人凝血因子Ⅷ血液制品中的病毒滅活與驗證

閆 晨,熊可強(qiáng),王文姬，李 玲 (.上海新興醫(yī)藥股份有限公司，上海 0035；.上海卡樂康包衣技術(shù)有限公司，上海 006)

人凝血因子Ⅷ又稱抗血友病球蛋白，是體內(nèi)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的重要成分之一。因子Ⅷ主要在肝臟中生成，但在其他一些組織，如血管內(nèi)皮細(xì)胞中也能合成。它是單糖蛋白，相對分子質(zhì)量(Mr)為320 000，含2 332個氨基酸殘基，因子Ⅷ基因位于Xq28，基因長度185 kb，有26個外顯子。

人凝血因子Ⅷ是一種經(jīng)過純化、凍干的人凝血因子制劑，系從健康人的新鮮冰凍血漿混合中獲得因子Ⅷ冷沉淀，并經(jīng)過分離、提純和病毒滅活處理步驟精制而成[1]。人凝血因子Ⅷ是防治甲型血友病人出血的特效血液制劑。

甲型血友病是一種伴性遺傳疾病，患者由于凝血機(jī)制缺陷，偶遇內(nèi)外傷往往血流不止，也會因關(guān)節(jié)等處微血管破裂造成出血不止，關(guān)節(jié)腫痛等，需要足量輸用含因子Ⅷ制劑。由于因子Ⅷ在機(jī)體內(nèi)的半衰期不長(僅8～12 h)，故止血效果雖然顯著，但不能持久，再次出血須再輸注。且由于該病目前還未有根治的方法，故患者在一生中都需要使用因子Ⅷ制劑，所以這類患者對該制劑的需求量非常大[1]。

過去經(jīng)驗中血液制品大規(guī)模傳播人類獲得性免疫缺陷病毒(HIV)的案例使人們對血液制品的病毒安全性仍有擔(dān)心。最近，血漿分離的凝血因子Ⅷ濃縮液在給美國、歐洲、南非的血友病患者使用后有造成非脂包膜的甲型肝炎病毒(HAV)感染[2-5]的情況。凝血因子濃縮液也有類似報道傳播非脂包膜的細(xì)小病毒B19[6-9]。因此，對于血液制品增加病毒滅活工藝步驟及其驗證至關(guān)重要。筆者在此介紹人凝血因子Ⅷ的兩步病毒滅活工藝(S/D法及80 ℃、72 h干熱滅活法)及其驗證。

1 材料和方法

1.1 主要材料 冷沉淀(由上海新興醫(yī)藥股份有限公司制造部提供)；磷酸三丁酯(TNBP，美國Fluka公司，AR級)；吐溫-80(Tween-80，美國Sigma公司，AR級)。

1.2 人凝血因子Ⅷ制備工藝 將冷沉淀溶解于抽提液后用磷酸二氫鈉進(jìn)行酸沉淀，然后加入氫氧化鋁并降溫過濾。所得上清液經(jīng)超濾濃縮和除菌過濾后加S/D試劑使最終混合液中含TNBP為0.3%，吐溫-80為1%， 在24～26℃條件下進(jìn)行S/D處理攪拌6 h來滅活脂包膜病毒，再用離子層析柱分離制品，并超濾濃縮透析至目標(biāo)濃度進(jìn)行配制，然后用直徑0.22 μm膜過濾除菌并分裝，凍干后進(jìn)行80℃、72 h干熱處理滅活非脂包膜病毒。

1.3 病毒滅活驗證

1.3.1 指示病毒 采用國家食品藥品監(jiān)督管理局推薦用于驗證血液制品病毒滅活工藝的指示病毒，見表1。

表1 受驗證病毒的詳細(xì)信息

1.3.2 驗證方法 S/D法工藝：分別取PRV病毒和Sindbis病毒，按1:9的比例加入制品中，并加入吐溫-80和TNBP使終濃度分別為1%和0.3%(S/D)。在25℃條件下?lián)u晃孵育6 h，分別于不同時間點(diǎn)取樣檢測病毒滴度，同時取未加S/D試劑的樣品作對照，將未檢測出病毒的制品盲傳3代，若仍無病變出現(xiàn)，則判定該指示病毒已被滅活。

80 ℃、72 h干熱滅活工藝：將病毒按1∶9比例加入制品并分裝為10 ml/瓶，凍干后真空密封，并在79.5～81.5 ℃干烤箱中進(jìn)行恒溫處理72 h，并于0、1、2、4、24、72 h分別取樣檢測病毒滴度。所有樣本取樣后立即于-70 ℃凍存?zhèn)錅y。每批樣本至少重復(fù)測定2次。

2 結(jié)果

2.1 S/D法處理人凝血因子Ⅷ，滅活偽狂犬病毒(PRV)的結(jié)果 經(jīng)過對病毒滅活驗證，20030201、20030202、20030203連續(xù)3批人凝血因子Ⅷ經(jīng)S/D處理(TNBP、吐溫-80終濃度分別為0.3%和1.0%，在24～26℃條件下處理6 h)，病毒滅活后，殘余PRV滴度均低于本實(shí)驗最低檢測限-0.50 lgTCID50/0.1 ml。結(jié)果表明，可滅活所加入指示病毒PRV分別為：20030201批≥4.25 lgTCID50/0.1 ml，20030202批≥4.00 lgTCID50/0.1 ml，20030203批≥4.00 lgTCID50/0.1 ml(表2)，表明該滅活方法是理想的。

表2 經(jīng)S/D處理相應(yīng)時間后殘余PRV病毒滴度值(lgTCID50/0.1 ml)

2.2 S/D法處理人凝血因子Ⅷ滅活Sindbis病毒的結(jié)果 經(jīng)過病毒滅活驗證，20030201、20030202、20030203連續(xù)3批人凝血因子Ⅷ經(jīng)S/D處理(TNBP、吐溫-80終濃度分別為0.3%和1.0%，在24～26 ℃條件下處理6 h)后，3批樣品Sindbis病毒滅活量均大于4 lgPFU/ml(表3)，表明該滅活方法是理想的。

表3 經(jīng)S/D處理相應(yīng)時間(h)后殘余Sindbis病毒滴度值(lgPFU/ml)

2.3 S/D法對人凝血因子Ⅷ內(nèi)免疫缺陷病毒(HIV)進(jìn)行滅活的結(jié)果 經(jīng)過中國人民解放軍艾滋病檢測確認(rèn)實(shí)驗室驗證，20030201、20030202、20030203連續(xù)3批人凝血因子Ⅷ經(jīng)S/D處理(TNBP、吐溫-80終濃度分別為0.3%和1.0%，在24～26℃條件下處理6 h)，滴度下降log 5.5(表4)，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)盲傳3代，1/4 h第三代出現(xiàn)細(xì)胞病變，其余均未出現(xiàn)細(xì)胞病變(表5)，表明S/D處理6 h即可有效滅活樣品中的HIV病毒。

表4 經(jīng)S/D處理相應(yīng)時間后殘余HIV病毒滴度值(TCID50)

表5 經(jīng)S/D處理后不出現(xiàn)病變的樣品連續(xù)盲傳3代繼續(xù)觀察細(xì)胞病變(7 d)的結(jié)果

2.4 80℃、72 h干熱處理人凝血因子Ⅷ滅活PRV病毒的結(jié)果 經(jīng)病毒滅活驗證，20030201、20030202、20030203連續(xù)3批人凝血因子Ⅷ經(jīng)干熱法[(80±2)℃,72 h]處理后,可滅活所加入指示病毒PRV分別為:20030201批≥4.75 lgTCID50/0.1 ml，20030202批≥5.12 lgTCID50/0.1 ml ，20030203批≥4.88 lgTCID50/0.1 ml(表6)，表明該滅活方法是理想的。

表6 經(jīng)干熱處理相應(yīng)時間后殘余PRV病毒滴度值(lgTCID50/0.1 ml)

2.5 80℃、72 h干熱處理人凝血因子Ⅷ滅活腦心肌炎病毒(EMCV)的結(jié)果 經(jīng)病毒滅活驗證，20030201、20030202、20030203連續(xù)3批人凝血因子Ⅷ經(jīng)干熱法[(80±2) ℃,72 h]處理后,可滅活所加入指示病毒EMCV分別為:20030201批≥5.00 lgTCID50/0.1 ml，20030202批≥5.13 lgTCID50/0.1 ml，20030203批≥4.75 lgTCID50/0.1 ml(表7)，表明該滅活方法是理想的。

表7 經(jīng)干熱處理相應(yīng)時間后殘余EMCV病毒滴度值(lgTCID50/0.1 ml)

2.6 80℃、72 h干熱處理人凝血因子Ⅷ滅活Sindbis 經(jīng)病毒滅活驗證，20030201、20030202、20030203連續(xù)3批人凝血因子Ⅷ經(jīng)干熱法[(80±2)℃,72 h]處理后,可滅活所加入指示病毒Sindbis分別為:20030201批≥6.53 lgTCID50/0.1 ml，20030202批≥6.43 lgTCID50/0.1 ml，20030203批≥6.40 lgTCID50/0.1 ml(表8)，表明該滅活方法是理想的。

表8 經(jīng)干熱處理相應(yīng)時間后殘余EMCV病毒滴度值(lgTCID50/0.1 ml)

2.7 80℃、72 h干熱處理人凝血因子Ⅷ滅活豬細(xì)小病毒(PPV) 經(jīng)病毒滅活驗證，20070101、20070102、20070103連續(xù)3批人凝血因子Ⅷ經(jīng)干熱法[(80±2 )℃,72 h]處理后,可滅活所加入指示病毒PPV分別為20070101批≥4.25 lgTCID50/0.1 ml，20070102批≥4.00 lgTCID50/0.1 ml，20070103批≥4.13 lgTCID50/0.1 ml(表9)，表明該滅活方法是理想的。

表9 經(jīng)干熱處理相應(yīng)時間后殘余PPV病毒滴度值(lgTCID50/0.1 ml)

2.8 80℃、72 h干熱處理對人凝血因子Ⅷ質(zhì)量的影響 對2003年的3批人凝血因子Ⅷ制品進(jìn)行80 ℃、72 h干熱處理，對加熱前后的樣品進(jìn)行質(zhì)量檢定(表10)。結(jié)果顯示制品能耐受80 ℃、72 h干熱處理，其質(zhì)量指標(biāo)無明顯改變。

3 討論

經(jīng)血液制品傳染的病毒主要有HAV、HBV、HCV、HIV、細(xì)小病毒B19等，其中HAV和B19為非脂包膜病毒，其他為脂包膜病毒。從上文結(jié)果可以看出其相應(yīng)指示病毒EMCV、PRV、Sindbis、HIV、PPV均可被S/D、干熱兩步滅活法所滅活。S/D法主要針對脂包膜病毒，而干熱法則對脂包膜與非脂包膜病毒都有良好效果。所有以上病毒在經(jīng)過滅活后其病毒滴度都降低至少4 logs。其中EMCV、PRV、Sindbis和PPV在滅活后其病毒的滴度都低于可檢測最小值。HIV滴度降低雖然達(dá)到log 5.5，但其最終滴度略高于其他指示病毒。雖然已符合國家標(biāo)準(zhǔn)，但出于謹(jǐn)慎考慮仍對其盲傳3代進(jìn)行細(xì)胞病變觀察，結(jié)果顯示在經(jīng)過1 h S/D滅活后細(xì)胞病變即已不再出現(xiàn)。本方法共S/D滅活6 h，可以保證滅活效果。此外，經(jīng)過80 ℃、72 h干熱處理后，人凝血因子Ⅷ制品的主要質(zhì)量指標(biāo)與處理前相比無明顯變化，可以保證制品的質(zhì)量。

表10 3批樣品經(jīng)干熱處理前后反應(yīng)制品質(zhì)量水平的主要參數(shù)對比

綜上所述，S/D和80 ℃、72 h干熱雙重滅活病毒工藝無論對脂包膜病毒還是非脂包膜病毒都具有良好的滅活效果且對制品質(zhì)量指標(biāo)影響不顯著，可在實(shí)驗室中采用。

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