn)結(jié)果表明,TCA-正丁醇法去除蛋白質(zhì)效果較差,多糖保留率也較低。Sevag法雖多糖保留較多,但去除蛋白質(zhì)效果較差,且操作繁瑣。TCA法能有效去除寬筋藤粗多糖中的蛋白質(zhì),相對(duì)多的保留多糖組分,操作簡(jiǎn)單。

    3小結(jié)

    試驗(yàn)確定了寬筋藤多糖的最優(yōu)提取條件,即提取溫度90 ℃、提取時(shí)間90 min、料液比1∶10,此條件下寬筋藤粗多糖的提取率為3.94%,其中還原性多糖含量為20.40%,蛋白質(zhì)含量為8.21%。去除蛋白質(zhì)的方法中TCA法最適宜寬筋藤粗多糖的純化,能去除86.83%的蛋白質(zhì),還原性多糖保留率68.67%。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 帝瑪爾·丹增彭措.晶珠本草[M].毛繼祖,譯.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2012.329.

    [2] 鐘 文,翟 瑤,盧永昌.藏藥寬筋藤中總黃酮和蘆丁含量的測(cè)定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,52(9):2151-2152,2170.

    [3] 孫文平.三種藥用植物類水溶性多糖對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用及其規(guī)律的研究[D].遼寧大連:大連醫(yī)科大學(xué),2006.

    [4] ZHU X L, CHEN A F, LIN Z B. Ganoderma lucidum polysaccharides enhance the function of immunological effector cells in immunosuppressed mice[J]. Journal of Ethnopharmacology,2007,111(2):219-226.

    [5] 趙俊霞.刺五加多糖對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的抑制作用及免疫調(diào)節(jié)作用研究[D].石家莊:河北醫(yī)科大學(xué),2008.

    [6] CHEN H,QI X D.Study on the effect of polysaccharides from solanum nigrum linne on cellular immune function in tumour-bearing mice[J].Afr J TraditComplement Altern Med,2013,10 (4):41-46.

    [7] 張紅英.3種植物多糖抗豬藍(lán)耳病病毒及免疫增強(qiáng)作用研究[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

    [8] 高秀妹.四種植物多糖抑菌抗病毒作用及其對(duì)波氏桿菌免疫增強(qiáng)作用的比較研究[D].山東泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

    [9] 馮以明.四種綠藻多糖的提取分離及其結(jié)構(gòu)與抗凝活性研究[D].山東青島:中國(guó)海洋大學(xué),2012.

    [10] CAI W R,XIE L L,CHEN Y,et al.Purification,characterization and anticoagulant activity of the polysaccharides from green tea[J].Carbohydrate Polymers,2013,92(2):1086-1090.

    1.2.2寬筋藤多糖的提取及含量測(cè)定準(zhǔn)確稱取10.00 g寬筋藤粉末,用100 mL石油醚超聲脫脂2次,過(guò)濾,加入100 mL去離子水在90 ℃下熱回流提取90 min,提取兩次,過(guò)濾,合并兩次濾液并濃縮至30 mL,加入70 mL無(wú)水乙醇,靜置8 h,過(guò)濾得寬筋藤粗多糖。粗多糖提取率按公式(1)計(jì)算。

    粗多糖提取率=×100%(1)

    其中,m1為過(guò)濾所得粗多糖質(zhì)量,m2為取用寬筋藤藥材質(zhì)量。

    將寬筋藤粗多糖重新溶解并定容至250 mL,移取0.10 mL置于10 mL容量瓶中并用去離子水補(bǔ)充至1 mL,加入2 mL 5%苯酚溶液,用98%濃硫酸定容至10 mL。以空白對(duì)照為參比溶液,用1 cm比色皿在490 nm處測(cè)定吸光度A。寬筋藤還原性多糖含量按公式(2)計(jì)算。

    寬筋藤還原性多糖含量=(2)

    其中,A1為吸光度,V1為稀釋體積。

    移取上述0.50 mL寬筋藤粗多糖溶液液置于10 mL容量瓶中并用0.15 mol/L NaCl溶液補(bǔ)充至1 mL,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液靜置10 min。以0 mL空白對(duì)照作為參比溶液,用1 cm比色皿,在595 nm處測(cè)定吸光度A2。寬筋藤蛋白質(zhì)含量按公式(3)計(jì)算。

    寬筋藤蛋白質(zhì)含量= (3)

    其中,A2為吸光度,V2為稀釋體積。

    1.2.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇提取溫度,提取時(shí)間,料液比作為考察因素,各因素下設(shè)3個(gè)水平(表1),按L9(34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),以還原性多糖質(zhì)量作為標(biāo)準(zhǔn)確定最佳提取條件。

    1.2.4Sevag法等對(duì)寬筋藤粗多糖中蛋白質(zhì)的去除

    1)稱取0.203 4 g寬筋藤粗多糖粉末定容至200 mL容量瓶中,測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

    2)Sevag法去除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL氯仿、1 mL正丁醇混合液進(jìn)行萃取操作,分液,重復(fù)6次,將水相濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中,測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

    3)TCA法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入25 mL 10%三氯乙酸溶液,靜置一夜,離心去除沉淀,將溶液濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中,測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

    4)TCA-正丁醇法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL 10%三氯乙酸溶液、20 mL正丁醇混合液進(jìn)行萃取操作,分液,將水相濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中,測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

    蛋白質(zhì)去除率=×100%

    其中,m1為寬筋藤粗多糖中總蛋白質(zhì)的質(zhì)量,m2為去除蛋白質(zhì)后寬筋藤粗多糖中蛋白質(zhì)的質(zhì)量。

    還原性多糖保留率=×100%

    其中,m3為寬筋藤粗多糖中還原性多糖的質(zhì)量,m4為去除蛋白質(zhì)后寬筋藤粗多糖中還原性多糖的質(zhì)量。

    2結(jié)果與分析

    2.1寬筋藤多糖的最佳提取條件

    正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知各因素對(duì)多糖提取率的影響依次為提取溫度、提取時(shí)間、料液比(m/V,g:mL)。最佳提取組合為A3B3C2,即提取溫度90 ℃、提取時(shí)間90 min、料液比1∶10,此條件下寬筋藤粗多糖提取率為3.94%,其中還原性多糖含量為20.40%,蛋白質(zhì)含量為8.21%。

    2.2Sevag法等對(duì)寬筋藤多糖中蛋白質(zhì)的去除效果

    未除去蛋白質(zhì)的寬筋藤粗多糖溶液中還原性多糖含量為20.40%,蛋白質(zhì)含量為8.21%。Sevag法處理寬筋藤粗多糖溶液6次后,蛋白質(zhì)去除率為43.11%,還原性多糖保留率為83.86%;TCA法處理寬筋藤粗多糖溶液后,蛋白質(zhì)去除率為86.83%,還原性多糖保留率為68.67%;TCA-正丁醇法處理寬筋藤粗多糖溶液后,蛋白質(zhì)去除率為56.29%,還原性多糖保留率為65.06%。試驗(yàn)結(jié)果表明,TCA-正丁醇法去除蛋白質(zhì)效果較差,多糖保留率也較低。Sevag法雖多糖保留較多,但去除蛋白質(zhì)效果較差,且操作繁瑣。TCA法能有效去除寬筋藤粗多糖中的蛋白質(zhì),相對(duì)多的保留多糖組分,操作簡(jiǎn)單。

    3小結(jié)

    試驗(yàn)確定了寬筋藤多糖的最優(yōu)提取條件,即提取溫度90 ℃、提取時(shí)間90 min、料液比1∶10,此條件下寬筋藤粗多糖的提取率為3.94%,其中還原性多糖含量為20.40%,蛋白質(zhì)含量為8.21%。去除蛋白質(zhì)的方法中TCA法最適宜寬筋藤粗多糖的純化,能去除86.83%的蛋白質(zhì),還原性多糖保留率68.67%。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 帝瑪爾·丹增彭措.晶珠本草[M].毛繼祖,譯.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2012.329.

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    [3] 孫文平.三種藥用植物類水溶性多糖對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用及其規(guī)律的研究[D].遼寧大連:大連醫(yī)科大學(xué),2006.

    [4] ZHU X L, CHEN A F, LIN Z B. Ganoderma lucidum polysaccharides enhance the function of immunological effector cells in immunosuppressed mice[J]. Journal of Ethnopharmacology,2007,111(2):219-226.

    [5] 趙俊霞.刺五加多糖對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的抑制作用及免疫調(diào)節(jié)作用研究[D].石家莊:河北醫(yī)科大學(xué),2008.

    [6] CHEN H,QI X D.Study on the effect of polysaccharides from solanum nigrum linne on cellular immune function in tumour-bearing mice[J].Afr J TraditComplement Altern Med,2013,10 (4):41-46.

    [7] 張紅英.3種植物多糖抗豬藍(lán)耳病病毒及免疫增強(qiáng)作用研究[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

    [8] 高秀妹.四種植物多糖抑菌抗病毒作用及其對(duì)波氏桿菌免疫增強(qiáng)作用的比較研究[D].山東泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

    [9] 馮以明.四種綠藻多糖的提取分離及其結(jié)構(gòu)與抗凝活性研究[D].山東青島:中國(guó)海洋大學(xué),2012.

    [10] CAI W R,XIE L L,CHEN Y,et al.Purification,characterization and anticoagulant activity of the polysaccharides from green tea[J].Carbohydrate Polymers,2013,92(2):1086-1090.

    1.2.2寬筋藤多糖的提取及含量測(cè)定準(zhǔn)確稱取10.00 g寬筋藤粉末,用100 mL石油醚超聲脫脂2次,過(guò)濾,加入100 mL去離子水在90 ℃下熱回流提取90 min,提取兩次,過(guò)濾,合并兩次濾液并濃縮至30 mL,加入70 mL無(wú)水乙醇,靜置8 h,過(guò)濾得寬筋藤粗多糖。粗多糖提取率按公式(1)計(jì)算。

    粗多糖提取率=×100%(1)

    其中,m1為過(guò)濾所得粗多糖質(zhì)量,m2為取用寬筋藤藥材質(zhì)量。

    將寬筋藤粗多糖重新溶解并定容至250 mL,移取0.10 mL置于10 mL容量瓶中并用去離子水補(bǔ)充至1 mL,加入2 mL 5%苯酚溶液,用98%濃硫酸定容至10 mL。以空白對(duì)照為參比溶液,用1 cm比色皿在490 nm處測(cè)定吸光度A。寬筋藤還原性多糖含量按公式(2)計(jì)算。

    寬筋藤還原性多糖含量=(2)

    其中,A1為吸光度,V1為稀釋體積。

    移取上述0.50 mL寬筋藤粗多糖溶液液置于10 mL容量瓶中并用0.15 mol/L NaCl溶液補(bǔ)充至1 mL,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液靜置10 min。以0 mL空白對(duì)照作為參比溶液,用1 cm比色皿,在595 nm處測(cè)定吸光度A2。寬筋藤蛋白質(zhì)含量按公式(3)計(jì)算。

    寬筋藤蛋白質(zhì)含量= (3)

    其中,A2為吸光度,V2為稀釋體積。

    1.2.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇提取溫度,提取時(shí)間,料液比作為考察因素,各因素下設(shè)3個(gè)水平(表1),按L9(34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),以還原性多糖質(zhì)量作為標(biāo)準(zhǔn)確定最佳提取條件。

    1.2.4Sevag法等對(duì)寬筋藤粗多糖中蛋白質(zhì)的去除

    1)稱取0.203 4 g寬筋藤粗多糖粉末定容至200 mL容量瓶中,測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

    2)Sevag法去除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL氯仿、1 mL正丁醇混合液進(jìn)行萃取操作,分液,重復(fù)6次,將水相濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中,測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

    3)TCA法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入25 mL 10%三氯乙酸溶液,靜置一夜,離心去除沉淀,將溶液濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中,測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

    4)TCA-正丁醇法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL 10%三氯乙酸溶液、20 mL正丁醇混合液進(jìn)行萃取操作,分液,將水相濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中,測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

    蛋白質(zhì)去除率=×100%

    其中,m1為寬筋藤粗多糖中總蛋白質(zhì)的質(zhì)量,m2為去除蛋白質(zhì)后寬筋藤粗多糖中蛋白質(zhì)的質(zhì)量。

    還原性多糖保留率=×100%

    其中,m3為寬筋藤粗多糖中還原性多糖的質(zhì)量,m4為去除蛋白質(zhì)后寬筋藤粗多糖中還原性多糖的質(zhì)量。

    2結(jié)果與分析

    2.1寬筋藤多糖的最佳提取條件

    正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知各因素對(duì)多糖提取率的影響依次為提取溫度、提取時(shí)間、料液比(m/V,g:mL)。最佳提取組合為A3B3C2,即提取溫度90 ℃、提取時(shí)間90 min、料液比1∶10,此條件下寬筋藤粗多糖提取率為3.94%,其中還原性多糖含量為20.40%,蛋白質(zhì)含量為8.21%。

    2.2Sevag法等對(duì)寬筋藤多糖中蛋白質(zhì)的去除效果

    未除去蛋白質(zhì)的寬筋藤粗多糖溶液中還原性多糖含量為20.40%,蛋白質(zhì)含量為8.21%。Sevag法處理寬筋藤粗多糖溶液6次后,蛋白質(zhì)去除率為43.11%,還原性多糖保留率為83.86%;TCA法處理寬筋藤粗多糖溶液后,蛋白質(zhì)去除率為86.83%,還原性多糖保留率為68.67%;TCA-正丁醇法處理寬筋藤粗多糖溶液后,蛋白質(zhì)去除率為56.29%,還原性多糖保留率為65.06%。試驗(yàn)結(jié)果表明,TCA-正丁醇法去除蛋白質(zhì)效果較差,多糖保留率也較低。Sevag法雖多糖保留較多,但去除蛋白質(zhì)效果較差,且操作繁瑣。TCA法能有效去除寬筋藤粗多糖中的蛋白質(zhì),相對(duì)多的保留多糖組分,操作簡(jiǎn)單。

    3小結(jié)

    試驗(yàn)確定了寬筋藤多糖的最優(yōu)提取條件,即提取溫度90 ℃、提取時(shí)間90 min、料液比1∶10,此條件下寬筋藤粗多糖的提取率為3.94%,其中還原性多糖含量為20.40%,蛋白質(zhì)含量為8.21%。去除蛋白質(zhì)的方法中TCA法最適宜寬筋藤粗多糖的純化,能去除86.83%的蛋白質(zhì),還原性多糖保留率68.67%。

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