茉莉酸甲酯對(duì)明黨參植株和懸浮細(xì)胞中呋喃香豆素積累的影響

蔡靜+馬赟++陳建偉+李祥+周萍

[摘要]佛手酚、佛手柑內(nèi)酯和花椒毒素為明黨參中天然呋喃香豆素成分，具多重藥理作用。以明黨參栽培品和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為材料，研究茉莉酸甲酯處理后呋喃香豆素積累狀況和一系列生理生化指標(biāo)變化。結(jié)果顯示，茉莉酸甲酯不同程度地促進(jìn)明黨參中各呋喃香豆素合成，柄懸浮細(xì)胞中產(chǎn)量高于葉懸浮細(xì)胞。于培養(yǎng)周期第10天加入100 μmol·L-1茉莉酸甲酯對(duì)明黨參懸浮細(xì)胞作用效果最明顯，最適收獲時(shí)間為處理4 d后，此時(shí)柄懸浮細(xì)胞中佛手酚，花椒毒素和佛手柑內(nèi)酯產(chǎn)量分別是未誘導(dǎo)細(xì)胞的736，19，427倍。茉莉酸甲酯誘導(dǎo)呋喃香豆素增長(zhǎng)的同時(shí)抑制細(xì)胞活力和生物量積累，激發(fā)細(xì)胞防御反應(yīng)。該研究初次系統(tǒng)地探索了茉莉酸甲酯對(duì)明黨參中呋喃香豆素的誘導(dǎo)效果，并為大量生產(chǎn)3種活性成分和探明茉莉酸甲酯誘導(dǎo)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]明黨參； 呋喃香豆素； 茉莉酸甲酯； 誘導(dǎo)

明黨參Changium smyrnioides Wollf為我國(guó)特有的傘形科植物，收錄于《中國(guó)植物紅皮書(shū)》，屬易危級(jí)[12]。其根作為藥材明黨參載于現(xiàn)版藥典，具潤(rùn)肺化痰，養(yǎng)陰和胃，解毒之功效[3]，亦作為重要藥材行銷(xiāo)東南亞各地。明黨參活性成分的前期研究著重于多糖、脂肪酸和揮發(fā)油等方面，呋喃香豆素是近年來(lái)研究較多的特征性成分[4]，廣泛存在于明黨參全株及組織培養(yǎng)材料中[57]，是明黨參滋補(bǔ)強(qiáng)壯功效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為其具有抗氧化、抗腫瘤、抗HIV、抗驚厥等多重藥理活性[811]，極具開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

組織培養(yǎng)技術(shù)可用于生產(chǎn)藥用植物有效成分，結(jié)合誘導(dǎo)子可獲取大量目標(biāo)產(chǎn)物，明黨參在此方面的研究較少且前期僅以多糖為指標(biāo)，鮮有以呋喃香豆素為目標(biāo)的培養(yǎng)研究[1215]。茉莉酸甲酯（MeJA）作為植物信號(hào)分子和常用的化學(xué)誘導(dǎo)子[1617]，對(duì)多種植物器官或組織培養(yǎng)材料中香豆素類(lèi)成分表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)作用[1821]。本實(shí)驗(yàn)首次系統(tǒng)地探索MeJA對(duì)明黨參原植株和懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響和其中3種呋喃香豆素的誘導(dǎo)效果，以期獲得最高產(chǎn)量，為進(jìn)一步用于擴(kuò)大化生產(chǎn)這3種天然產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)，也為呋喃香豆素資源的開(kāi)發(fā)和珍稀藥用植物明黨參的可持續(xù)利用提供新途徑。另一方面，本實(shí)驗(yàn)探討了誘導(dǎo)過(guò)程中一系列植物生理生化指標(biāo)的變化，為研究MeJA對(duì)明黨參的誘導(dǎo)機(jī)制提供依據(jù)。

1材料

11樣品植物材料栽培于南京中醫(yī)藥大學(xué)仙林校區(qū)藥苑，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室陳建偉教授鑒定為傘形科明黨參Ch smyrnioides。取幼嫩葉與葉柄誘導(dǎo)愈傷組織，采用MS培養(yǎng)基，激素配比分別為NAA 15 mg·L-1+2，4D 05 mg·L-1+KT 02 mg·L-1+6BA 05 mg·L-1和NAA 15 mg·L-1+2，4D 15 mg·L-1+KT 02 mg·L-1+6BA 05 mg·L1[12，22]。初代愈傷組織繼代3次后，用鑷子捏碎接種于對(duì)應(yīng)的pH為58，含蔗糖30 g·L-1的MS液體培養(yǎng)基中，于25 ℃，光照強(qiáng)度1 500 lx，轉(zhuǎn)速120 r·min-1的搖床中培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)力強(qiáng)且含呋喃香豆素較多的葉和葉柄初代懸浮細(xì)胞系經(jīng)50目鎳網(wǎng)濾過(guò)，作為細(xì)胞母液繼代備用，繼代起始濃度為干重20 mg·L-1。

12儀器與試劑DHZDA冷凍恒溫振蕩器（太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；SPX300BG光照培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；FD1A50真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；Waters e2695高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司，Waters 2998 PDA檢測(cè)器）；KH500DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。對(duì)照品花椒毒素（批號(hào)JN01KEJR，東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；對(duì)照品佛手柑內(nèi)酯和佛手酚為本實(shí)驗(yàn)室自明黨參根皮分離而得，經(jīng)HPLC歸一化測(cè)定，純度均大于98%。色譜級(jí)甲醇（江蘇漢邦科技有限公司），其余試劑為分析純。

2方法

21MeJA對(duì)明黨參植株呋喃香豆素積累的影響于4月上旬明黨參生長(zhǎng)旺盛時(shí)期向其地上部分均勻噴施200 μmol·L-1MeJA，對(duì)照組噴以蒸餾水，處理后第0，1，2，3，4，5天采收并分揀葉與葉柄，測(cè)定呋喃香豆素含量。

22MeJA濃度對(duì)明黨參懸浮細(xì)胞呋喃香豆素積累的影響取同批繼代的懸浮細(xì)胞，在生長(zhǎng)周期第8天向培養(yǎng)體系中分別加入0，50，100，200 μmol·L-1MeJA，繼續(xù)培養(yǎng)5 d后收獲樣品，測(cè)定細(xì)胞生物量、活力和3種呋喃香豆素含量。

23MeJA加入時(shí)間點(diǎn)對(duì)明黨參懸浮細(xì)胞呋喃香豆素積累的影響取同批繼代的懸浮細(xì)胞，分別在生長(zhǎng)周期第0，5，8，10，12 天加入100 μmol·L-1MeJA，繼續(xù)培養(yǎng)至第15 天收獲樣品，測(cè)定細(xì)胞生物量、活力和3種呋喃香豆素含量。

24MeJA處理后明黨參懸浮細(xì)胞呋喃香豆素動(dòng)態(tài)積累取同批繼代的懸浮細(xì)胞，在生長(zhǎng)周期第10天加入100 μmol·L-1MeJA，處理后第0 天起每天收獲樣品直至第5天，測(cè)定細(xì)胞生物量、活力、3種呋喃香豆素含量和相關(guān)生理生化指標(biāo)。

25細(xì)胞生物量及活力測(cè)定量得懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物總體積，抽濾后稱(chēng)重，其與培養(yǎng)物總體積比值為細(xì)胞鮮重，細(xì)胞經(jīng)冷凍干燥后再次稱(chēng)量，其與培養(yǎng)物總體積比值為干重。采用TTC法測(cè)定活力[2324]，精密稱(chēng)取02 g新鮮收獲的細(xì)胞于離心管中，加04% TTC溶液和01 mol·L-1 pH 70 PBS溶液各25 mL，混勻，25 ℃避光反應(yīng)20 h。離心，棄上清，加5 mL無(wú)水乙醇，混勻，于60 ℃水浴并振蕩30 min，冷卻，離心，取上清，測(cè)定485 nm處吸光度，其與樣品質(zhì)量比值即為細(xì)胞活力值。

26呋喃香豆素含量測(cè)定分別測(cè)定細(xì)胞與培養(yǎng)液中呋喃香豆素含量，兩者之和為懸浮細(xì)胞體系中總量。取明黨參細(xì)胞凍干粉末（過(guò)4號(hào)篩）05 g，精密稱(chēng)定，加甲醇50 mL，于60 kHz超聲提取60 min，過(guò)濾，濾液揮發(fā)溶劑，用甲醇定容至5 mL，過(guò)045 μm濾膜，即得細(xì)胞供試品溶液。量得濾后培養(yǎng)液總體積，取50 mL，于40 ℃減壓干燥，加甲醇溶解，收集濾液，揮發(fā)溶劑，用甲醇定容到2 mL，過(guò)045 μm濾膜，即得培養(yǎng)液供試品溶液。采用高效液相色譜法測(cè)定3種香豆素含量，參照周萍等[13]方法，AgilentC18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為314 nm，進(jìn)樣量為10 μL，流速為10 mL·min-1，水（A）甲醇（B）梯度洗脫程序?yàn)?～5 min，80%～70% A；5～25 min，70%～60% A；25～35 min，60%～40% A；35～50 min，40%～30% A；50～60 min，30%～0% A；60～70 min，0%～80% A。原植物葉、葉柄處理和測(cè)定方法與明黨參細(xì)胞相同。

27生理生化指標(biāo)測(cè)定可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法，脯氨酸和丙二醛含量、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性均參照蔡慶生[25]的方法測(cè)定。

28數(shù)據(jù)處理利用Excel和SPSS 220軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，處理間差異采用新復(fù)極差法（Duncan′s）比較，顯著水平為005，結(jié)果以±s表示。

3結(jié)果與分析

31MeJA對(duì)明黨參植株呋喃香豆素積累的影響處理后，花椒毒素和佛手柑內(nèi)酯含量均明顯增長(zhǎng)，兩者在葉中的含量最高達(dá)到對(duì)照的149，171倍，在柄中的含量最高達(dá)到對(duì)照的144，162倍，表明MeJA可有效誘導(dǎo)明黨參植株中2種呋喃香豆素合成?；ń范舅睾头鹗指虄?nèi)酯受誘導(dǎo)后變化趨勢(shì)一致，但葉柄對(duì)MeJA誘導(dǎo)的反應(yīng)進(jìn)程更快（圖1）。MeJA可模擬類(lèi)似昆蟲(chóng)取食、機(jī)械損傷效果從而誘發(fā)防御行為，呋喃香豆素是明黨參產(chǎn)生的一類(lèi)化學(xué)防御物質(zhì)，研究表明由于植物生長(zhǎng)和防御都需使用有限的資源，因而植物在權(quán)衡兩者的前提下做出直接防御、間接防御、不防御、負(fù)防御4類(lèi)不同反應(yīng)[2627]，就明黨參而言，先在更靠近地表的葉柄部位重點(diǎn)合成防御物質(zhì)，以抵抗昆蟲(chóng)取食等機(jī)械傷害，后重點(diǎn)轉(zhuǎn)向主要承擔(dān)光合作用、對(duì)生長(zhǎng)更重要的葉部分。這可能是柄對(duì)誘導(dǎo)的應(yīng)答更早而葉中呋喃香豆素積累作用更持久的原因。

32MeJA濃度對(duì)明黨參懸浮細(xì)胞呋喃香豆素積累的影響隨著MeJA濃度的增加，細(xì)胞生物量和活力與0 μmol·L-1處理相比均持續(xù)下降，3種呋喃香豆素含量與產(chǎn)量先升后降。其中花椒毒素主要積累于細(xì)胞內(nèi)，佛手酚主要釋放于培養(yǎng)液，佛手柑內(nèi)酯在細(xì)胞內(nèi)外均有分布但以培養(yǎng)液中更多。濃度為100 μmol·L-1時(shí)三者含量和產(chǎn)量達(dá)到峰值，故該濃度是誘導(dǎo)明黨參懸浮細(xì)胞產(chǎn)生呋喃香豆素的最佳濃度（圖2）。

33MeJA加入時(shí)間點(diǎn)對(duì)明黨參懸浮細(xì)胞呋喃香豆素積累的影響隨MeJA加入時(shí)間點(diǎn)的推后，所得細(xì)胞生物量和活力總體上升，說(shuō)明MeJA對(duì)明黨參細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，細(xì)胞生長(zhǎng)到一定時(shí)期（8 d及以后），積累一定生物量可緩解此抑制作用（圖3）。8，10 d處理所得3種呋喃香豆素含量與產(chǎn)量明顯高于其他組，含量上10 d處理略高于8 d處理或與之持平，但產(chǎn)量上均為10 d處理最高，故在細(xì)胞培養(yǎng)周期第10 天加入MeJA最佳。一般認(rèn)為細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)后期或穩(wěn)定前期是進(jìn)行誘導(dǎo)處理的最佳時(shí)

A葉懸浮細(xì)胞；B葉柄懸浮細(xì)胞；n=4。

機(jī)[28]，本實(shí)驗(yàn)中10 d即為指數(shù)后期，而穩(wěn)定前期（12 d）的明黨參懸浮細(xì)胞對(duì)MeJA的反應(yīng)顯著弱于10 d，說(shuō)明此階段細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)敏感性已大大降低。一定的細(xì)胞密度有利于細(xì)胞間信號(hào)傳遞，故初期加入MeJA誘導(dǎo)所得呋喃香豆素含量也較低。

34MeJA處理后明黨參懸浮細(xì)胞呋喃香豆素動(dòng)態(tài)積累處理后生物量緩慢增加后趨于穩(wěn)定，活力在1 d明顯下降后變化減緩。呋喃香豆素積累趨勢(shì)大體相同，含量快速上升至3 d左右進(jìn)入平穩(wěn)期，產(chǎn)量多于4 d達(dá)到峰值，故誘導(dǎo)后4 d為適宜收獲時(shí)期。柄源細(xì)胞中花椒毒素與佛手柑內(nèi)酯含量變化優(yōu)先于葉源細(xì)胞，這與處理原植物所得結(jié)果一致，說(shuō)明懸浮細(xì)胞雖經(jīng)脫分化但仍保有原外植體器官的一定特性（圖4）。

與0 d相比生理生化指標(biāo)總體先升后降，脯氨酸無(wú)顯著變化，可溶性蛋白和丙二醛變化較緩，表明MeJA對(duì)明黨參細(xì)胞膜系統(tǒng)造成一定程度氧化損傷但滲透脅迫較弱。各指標(biāo)峰值出現(xiàn)于2 d左右，5 d多降回原水平，說(shuō)明MeJA引起細(xì)胞防御反應(yīng)，抗氧化酶活性的快速上升正是防御行為的體現(xiàn)，這與李陽(yáng)等[29]研究結(jié)果一致。抗氧化酶緩解氧化損傷，故未造成后續(xù)明顯滲透脅迫，PAL為呋喃香豆素生物合成上游的關(guān)鍵酶，MeJA激發(fā)其活性短期升高，繼而呋喃香豆素大量積累。POD與PAL在柄細(xì)胞中的變化優(yōu)先于葉細(xì)胞，這使得柄細(xì)胞活力受MeJA抑制后恢復(fù)更快且呋喃香豆素積累也更早。

與未加誘導(dǎo)的懸浮細(xì)胞相比，在培養(yǎng)周期第10天加入100 μmol·L-1MeJA誘導(dǎo)4 d的懸浮細(xì)胞中呋喃香豆素含量和產(chǎn)量有大幅提升（表1），花椒毒素和佛手柑內(nèi)酯提升幅度葉細(xì)胞大于柄細(xì)胞，但3種呋喃香豆素含量和產(chǎn)量均為柄懸浮細(xì)胞更大。與原植物葉柄相比誘導(dǎo)后柄懸浮細(xì)胞花椒毒素含量仍較低，但其增添了葉柄中原本沒(méi)有的佛手酚且佛手柑內(nèi)酯含量為原葉柄的39倍，故MeJA誘導(dǎo)的柄懸浮細(xì)胞可作為佛手酚和佛手柑內(nèi)酯的生產(chǎn)資源。

4討論

不加誘導(dǎo)子的明黨參懸浮細(xì)胞中呋喃香豆素含量很低，但經(jīng)MeJA誘導(dǎo)后增加十分顯著，說(shuō)明明黨參懸浮細(xì)胞本身具有很大的生產(chǎn)呋喃香豆素潛力，而MeJA直接或間接地激活了合成途徑一系列酶。Chen等[19]對(duì)高氏柴胡不定根的誘導(dǎo)研究也發(fā)現(xiàn)MeJA可上調(diào)苯丙素類(lèi)物質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)，從而進(jìn)一步合成香豆素等下游物質(zhì)。

原植株中佛手柑內(nèi)酯和花椒毒素含量明顯高于懸浮細(xì)胞，但原植物葉和葉柄中均未檢出佛手酚。這與細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)，分化與脫分化細(xì)胞中酶種類(lèi)及酶活力存在差異。呋喃香豆素的生物合成途徑中，補(bǔ)骨脂素在花椒毒酚合酶和佛手酚合酶的作用下分別轉(zhuǎn)化成花椒毒酚和佛手酚，繼而再分別合成花椒毒素和佛手柑內(nèi)酯[3031]。脫分化的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中各酶可能處于抑制狀態(tài)，因而呋喃香豆素含量較低，而分化的原植株細(xì)胞中佛手酚O甲基轉(zhuǎn)移酶活性可能較高，從佛手酚到佛手柑內(nèi)酯的步驟進(jìn)行的較為徹底，因此未檢出佛手酚。另一方面，原植物器官和懸浮細(xì)胞對(duì)MeJA處理的不同反應(yīng)可能也出于兩者細(xì)胞狀態(tài)的不同，懸浮細(xì)胞雖分別源于葉和葉柄，但都已處于脫分化的均一狀態(tài)，所以接受誘導(dǎo)后變化趨勢(shì)基本一致，而葉和葉柄作為完全分化的器官，根據(jù)各自功能的不同作出不同的反應(yīng)。

無(wú)論在原植物還是懸浮細(xì)胞中，經(jīng)MeJA誘導(dǎo)的花椒毒素含量上升幅度都不及佛手酚和佛手柑內(nèi)酯，說(shuō)明MeJA雖對(duì)多種植物次生代謝產(chǎn)物有效[17]，但也具一定選擇性。本實(shí)驗(yàn)中3種呋喃香豆素結(jié)構(gòu)相似，合成途徑相近，MeJA對(duì)三者誘導(dǎo)效果的差異還需從其誘導(dǎo)機(jī)制的細(xì)節(jié)上尋找原因，同時(shí)可繼續(xù)探尋對(duì)花椒毒素作用更明顯的誘導(dǎo)子。

MeJA濃度是影響誘導(dǎo)效果的重要因素，不同植物及培養(yǎng)體系所需最佳濃度有較大差異，主要從5 μmol·L-1至500 μmol·L-1不等，但以100 μmol·

本實(shí)驗(yàn)所用MeJA和已報(bào)道對(duì)誘導(dǎo)明黨參懸浮細(xì)胞呋喃香豆素有效的水楊酸[13]均為植物信號(hào)分子類(lèi)物質(zhì)，與防御相關(guān)的信號(hào)分子還包括寡聚糖、脫落酸、乙烯等[27]，可重點(diǎn)考察此類(lèi)物質(zhì)以進(jìn)一步尋找有效的誘導(dǎo)子。研究中誘導(dǎo)物質(zhì)多為一次性加入，可嘗試多次加入，研究可否產(chǎn)生疊加增效。誘導(dǎo)子間可產(chǎn)生互作，從而達(dá)到比單一使用更佳的效果[23]，可在尋得有效誘導(dǎo)子的基礎(chǔ)上，探索明黨參懸浮細(xì)胞中誘導(dǎo)子互作效應(yīng)，以期獲取更高產(chǎn)量的有效成分。

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