苦蕎糖基轉(zhuǎn)移酶的鑒定與基因克隆

摘 要：糖基轉(zhuǎn)移酶除了決定糖苷鍵的形成，還可參與激素調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來影響植物的生命活動，如參與黃酮類化合物的代謝。本文通過生物信息學(xué)手段，分析鑒定出苦蕎的糖基轉(zhuǎn)移酶，并進(jìn)行基因克隆，為進(jìn)一步研究糖基轉(zhuǎn)移酶在黃酮代謝中的作用打下理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：苦蕎；糖基轉(zhuǎn)移酶；生物信息；克隆

中圖分類號：S961.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20161131020

引言

糖基轉(zhuǎn)移酶存在于植物的高爾基體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，通過轉(zhuǎn)移活性糖基決定糖苷鍵的形成[1]。同時，該酶可以參與植物的激素調(diào)節(jié)和信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)來影響植物的生命活動，還具有減少細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)毒性，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和防御環(huán)境壓力的作用[2]。

苦蕎作為一類富含黃酮類物質(zhì)的植物，不僅具有食用營養(yǎng)價值而且在保健方面也能起到很好的療效[3-5]。黃酮類化合物的存在可以使植物體更好地適應(yīng)環(huán)境的改變，有利于提高植物體的生存和抗逆性[6-8]。糖基轉(zhuǎn)移酶可影響黃酮醇代謝底物的能力，在某些條件下轉(zhuǎn)換生產(chǎn)花青素 [9]。

1 材料與方法

1.1 材料

苦蕎幼苗。

1.2 試劑

氯仿、戊酮、異丙醇、無水乙醇試劑均為分析純；液氮，TE緩沖液。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

研缽、冷凍離心機(jī)、電子天平、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.4 生物信息在線分析網(wǎng)站及軟件

NCBI在線數(shù)據(jù)庫http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/；

PROSITE在線數(shù)據(jù)庫http：//prosite.expasy.org/；

蛋白理化性質(zhì)分析使用Protparam；

Swiss-model在線數(shù)據(jù)庫http：//swissmodel.expasy.org/。

1.5 苦蕎基因組的快速提取

取苦蕎幼苗5g，加液氮研碎，吸入50ml離心管；

加入25mL氯仿—戊酮—乙醇（80：4：16）溶液，顛倒混勻；

冷凍離心機(jī)4℃下5000r/min離心5min；

移取上清液至25ml離心管中，加入等體積異丙醇，搖動至出現(xiàn)絮狀沉淀；

在1.5ml離心管中加入1mLTE緩沖液，用玻璃棒纏出DNA絮團(tuán)溶于TE中。

1.6 苦蕎苦蕎糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆

以苦蕎基因組為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增苦蕎糖基轉(zhuǎn)移酶基因，所用引物為生工公司合成的5A'-ATCCATTCGTTTTA-3A'和5A'-CAGAAGTTATATTG-3A'。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎糖基轉(zhuǎn)移酶序列查找

通過NCBI網(wǎng)站，使用擬南芥中糖基轉(zhuǎn)移酶序列進(jìn)行BLAST分析，搜索苦蕎中糖基轉(zhuǎn)移酶序列，結(jié)果如下：

SVGFKAGVKDYRLTYYTPEYQTKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYDIEPVAGEESQFIAFVAYPLDLFEEGSVTNLFTSIVGNVFGFKALRALRLEDLRIPPAYSKTFQGPPHGIQVERDKLNKYGRPLLGCTIKPKLGLSAKNYGRAVYECLRGGLDFTKDDENVNSQPF。

2.2 蛋白質(zhì)的理化分析

為了更加準(zhǔn)確了解糖基轉(zhuǎn)移酶，利用生物信息分析軟件Protparam對其進(jìn)行理化分析，分析結(jié)果顯示：蛋白等電點(diǎn)為5.56，分子量22306.1Da，負(fù)電荷殘基25個，正電荷殘基23個，不穩(wěn)定系數(shù)31.96，平均疏水性-0.339。

2.3 蛋白的功能域及保守域分析

使用PROSITE數(shù)據(jù)庫[10]對苦蕎糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列進(jìn)行功能域和功能位點(diǎn)分析，找到了其所具備的蛋白功能結(jié)構(gòu)域（圖1），結(jié)果顯示該序列含有特征結(jié)構(gòu)域GTITASGDLVPLSYIAG，證明查找的蛋白序列存在糖基轉(zhuǎn)移酶的功能基礎(chǔ)。

2.4 苦蕎糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆

分析驗(yàn)證了查找到的苦蕎糖基轉(zhuǎn)移酶具有保守的功能結(jié)構(gòu)域，為了進(jìn)一步研究其在黃酮代謝中的作用，設(shè)計(jì)引物通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出約為800bp的基因片段（如圖2）。

3 結(jié)論

本文通過生物信息學(xué)方法鑒定出了苦蕎糖基轉(zhuǎn)移酶，其由202個氨基酸組成，大部分為疏水氨基酸，等電點(diǎn)PI為5.56，具有保守的功能結(jié)構(gòu)域，是有生物活性的蛋白?？嗍w糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆為進(jìn)一步研究糖基轉(zhuǎn)移酶在黃酮代謝中的作用打下理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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[10]鄒蔚然，郭萬株.蛋白激酶基因的克隆和生物信息學(xué)分析[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

作者簡介：趙丹（1986-），男，山西太原人，研究生學(xué)歷，助教，研究方向：分子生物學(xué)。