甘草炮制雷公藤降低其肝毒性作用的初步研究

趙小梅+宮嫚+董捷鳴+王伽伯+肖小河+趙奎君+馬致潔

[摘要]為探討甘草炮制雷公藤降低其肝毒性的作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評價(jià)炮制前后雷公藤對肝臟的毒性，觀察空白組、雷公藤組、甘草炮制雷公藤組肝組織病理切片、血清生化指標(biāo)及細(xì)胞炎癥因子的差異。大鼠肝組織病理切片顯示雷公藤組肝組織損傷明顯，炮制后肝組織未見明顯損傷；雷公藤組與空白組比較AST，ALT，CRE升高（P<001），UREA升高（P<005），ALB降低（P<001）；甘草炮制雷公藤組與雷公藤組比較AST，ALT，CRE，UREA降低（P<001），ALB升高（P<001）。炎癥因子檢測結(jié)果顯示雷公藤組與空白組比較IL1β， IL6，TNFα顯著升高（P<001）；甘草炮制雷公藤組與雷公藤組比較IL1β， IL6，TNFα顯著降低（P<001）。甘草炮制雷公藤可有效降低雷公藤肝毒性，減輕雷公藤導(dǎo)致的肝損傷。該實(shí)驗(yàn)可為雷公藤合理制用提供參考，同時(shí)為甘草炮制雷公藤降低其肝毒性研究提供數(shù)據(jù)支持。

[關(guān)鍵詞]雷公藤； 甘草； 炮制減毒； 肝毒性； 炎癥因子

雷公藤Tripterygium wilfordii Hook F為衛(wèi)矛科雷公藤屬一年生藤本植物，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、辛，性寒，有大毒，歸肝、腎經(jīng)。具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、消腫止痛、殺蟲解毒等功效。在臨床上治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、紅斑狼瘡、腎病綜合征等自身免疫系統(tǒng)疑難病癥有良好的效果，療效獨(dú)特[12]，但由于雷公藤毒性較大，臨床應(yīng)用時(shí)不良反應(yīng)時(shí)有發(fā)生，包括腎臟、生殖系統(tǒng)、肝臟、胃腸道、免疫系統(tǒng)及皮膚黏膜等，其中肝臟為其最常見的受累器官之一[34]，已嚴(yán)重制約其臨床應(yīng)用。

歷代文獻(xiàn)對雷公藤炮制減毒方法的記載甚少，現(xiàn)代對其炮制的研究方法有凈制、蒸制、加輔料（羊血）、靈芝雙向發(fā)酵解毒等[57]，目前臨床應(yīng)用時(shí)，主要是對雷公藤進(jìn)行凈制，取毒性較小的木質(zhì)部作為藥用，但中毒及不良反應(yīng)現(xiàn)象仍很突出。雷公藤加熱炮制和輔料炮制減毒的現(xiàn)代研究也較少，且減毒效果不明顯?，F(xiàn)代研究表明，甘草具有保肝作用，甘草酸是其主要作用成分[8]。文獻(xiàn)記載甘草常用于有毒中藥的配伍及炮制[8]，甘草汁炮制是傳統(tǒng)減消中藥毒性的手段，有文獻(xiàn)報(bào)道甘草配伍雷公藤能顯著降低肝毒性，且已優(yōu)化了最佳配伍比例，從化學(xué)角度證實(shí)了雷公藤配伍甘草對毒性成分含量和比例的影響[911]。為此，本研究以肝毒性中藥雷公藤為研究對象，在甘草配伍雷公藤減毒的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用基礎(chǔ)上，擬結(jié)合現(xiàn)代研究成果，研究甘草炮制雷公藤減毒的作用及效果，以期為臨床提供安全、有效、便于使用的雷公藤炮制品，同時(shí)為其他肝毒性中藥研究提供參考和數(shù)據(jù)支持。

1材料

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE52AA）；水循環(huán)真空泵（上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司）；AL204電子天平（METTLER TOLEDO）；Gradient A10 MillQ超純水器（美國Millipore 公司）；超聲提取清洗器（KQ5200E）；真空冷凍干燥箱；OLYMPUS光學(xué)顯微鏡；冷凍離心機(jī)（Sigma，德國）；低速離心機(jī)（SE3614）；自動(dòng)生化儀（mindray BS300）；酶標(biāo)儀；水浴鍋（AISITE）；電磁爐。

雷公藤T wilfordii生藥材購自福建三明，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院趙奎君教授鑒定，為衛(wèi)矛科雷公藤的干燥根；生甘草飲片購自于北京友誼醫(yī)院中藥房，經(jīng)趙奎君教授鑒定為豆科植物脹果甘草的干燥根。

無水乙醇，純凈水；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶檢測試劑盒；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶檢測試劑盒；血清白蛋白檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

大鼠白介素1β酶聯(lián)免疫試劑盒 （rat interleukin 1β ELISA Kit），批號（W07036997）；大鼠白介素6酶聯(lián)免疫試劑盒 （rat interleukin 6 ELISA Kit），批號（W09036996）；大鼠腫瘤壞死因子α酶聯(lián)免疫試劑盒（TNFα ELISA kit ），批號（U27036998）（Cusabio）。

2方法

21樣品制備

211雷公藤提取物稱取適量雷公藤生藥材，打粉機(jī)打碎成粗顆粒狀，8倍體積60%乙醇超聲提取3次，合并濾液，減壓濃縮回收乙醇，真空干燥得粗提物，雷公藤提取率為762%， 臨用前用去離子水配制成相應(yīng)濃度 （按雷公藤生藥量配制）。

212甘草汁炮制雷公藤樣品制備稱取適量雷公藤生藥材（打粉機(jī)打碎成粗顆粒狀）及生甘草飲片，雷公藤甘草3∶1。

8倍體積的純凈水浸泡甘草飲片30 min，煎煮20 min，煎煮液濾出，相同步驟重復(fù)煎煮2次后合并濾液，濃縮至合適體積，甘草汁的量需能完全浸泡雷公藤，備用。

取制備好的甘草汁浸泡雷公藤生藥材至甘草汁被完全吸收，置鼓風(fēng)干燥箱干燥，取出后按211項(xiàng)提取，減壓濃縮回收乙醇，真空干燥得粗提物，臨用前用去離子水配制成相應(yīng)濃度 （按雷公藤生藥量配制）。

22動(dòng)物分組

以下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于解放軍第三○二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。每天上午 9∶00—10∶00 灌胃，正常組每天灌以等量生理鹽水。

221小鼠預(yù)試驗(yàn)（給藥劑量的確定） SPF級雄性小鼠50只，體重（20±2）g，正常飼養(yǎng)5 d，隨機(jī)分成5組（n=10），空白組、低劑量組（3 g·kg-1）、中劑量組（6 g·kg-1）、高劑量組（12 g·kg-1）和超高劑量（24 g·kg-1）（以雷公藤生藥材計(jì)），連續(xù)給藥14 d。

222甘草汁炮制雷公藤減毒小鼠試驗(yàn)SPF級雄性小鼠30只，體重（20±2） g，正常飼養(yǎng)5 d，隨機(jī)分成3組 （n=10），空白組、雷公藤組（15 g·kg-1）、甘草炮制雷公藤組（15 g·kg-1）（以雷公藤生藥材計(jì)），連續(xù)給藥14 d。

223甘草汁炮制雷公藤減毒大鼠試驗(yàn)SD大鼠，SPF 級，（180±20）g，30只，正常飼養(yǎng)5 d，隨機(jī)分成3組（n=10），空白組、雷公藤組（15 g·kg-1）、甘草炮制雷公藤組（15 g·kg-1）（以雷公藤生藥材計(jì)），連續(xù)給藥14 d。

23肝組織病理形態(tài)學(xué)檢查

取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織 05 cm×1 cm×15 cm，10%甲醛固定，常規(guī)病理切片，HE染色，光鏡下觀察，拍照。

24動(dòng)物取血及血清處理

實(shí)驗(yàn)組小鼠及大鼠給藥2周后在灌胃后1 d眼眶取血，冷凍離心（4 ℃，3 500 r·min-1，10 min），取上清，全自動(dòng)生化及酶標(biāo)儀檢測AST，ALT，ALB，Cre，BUN，UREA。炎癥因子IL1β，IL6，TNFα檢測按照試劑盒說明進(jìn)行。

25數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 180 軟件統(tǒng)計(jì)，各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果以±s描述，進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較，若符合正態(tài)分布用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料單因素方差分析。兩樣本比較，其中方差齊性者采用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊者采用 Dulmets 法檢驗(yàn)。

3結(jié)果

31不同給藥劑量小鼠存活率

超高劑量組在第8 天所有實(shí)驗(yàn)小鼠已全部死亡，存活率為0%；高劑量組實(shí)驗(yàn)小鼠2周存活率為90%，中劑量組實(shí)驗(yàn)小鼠2周存活率為90%；低劑量組實(shí)驗(yàn)小鼠2周存活率為90%；空白組實(shí)驗(yàn)小鼠2周存活率為100%；因此實(shí)驗(yàn)組（小鼠實(shí)驗(yàn)及大鼠實(shí)驗(yàn)）給藥劑量在高劑量組12 g·kg-1（以雷公藤生藥材計(jì)）基礎(chǔ)上提高為15 g·kg-1（以雷公藤生藥材計(jì)）給藥，結(jié)果見圖1。

321小鼠肝組織病理切片（HE染色）空白對照組小鼠肝組織著色均勻、肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、肝索排列整齊、肝細(xì)胞形態(tài)完好。雷公藤組肝索排列明顯紊亂，炎細(xì)胞浸潤、結(jié)構(gòu)破壞、 肝細(xì)胞渾濁、伴有大量水腫和脂肪變性，大量片狀萎縮壞死、胞漿內(nèi)有明顯的大小不等的空泡以及數(shù)量不一的肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；肝組織呈輕微嗜堿性。甘草炮制雷公藤組肝索排列輕度紊亂，肝細(xì)胞伴有少量水腫，肝細(xì)胞輕度退變，肝細(xì)胞形態(tài)完好。提示甘草炮制雷公藤可減輕其肝損傷程度，結(jié)果見圖2。

322小鼠血清生化指標(biāo)檢測雷公藤組與空白組比較AST，ALT升高（P<005），CRE升高（P<001）；ALB降低（P<001），BUN沒有明顯差異；甘草炮制雷公藤組與雷公藤組比較AST，ALT，BUN沒有明顯差異，CRE降低（P<001）；ALB升高（P<005）；每組實(shí)際檢測的動(dòng)物數(shù)（n=8），結(jié)果見圖3。

33甘草汁炮制雷公藤減毒大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

331肝組織病理組織形態(tài)學(xué)檢查（HE染色）空白對照組大鼠肝組織著色均勻、肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、肝索排列整齊、肝細(xì)胞形態(tài)完好。雷公藤組肝索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹、渾濁、伴有少量水腫和脂肪變性少量壞死，結(jié)構(gòu)破壞、局部區(qū)域出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡和局灶性炎性。甘草炮制雷公藤組肝組織著色均勻、肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、肝索排列整齊、肝細(xì)胞形態(tài)完好，無明顯肝損傷表現(xiàn)，結(jié)果見圖4。

332大鼠生化指標(biāo)檢測雷公藤組與空白組比較AST，ALT，CRE升高（P<001），UREA升高（P<005），ALB降低（P<001）； 甘草炮制雷公藤組與雷公藤組比較AST，ALT，CRE，UREA降低（P<001），ALB升高（P<001）。提示甘草炮制雷公藤可顯著降低其肝毒性；每組實(shí)際檢測的動(dòng)物數(shù)（n=8），結(jié)果見圖5。

333大鼠血清細(xì)胞因子IL1β，IL6，TNFα檢測雷公藤組與空白組比較IL1β，IL6，TNFα顯著升高（P<001）；甘草炮制雷公藤組與雷公藤組比較IL1β，IL6，TNFα顯著降低（P<001）；每組實(shí)際檢測的動(dòng)物數(shù)（n=8），結(jié)果見圖6。

4結(jié)論

本研究首次實(shí)驗(yàn)證實(shí)甘草炮制雷公藤可減輕其導(dǎo)致的肝臟生化指標(biāo)及細(xì)胞因子IL1β，IL6，TNFα升高的癥狀，減輕其肝損傷，為臨床安全、有效、便于使用的雷公藤炮制品的使用提供參考和數(shù)據(jù)支持。雷公藤治療自身免疫性疾病效果顯著，雷公藤在治療自身免疫等難治性疾病（如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等）具有很好的療效[12]，但同時(shí)表現(xiàn)出明顯的肝毒性作用，而相應(yīng)的合理用藥措施沒有得到充分重視和研究，嚴(yán)重制約了雷公藤臨床療效的發(fā)揮。甘草是常用解毒中藥，甘草酸具保肝作用，甘草炮制是傳統(tǒng)減消中藥毒性的手段

并取得了很好的效果；另一方面，研究顯示雷公藤配伍甘草能顯著降低肝毒性，已優(yōu)化了最佳配伍比例[911]。

基于以上研究本實(shí)驗(yàn)采用甘草炮制雷公藤，觀察炮制前后其肝損傷差異，結(jié)果顯示肝組織病理切片中雷公藤組產(chǎn)生明顯的肝損傷，與空白組比較生化指標(biāo)ALT，AST，ALB，Cre，UREA，細(xì)胞因子IL1β，IL6，TNFα，有顯著性差異，提示雷公藤組產(chǎn)生肝損傷。甘草汁炮制雷公藤組肝組織病理切片沒有產(chǎn)生明顯的肝損傷；且較之雷公藤組生化指標(biāo)ALT，AST，ALB，Cre，UREA，細(xì)胞因子IL1β，IL6，TNFα，有顯著性差異，提示雷公藤炮制后可減輕其肝損傷并減少肝損傷導(dǎo)致的炎癥因子的釋放。實(shí)驗(yàn)中雷公藤組肝損傷表現(xiàn)明顯，血清中細(xì)胞炎癥因子釋放高于其他2組，其可能與HMGB1 遷移有關(guān)[1315]。HMGB1的來源有2種，一是由當(dāng)細(xì)胞的完整性被破環(huán)，HMGB1瞬時(shí)被動(dòng)釋放，二是在內(nèi)毒素、IL1和TNF等的刺激下，由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞活化后主動(dòng)釋放[16]。HMGB1可通過活化細(xì)胞的主動(dòng)分泌和壞死損傷細(xì)胞的被動(dòng)釋放而進(jìn)入細(xì)胞外，其誘導(dǎo)機(jī)體固有免疫啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)出炎癥因子的作用[1721]，發(fā)表在Hepatology的研究結(jié)果證明HMGB1是對乙酰氨基酚急性肝損害的關(guān)鍵因子之一[15]，雷公藤致肝損傷機(jī)制有待于實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討研究及驗(yàn)證。甘草炮制雷公藤組沒有明顯的肝損傷表現(xiàn)其可能的原因是甘草酸對HMGB1的阻斷作用。有文獻(xiàn)報(bào)道甘草中的重要成分之一甘草酸可直接結(jié)合HMGB1，可作為HMGB1的拮抗劑[1315]；甘草具有保肝作用，抗炎作用，其主要成分甘草酸對肝臟具有保護(hù)作用[8]。甘草同時(shí)具有保肝和拮抗HMGB1的雙重作用，其是否是降低雷公藤肝毒性的主要機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。甘草對HMGB1免疫通路的調(diào)控為炮制雷公藤減毒提供了重要支持，課題組將在后期對其進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討，以期初步探討其可能的減毒機(jī)制。雷公藤主要成分雷公藤紅素和雷公藤甲素既是其有效成分，又是其主要的毒性成分，與肝損傷有一定的相關(guān)性[12，19]，有實(shí)驗(yàn)報(bào)道從化學(xué)角度探索甘草配伍雷公藤對其毒性成分含量和比例的影響[9]，課題組在后期炮制減毒機(jī)制探討實(shí)驗(yàn)中也將對其進(jìn)行比較，以期為雷公藤臨床合理及甘草炮制雷公藤降低其肝毒性研究提供制用參考和數(shù)據(jù)支持。

[參考文獻(xiàn)]

[1]謝艷，郭云鵬 雷公藤治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制研究進(jìn)展[J] 風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2013（4）：72

[2]柳士忠復(fù)方甘草酸單銨聯(lián)合雷公藤多苷片治療尋常型銀屑病的臨床觀察[J] 中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2014，8（1）：138

[3]國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品評價(jià)中心 關(guān)注雷公藤制劑的用藥安全[J] 藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)，2012，46（4）：1

[4]滕光菊，梁慶升，孫穎，等 165例中草藥導(dǎo)致藥物性肝損害臨床特征及病理分析[J] 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014（4）：913

[5]劉建群，高俊博，舒積成，等微波炮制對雷公藤毒性及其化學(xué)成分的影響研究[J]時(shí)珍國醫(yī)國藥，2014（2）：344

[6]解素花，張廣平，孫桂波，等 附子與甘草不同配伍比例配伍減毒的實(shí)驗(yàn)研究[J] 中國中藥雜志，2012，37（15）：2210

[7]李志華，顏苗，張畢奎，等 基于藥動(dòng)學(xué)的甘草配伍減毒機(jī)制研究進(jìn)展[J] 中草藥，2015（23）：3611

[8]陳云華，萬新，孫建寧，等 甘草酸、甘草苷、異甘草素對醋氨酚人肝細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用比較[J] 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012（4）：245

[9]馬哲 雷公藤配伍甘草減毒增效研究[D]沈陽：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2011

[10]周聰，周玲玲，周學(xué)平 中藥配伍雷公藤減肝毒性機(jī)制研究[J] 中華中醫(yī)藥雜志，2014（4）：1167

[11]曹玲娟，顏苗，李煥德，等 雷公藤致肝損傷及與甘草配伍減毒機(jī)制的研究進(jìn)展[J] 中國中藥雜志，2015，40（13）：2537

[12]謝彤，周學(xué)平，林麗麗，等 基于“異類相制”的雷公藤復(fù)方配伍減毒代謝組學(xué)研究[J] 中國中藥雜志，2016，41（6）：1124

[13]柴智，樊慧杰，周文靜，等 逍遙散對雷公藤致急性肝損傷大鼠CD68、腫瘤壞死因子α的影響[J] 中醫(yī)雜志，2014（6）：497

[14]Wang Xuefu， Sun Rui， Wei Haiming， et al Highmobility group box1 （HMGB1）tolllike receptor （TLR）4interleukin （IL）23IL17A axis in druginduced damageassociated lethal hepatitis：interaction of γδ T cells with macrophages[J] Hepatology， 2013， 57：373

[15]Masatoshi Ohnishi， Hiroshi Katsuki， Chiharu Fukutomi， et al HMGB1 inhibitor glycyrrhizin attenuates intracerebral hemorrhageinduced injury in rats [J] Neuropharmacology， 2011，61：975

[16]閆戈，楊甲梅 高遷移率族蛋白B1與肝損傷研究進(jìn)展[J] 肝膽外科雜志，2010（5）：392

[17]Wang X， Jiang Z， Cao W， et al Th17/Treg imbalance in triptolideinduced liver injury[J] Fitoterapia， 2014， 93：245

[18]Xue X， Gong L， Qi X， et al Knockout of hepatic P450 reductase aggravates triptolideinduced toxicity[J] Toxicol Lett， 2011， 205（1）：47

[19]姚金成，劉穎，胡領(lǐng)，等雷公藤甲素誘導(dǎo)肝細(xì)胞L02凋亡的機(jī)制[J]中國新藥雜志，2013，22（6）：698

[20]Zhang Y， Jiang Z， Xue M， et al Toxicogenomic analysis of the gene expression changes in rat liver after a 28day oral Tripterygium wilfordii multiglycoside exposure[J] J Ethnopharmacol， 2012， 141（1）：170

[21]Fu Q， Huang X， Shu B， et al Inhibition of mitochondrial respiratory chain is involved in triptolideinduced liver injury[J] Fitoterapia， 2011， 82（8）：1241

[責(zé)任編輯孔晶晶]

2017年1月 第42卷第1期Vol42， No 1January， 2017

[收稿日期]20161028