中藥肝毒性研究方法技術(shù)的新進(jìn)展及其應(yīng)用

宋捷+鐘榮玲++夏智++吳豪++仲青香++張振海+韋英杰++石子琪++封亮+賈曉斌

[摘要]中藥肝毒性問題受到了日益廣泛的重視。目前，肝細(xì)胞系、亞細(xì)胞、三維培養(yǎng)、模式動(dòng)物等體內(nèi)體外模型在中藥肝毒性的篩選中發(fā)揮著重要作用。隨著現(xiàn)代系統(tǒng)觀和整體論的引入，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)以及網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)等新方法開始逐步應(yīng)用于中藥肝毒性標(biāo)志物挖掘和肝毒性預(yù)警等方面。該文通過總結(jié)近年來中藥肝毒性研究領(lǐng)域的成果，分析和探討其中存在的主要問題，提出具有中醫(yī)藥特色的“結(jié)合病/證模型和網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)的中藥量效毒關(guān)系研究”的新思路，同時(shí)也對該課題組開展的淫羊藿潛在肝毒性的初步研究進(jìn)行了概述，希望能為中藥肝毒性的評(píng)價(jià)方法和技術(shù)指導(dǎo)原則提供理論基礎(chǔ)，推動(dòng)中藥肝毒性研究體系的發(fā)展與完善。

[關(guān)鍵詞]中藥肝毒性；病/證模型；量效毒；網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)；淫羊藿

肝臟是人體最大的“加工廠”，承擔(dān)著生物合成、代謝轉(zhuǎn)化以及分泌排泄等重要功能。藥物進(jìn)入體循環(huán)后，將經(jīng)過肝臟代謝，因此肝臟是藥源性損傷的主要靶器官之一。北京大學(xué)第一醫(yī)院王貴強(qiáng)教授[1]指出，403%的藥物性肝損傷為中草藥所致。何首烏、菊三七、補(bǔ)骨脂、番瀉葉、大黃等臨床常用中藥都已經(jīng)被證實(shí)具有一定的肝毒性，重視中藥肝毒性已是當(dāng)務(wù)之急。

2010年版《中國藥典》一部收載了中藥材及飲片2 165種，其中標(biāo)有毒性的只有83種，其中大毒10種，有毒42種，小毒31種。值得注意的是，本草古籍中提到的“毒”幾乎全部指的是急性毒性；古人對于藥物的慢性毒性認(rèn)識(shí)，是一個(gè)薄弱環(huán)節(jié)，不過這也是由時(shí)代的局限性所導(dǎo)致的。現(xiàn)階段臨床上治療心腦血管疾病和骨質(zhì)疏松等疾病的中成藥都需要長期服藥，這勢必對中藥的安全性評(píng)價(jià)提出了更高的要求。因此，有必要對部分典型中藥的安全性進(jìn)行再評(píng)價(jià)，對中藥的急性毒性、亞慢性毒性以及長期毒性有一個(gè)更為客觀和科學(xué)的認(rèn)識(shí)，明確其臨床使用的安全窗；建立符合中醫(yī)藥特點(diǎn)的毒性評(píng)價(jià)體系，為中藥的臨床用藥提供參考。

傳統(tǒng)的毒理學(xué)研究通常以動(dòng)物模型作為基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)周期較長，成本頗高。國際上常規(guī)的毒理學(xué)研究終點(diǎn)均因靈敏性、穩(wěn)定性和特異性較差無法成為肝毒性早期診斷的標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)有的臨床前體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的整體毒性預(yù)測率只有71%，有近30%的藥物毒性是現(xiàn)有的臨床前實(shí)驗(yàn)方法無法預(yù)測的。而隨著分子生物學(xué)和現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新技術(shù)和新模型已用于肝毒性的研究中，如干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞及亞細(xì)胞模型（快速、經(jīng)濟(jì)、直觀地反映出藥物對細(xì)胞及細(xì)胞器的影響），斑馬魚模型（檢測藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄過程），三維培養(yǎng)模型（模擬肝臟細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu)并維持代謝酶的活性），毒理基因組學(xué)，毒理蛋白質(zhì)組學(xué)（利用基因芯片和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)找出新的生物標(biāo)記物，構(gòu)建肝毒性數(shù)據(jù)庫），以上肝毒性檢測手段的涌現(xiàn)極大的豐富了中藥肝毒性評(píng)價(jià)體系的內(nèi)涵，有助于進(jìn)一步揭示中藥肝毒性的機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)中藥肝毒性的早期預(yù)警。鑒于此，筆者將針對近5年來國內(nèi)外肝毒性研究體系的進(jìn)展進(jìn)行綜述和分析。

1中藥肝毒性評(píng)價(jià)的新模型及其應(yīng)用

11常見的肝毒性評(píng)價(jià)細(xì)胞模型

常見的肝毒性篩選細(xì)胞系主要有人原代肝細(xì)胞，HepG2，L02，hiHeps，HepaRG細(xì)胞系等（表1）。HepG2細(xì)胞是最具有代表性和最常用的細(xì)胞系，細(xì)胞表面表達(dá)有豐富的IGFII受體，但是在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，細(xì)胞中功能性CYP450酶活很低，幾乎檢測不到。趙筱萍等[2]采用二乙酸熒光素?zé)晒鈽?biāo)記法在HepG2細(xì)胞模型上篩選木香中的肝毒性組分，結(jié)合GCMS聯(lián)用技術(shù)，發(fā)現(xiàn)木香中所含的去氫木香內(nèi)酯、珊塔瑪內(nèi)酯、瑞諾木烯內(nèi)酯、α木香醇和欖香醇具有一定的肝毒性；L02細(xì)胞是一種正常人胚胎肝細(xì)胞，能夠傳代培養(yǎng)，常用作化合物肝臟毒性的體外研究模型。Lin等[3]通過測定L02細(xì)胞的活力，LDH滲漏率，酶活力，并結(jié)合UPLCQTOFMS技術(shù)，辨析出何首烏的肝毒性主要和蒽醌類以及大黃素等密切相關(guān)；hiHeps細(xì)胞是由人胚胎成纖維細(xì)胞分化而來，CYP3A4，CYP1A2，CYP2B6，CYP2C9等代謝酶的活力和新鮮分離的肝原代細(xì)胞接近[4]；HepaRG細(xì)胞由人肝臟細(xì)胞分化而來，兼具肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的特性，功能酶（CYP450酶，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酶，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）相對完整，具有雙向分化能力。吳宇等[5]運(yùn)用6種聯(lián)合探針標(biāo)記HepaRG細(xì)胞，雙氯芬酸鈉、鹽酸丁螺環(huán)酮等藥物的毒性充分體現(xiàn)，氧化應(yīng)激、線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及鈣穩(wěn)態(tài)等指標(biāo)的靈敏度也高于hiHeps，HepG2和L02細(xì)胞，提示HepaRG可作為高內(nèi)涵細(xì)胞組學(xué)體外模型進(jìn)行藥物肝毒性篩選。

12干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞模型

121人胚胎干細(xì)胞模型由人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞（human embryonic stem cellderived hepatocytes，hESCHep）建立的肝毒性評(píng)價(jià)體系，具有實(shí)驗(yàn)周期短、用藥量少和有效避免種屬差異等優(yōu)點(diǎn)。hESC誘導(dǎo)分化3周即形成均一的、純度較高的肝樣細(xì)胞，具有肝細(xì)胞典型的形態(tài)結(jié)構(gòu)并且可以檢測到CYP450酶、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1、消除轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BSEP以及肝細(xì)胞特異性蛋白，如胞內(nèi)酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和分泌白蛋白等的表達(dá)[67]。目前，該技術(shù)僅被少數(shù)實(shí)驗(yàn)室掌握，價(jià)格不菲，但其為肝毒性評(píng)價(jià)體系的完善提供了一個(gè)全新的方向。

122人多潛能干細(xì)胞模型誘導(dǎo)人多潛能干細(xì)胞分化成肝細(xì)胞（human induced pluripotent stem cellsderived hepatocytes，hiPSCHep），用凝膠固定培養(yǎng)，并將其與鼠胚胎成纖維細(xì)胞（3T3J2）、基質(zhì)膠共培養(yǎng)建立微型圖像化共培養(yǎng)平臺(tái)（iMPCC），該體系可促進(jìn)hiPSCHep的成熟并使其壽命延長至4周。hiPSCHep可應(yīng)用于肝毒性的預(yù)測以及肝極性、白蛋白含量、P450酶活的檢測[8]。Sullivan團(tuán)隊(duì)[9]誘導(dǎo)hiPSCs分化出具有肝臟功能的人肝內(nèi)胚層，發(fā)現(xiàn)其可以用于藥物毒性的篩選，以及CYP1A2和CYP3A4酶活的研究。Takayama等[10]建立了hiPSCHep的三維球體培養(yǎng)體系（3D hiPSCHep），采用WST8法檢測肝毒性藥物對細(xì)胞活力的影響，氯氮平、硝苯呋海因、他克林等藥物作用后，3D hiPSCHep組的細(xì)胞活力均明顯低于3D HepG2組，提示該模型的靈敏度要優(yōu)于3D HepG2模型，更適用于肝毒性的早期篩選。

13亞細(xì)胞——高內(nèi)涵分析

細(xì)胞經(jīng)毒物作用受損或死亡時(shí)，其內(nèi)部則表現(xiàn)為細(xì)胞器的損傷或病變，如線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的損傷。熒光成像技術(shù)和高內(nèi)涵分析（high content analysis，HCA）在亞細(xì)胞水平的篩選中應(yīng)用日益廣泛[11]。目前HCA能夠?qū)崟r(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測體外肝細(xì)胞毒性的多個(gè)參數(shù)、毒理學(xué)機(jī)制相關(guān)的多個(gè)重要的標(biāo)志分子，主要包括細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)與數(shù)量、線粒體膜電位、氧化應(yīng)激及DNA損傷，是評(píng)估和預(yù)測候選藥物肝毒性的高效手段。Fu等[12]利用分離的大鼠線粒體和雷公藤甲素（triptolide，TP）共同孵育，發(fā)現(xiàn)TP可濃度依賴性的誘導(dǎo)線粒體的腫脹，增加線粒體滲透性，最終導(dǎo)致線粒體損傷。Wang等[13]運(yùn)用4種探針（羅丹明123，Hoechst33342，表1常見的肝毒性評(píng)價(jià)模型

Table 1Hepatotoxicity evaluation models

體外模型優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)人原代肝細(xì)胞較好的體內(nèi)外相關(guān)性，具有完整的代謝酶表達(dá)系統(tǒng)，適用于酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)分離復(fù)雜費(fèi)時(shí)，存活時(shí)間短，部分CYP450 亞酶的表達(dá)量丟失，無法維持肝細(xì)胞的極性和代謝功能HepG2最具有代表性和最常用的細(xì)胞系，易于培養(yǎng)CYP450酶活很低，幾乎檢測不到L02是一種正常人胚胎肝細(xì)胞，具有典型的肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，常用于檢測細(xì)胞活力、LDH滲漏率酶表達(dá)量低而且難于誘導(dǎo)hiHeps來源于人胚胎成纖維細(xì)胞，有成熟肝細(xì)胞的特性，代謝酶的活力和新鮮分離的肝原代細(xì)胞接近，兼具膽汁排泄的功能僅表達(dá)出部分的酶亞型；價(jià)格昂貴，難以獲得HepaRG靈明度高，可進(jìn)行肝毒性高內(nèi)涵篩選，功能酶表達(dá)完整，雙向分化能力細(xì)胞培養(yǎng)基較為特殊，價(jià)格不菲hESCHep實(shí)驗(yàn)周期短、用藥量少、避免種屬差異，可以檢測到CYP450酶、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1、消除轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BSEP以及肝細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)hESC技術(shù)仍存在瓶頸，且僅被少數(shù)實(shí)驗(yàn)室掌握hiPSCHep可應(yīng)用于肝毒性的預(yù)測以及肝極性、白蛋白含量、P450酶活的檢測誘導(dǎo)分化培育出的肝細(xì)胞只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室可以完成，價(jià)格不菲亞細(xì)胞（高內(nèi)涵分析）實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測體外肝細(xì)胞毒性的多個(gè)參數(shù)、毒理學(xué)機(jī)制相關(guān)的多個(gè)重要的標(biāo)志分子檢測敏感性和熒光探針對細(xì)胞活性的影響等方面有許多有待解決的技術(shù)難題精密肝切片包含肝組織內(nèi)的所有類型的細(xì)胞，維持了肝腺泡功能和結(jié)構(gòu)的完整性，在生化和生理功能上與活體肝相似，可在早期快速、高效的識(shí)別藥物改變脂質(zhì)代謝以及膽汁酸淤積藥物不容易滲透到切片的內(nèi)部，而且切片中心的細(xì)胞容易壞死；切片用的儀器很昂貴“三明治”模型同時(shí)擁有肝細(xì)胞形態(tài)和膽管的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，維持外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能性表達(dá)，可檢測到白蛋白、纖維蛋白原、轉(zhuǎn)鐵蛋白和尿素的表達(dá)原代肝細(xì)胞存活時(shí)間較短凝膠包埋肝細(xì)胞模型模擬體內(nèi)細(xì)胞間微環(huán)境，保證代謝功能的長期維持肝細(xì)胞長期、高密度、高活性的培養(yǎng)方法有待進(jìn)一步的改進(jìn)微型中空纖維生物反應(yīng)器細(xì)胞生長密度高、抗剪切力強(qiáng)、細(xì)胞活性好、細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長，合成產(chǎn)物易于提取，其中凝膠可為肝細(xì)胞提供三維立體支持作用生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)和材料有待進(jìn)一步優(yōu)化斑馬魚模型幼魚魚體透明，可直接觀察肝臟顏色、大小、膽汁淤積情況；肝臟中有許多與哺乳動(dòng)物同源的脂質(zhì)代謝酶，包括HMGCoA合成酶、裂解酶幼魚給藥方式多為藥浴，和臨床劑量沒有直接的換算關(guān)系

宋捷等：中藥肝毒性研究方法技術(shù)的新進(jìn)展及其應(yīng)用碘化丙啶，mitotracker）聯(lián)合標(biāo)記HepG2細(xì)胞，研究4種中藥注射液的肝毒性。使用HCA技術(shù)以及熒光顯微成像快速、敏感、高效的區(qū)分出了一種可能引起線粒體損傷的中藥注射液（Fufang Kushen），所得結(jié)論和小鼠的亞急性毒性試驗(yàn)結(jié)果一致。肖小河團(tuán)隊(duì)[14]采用HCA二重探針標(biāo)記法，檢測何首烏與茯苓、甘草、三七在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上的配伍減毒情況，研究發(fā)現(xiàn)何首烏對肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的損傷呈劑量依賴性，分別配伍不同濃度的茯苓、甘草、三七都有顯著的減毒作用。其中，何首烏配伍茯苓減毒的效果較好，甘草次之，三七稍差。

14三維培養(yǎng)模型

141精密肝切片精密肝切片（precisioncut liver slice，PCLS）技術(shù)是介于器官與細(xì)胞水平之間的體外培養(yǎng)技術(shù)，可包含肝組織內(nèi)的所有類型的細(xì)胞，維持了肝腺泡功能和結(jié)構(gòu)的完整性，在生化和生理功能上與活體肝相似，近年來已應(yīng)用于肝毒性的研究。PCLS模型可以在早期快速、高效的識(shí)別藥物改變脂質(zhì)代謝以及膽汁酸淤積的機(jī)制。Mukazayire等[15]使用PCLS模型簡單、快速的區(qū)分出了3種致肝毒性的盧旺達(dá)草藥，提示PCLS可用于大樣本的肝毒性篩選研究。Vatakuti等[16]通過大鼠PCLS技術(shù)研究了四氯化碳的肝毒性，運(yùn)用微陣列分析監(jiān)測mRNA的早期變化、轉(zhuǎn)基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)測定αB晶狀蛋白、絲氨酸蛋白酶抑制劑的表達(dá)，最終發(fā)現(xiàn)了四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化的早期標(biāo)志物。回連強(qiáng)等[17]將不同濃度的野百合堿與肝切片共同孵育24 h后，乳酸脫氫酶（LDH）的含量顯著上升，蛋白水平下降，表明野百合堿會(huì)誘發(fā)一定的肝毒性。Szalowska等[1819]對具有潛在肝毒性藥物進(jìn)行了篩選，用四環(huán)素、丙戊酸、碘胺酮與小鼠PCLS共同孵育，經(jīng)DNA微陣列基因轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)碘胺酮和丙戊酸是過氧化物酶體增殖物激活受體PPARα/（β/δ）/γ的激動(dòng)劑。

142“三明治”模型通過循環(huán)灌流法分離大鼠原代肝細(xì)胞，將其置于雙層膠原之間培養(yǎng)，可建立“三明治”培養(yǎng)模型（sandwichcultured rat hepatocytes，SCRH）。傳統(tǒng)的原代肝細(xì)胞培養(yǎng)方式無法維持肝細(xì)胞的極性和代謝功能，而SCRH可同時(shí)擁有肝細(xì)胞形態(tài)和膽管的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，維持外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能性表達(dá)，培養(yǎng)3個(gè)月均可檢測到白蛋白、纖維蛋白原、轉(zhuǎn)鐵蛋白和尿素的表達(dá)[20]。膽汁淤積性肝損傷在藥源性肝損傷中占有較高的比率（>30%），各種膽汁酸是膽汁淤積性肝損傷的主要損傷因素，可直接破壞細(xì)胞脂質(zhì)膜，甚至誘發(fā)細(xì)胞凋亡，同時(shí)介導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤，促進(jìn)肝臟炎癥反應(yīng)。因此闡明膽汁淤積的相關(guān)機(jī)制是中藥肝毒性研究的重要方向。SCRH已成為研究膽汁淤積和代謝酶誘導(dǎo)相互作用的主要工具之一。Zhuang等[21]研究發(fā)現(xiàn)Pgp抑制劑利托那韋顯著減少了大鼠SCRH模型中雷公藤甲素（TP）的膽汁清除率，同時(shí)Pgp誘導(dǎo)劑明顯增加了TP的膽汁清除率，提示膽小管膜表面表達(dá)的Pgp和TP可能會(huì)發(fā)生相互作用。Shen等[22]運(yùn)用SCRH模型研究TP肝毒性的機(jī)制，結(jié)果顯示CYP3A4誘導(dǎo)劑可以減輕TP的肝毒性，而抑制劑會(huì)加劇TP的肝毒性，推測CYP3A4介導(dǎo)的TP的代謝途徑有可能是其解毒的機(jī)制。

143凝膠包埋肝細(xì)胞模型凝膠包埋肝細(xì)胞模型是一種三維擬組織化的體外肝細(xì)胞培養(yǎng)方式，可模擬藥物體內(nèi)作用情況。單層貼壁培養(yǎng)的肝細(xì)胞很快喪失肝分化功能，不能較好地反映肝臟脂質(zhì)代謝情況。凝膠包埋肝細(xì)胞模型可以較好的模擬體內(nèi)細(xì)胞間微環(huán)境，保證代謝功能的長期維持，孟琴團(tuán)隊(duì)[23]研究發(fā)現(xiàn)非諾貝特和平板培養(yǎng)肝細(xì)胞共孵育時(shí)，脂肪堆積和氧化壓力均不明顯，而凝膠培養(yǎng)肝細(xì)胞卻表現(xiàn)出與體內(nèi)相符的毒性反應(yīng)，ROS和MDA等氧化應(yīng)激標(biāo)志物上升，過量脂質(zhì)和脂肪堆積。因此，凝膠包埋培養(yǎng)細(xì)胞比單層培養(yǎng)細(xì)胞對藥物的肝毒性更為敏感。該團(tuán)隊(duì)還在此模型上驗(yàn)證了利福平、四環(huán)素和硫唑嘌呤等20種藥物的肝毒性[2425]。

144微型中空纖維生物反應(yīng)器由具有活性和功能的肝細(xì)胞以及可供細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器構(gòu)成，將肝細(xì)胞置于生物反應(yīng)器內(nèi)，藥物通過半透膜與肝細(xì)胞進(jìn)行生化作用[26]。沈沖等[27]證實(shí)該模型比單層培養(yǎng)肝細(xì)胞對對乙酰氨基酚毒性更敏感，這可能是因?yàn)橹锌绽w維凝膠反應(yīng)器具有較高的肝藥酶活性。此外，在中空纖維反應(yīng)器中，甘草和甘草酸也體現(xiàn)了一定的保肝作用。

15肝損傷潛在血清生物標(biāo)志物

新的肝損傷生物標(biāo)志物，如精氨酸酶、血清F蛋白、嘌呤核苷磷酸化酶、蘋果酸脫氫酶等[28]雖然受到了廣泛關(guān)注，然而它們與ALT，AST一樣，都是容易失去活性的蛋白質(zhì)，而且敏感性和特異性有待進(jìn)一步考證，從而限制了其臨床應(yīng)用。近年來，血清微小RNA（miRNA）為毒性的診斷開辟了一條新途徑。有學(xué)者對19種具有潛在肝臟毒性的中草藥進(jìn)行臨床前安全性評(píng)價(jià)，在觀測體重、攝食量、血清生化指標(biāo)、臟器系數(shù)與肝臟組織病理學(xué)改變的同時(shí)，探討miRNA作為新型候選標(biāo)志物在中草藥肝損傷診斷中的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果表明：與溶劑對照組相比，血清miRNA122水平顯著升高的給藥組有6組，而ALT和AST水平顯著升高的分別為2組和3組，其中五倍子組表現(xiàn)為急性藥源性肝損傷。在血清miRNA122的時(shí)間相關(guān)性和劑量相關(guān)性分析中，與血清ALT和AST相比，血清miRNA122呈現(xiàn)出更高的敏感性，表現(xiàn)為更早期和更大幅度的顯著升高。說明血清miRNA122作為中草藥肝損傷的新型候選診斷標(biāo)志物，為中草藥臨床前安全性評(píng)價(jià)提供了新的參考依據(jù)。肖小河團(tuán)隊(duì)通過SIMCAP11軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLSDA），發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶等傳統(tǒng)肝功能指標(biāo)對生何首烏肝損傷作用不敏感，而血清直接膽紅素，膽紅素含量可在早期反映出何首烏引起的肝損傷[29]。毒理基因組學(xué)的快速發(fā)展也為肝毒性生物標(biāo)志物的研究提供了新的技術(shù)手段。

16模式動(dòng)物斑馬魚模型

斑馬魚是一種脊椎動(dòng)物，與人類基因的相似度達(dá)87%，其信號(hào)傳導(dǎo)通路與人類基本近似。斑馬魚胚胎透明，利于直接觀察臟器的形態(tài)。斑馬魚最大限度地保留哺乳動(dòng)物代謝的系統(tǒng)性，能體現(xiàn)Ⅰ相、Ⅱ相、腸菌及多途徑代謝的綜合結(jié)果，同時(shí)肝臟中有許多與哺乳動(dòng)物同源的脂質(zhì)代謝酶，包括HMGCoA合成酶、HMGCoA裂解酶和PPAR [30]。目前斑馬魚已被美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）列為繼人和小鼠之后的第三大模式生物。2012年，輝瑞、默克和強(qiáng)生聯(lián)合發(fā)表了一篇綜述文章，肯定了斑馬魚模型在早期肝毒性篩選中的作用[31]。斑馬魚模型篩查肝毒性具有以下特色與優(yōu)勢：①靈敏度高，藥物質(zhì)量濃度單位μg·L-1至mg·L-1，尤其適用于中藥微量成分肝毒性的評(píng)估；②高通量，實(shí)驗(yàn)在微孔板進(jìn)行，適合批量篩選；③簡單、高效，周期約為7～9 d[32]。正常斑馬魚肝組織清晰，He等[33]用解剖顯微鏡觀察用四環(huán)素、丙戊酸、紅霉素等肝毒性藥物處理后的斑馬魚發(fā)現(xiàn)，肝組織明顯變灰暗，并伴隨卵黃囊腫大。張?jiān)频萚34]建立了肝臟標(biāo)記熒光的轉(zhuǎn)基因（LFABP：EGFP）斑馬魚幼魚，通過熒光顯微鏡觀察對乙酰氨基酚的肝毒性。幼魚成活率呈時(shí)間和劑量依賴性，對乙酰氨基酚組的幼魚肝組織熒光強(qiáng)度明顯弱于對照組，肝臟形態(tài)異常，肝臟顏色變暗，卵黃囊腫大。以上結(jié)果證明了斑馬魚模型用于肝毒性快速評(píng)價(jià)的實(shí)用性。斑馬魚取血通常采用背主動(dòng)脈橫切法（lateral incision），取血量少，對魚體積要求高，給實(shí)驗(yàn)操作帶來諸多不便。國外學(xué)者Vliegenthart[35]首次嘗試后眼窩取血法，取血量翻倍，并且成功應(yīng)用于斑馬魚血清miR122的檢測。

2具有中醫(yī)藥特點(diǎn)的肝毒性評(píng)價(jià)體系的初步構(gòu)建

安全是有效的前提，中藥毒性評(píng)價(jià)及合理制用方法對學(xué)科和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要性不言而喻。然后，當(dāng)前中藥肝毒性評(píng)價(jià)的認(rèn)識(shí)理念和技術(shù)方法還不夠完備，尚未形成一套符合中醫(yī)藥特點(diǎn)的、兼容并蓄的現(xiàn)代中藥肝毒性評(píng)價(jià)及合理制用方法體系，已成為制約中藥臨床療效發(fā)揮、安全用藥的關(guān)鍵瓶頸問題。

21系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)在中藥安全性評(píng)價(jià)領(lǐng)域的應(yīng)用

過去中藥毒性評(píng)價(jià)主要運(yùn)用病理學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)等技術(shù)對毒性靶點(diǎn)進(jìn)行研究，其研究結(jié)果之間關(guān)聯(lián)性薄弱，難以凝練出毒性的核心靶點(diǎn)。2007年英國學(xué)者Hopkins首次提出了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，以網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)，繪制藥物靶點(diǎn)疾病三者之間的關(guān)系圖。而基于組學(xué)技術(shù)的系統(tǒng)生物學(xué)的深入研究也加速了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展。范驍輝等[36]把系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有機(jī)結(jié)合，提出了“網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)”的概念，即通過整合網(wǎng)絡(luò)搜索算法和毒性預(yù)測方法等相關(guān)軟件，把已有的中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)和毒理相關(guān)數(shù)據(jù)有機(jī)結(jié)合，建立可靠的毒理基因組學(xué)、毒理蛋白質(zhì)組學(xué)等網(wǎng)絡(luò)庫，從而為藥物毒性評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)具有整體觀的優(yōu)勢，它的出現(xiàn)無疑為中藥這一復(fù)雜體系毒性的研究提供了一種可行的思路。把這種研究模式與體外毒性篩選系統(tǒng)相結(jié)合，將能夠更全面、精確地預(yù)測和篩選有毒中藥的毒性。 211基因組學(xué)基因芯片，又稱為DNA微陣列，是由大量DNA或寡聚核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，可用于高通量監(jiān)測肝毒性基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜的變化。Luckert等[37]應(yīng)用高密度基因表達(dá)譜芯片技術(shù)初步探討了4種吡咯里西啶生物堿（藍(lán)薊定、天芥菜堿、千里光寧、千里光堿）的肝毒機(jī)制，結(jié)果提示吡咯里西啶生物堿可能通過改變脂質(zhì)代謝與膽汁酸流動(dòng)，以及抑制FXR，LXR，SREBF1/2和PPARα/γ/δ等轉(zhuǎn)錄因子而產(chǎn)生肝毒性。Panigrahi等[38]在研究決明子Cassia occidentalis種子時(shí)利用基因微陣列對比分析大鼠肝臟基因的表達(dá)譜，研究表明當(dāng)大鼠飼料中添加05%～20%的決明子種子時(shí)，與氧化應(yīng)激、異生物質(zhì)代謝、凋亡等相關(guān)的基因表達(dá)失調(diào)，推測決明子種子的肝毒性可能和Ⅰ相代謝酶（甲氧基異酚惡唑O脫乙基酶）和Ⅱ相代謝酶（谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶）被抑制有關(guān)。

212蛋白質(zhì)組學(xué)毒理蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥肝毒性方面的應(yīng)用主要是通過比較肝臟在藥物作用前后的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，在離體水平上更快、更準(zhǔn)地篩選出毒性物質(zhì)，并用于標(biāo)志物和毒靶研究。Wei等[39]運(yùn)用定量蛋白組學(xué)的方法尋找大鼠口服梔子苷后肝臟中的差異表達(dá)蛋白，進(jìn)行圖像灰度分析，候選出5個(gè)生物標(biāo)志物，其中2個(gè)標(biāo)志物甘胺酸甲基轉(zhuǎn)移酵素和磷酸化酶比傳統(tǒng)的標(biāo)志物更早的預(yù)測出梔子苷的肝毒性。

213代謝組學(xué)肝毒性藥物通過破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能導(dǎo)致內(nèi)源性物質(zhì)的穩(wěn)態(tài)被破壞，代謝組學(xué)技術(shù)通過監(jiān)測內(nèi)源性代謝物的動(dòng)態(tài)譜，可快速篩選出表征肝毒性的生物標(biāo)志物，尤其適用于多通路多靶點(diǎn)的中藥肝毒性復(fù)雜體系的研究。有學(xué)者從疑似何首烏肝中毒的患者血清中篩選出4個(gè)與肝損傷相關(guān)的標(biāo)志物。何首烏灌胃第4周ALT和AST才有顯著性改變；而上述代謝標(biāo)志物在給藥1周后不同組別間即有顯著差異，可為臨床早期診斷何首烏肝損害提供參考[40]。

214網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)中藥肝毒性的發(fā)生很可能是多靶點(diǎn)、多途徑的，這種復(fù)雜毒性機(jī)制正好和網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)的優(yōu)勢相契合?？蓮臄?shù)據(jù)庫中抽提出中藥毒性靶器官的信息，借助可視化工具（Pajek，Cytoscape等）構(gòu)建有毒中藥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。比如，由范驍輝研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)的基于全基因組學(xué)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)庫LTMap（http：//tcmzjueducn/ltmap），主要用于肝毒性的預(yù)測，已收錄20 123例基因芯片的生物學(xué)信息[41]。此外還有LiverTox，TGGATEs，CTD，TOXNET等肝毒性相關(guān)數(shù)據(jù)庫 [4243]。

雖然現(xiàn)階段已涌現(xiàn)出豐富的毒性數(shù)據(jù)庫，但筆者認(rèn)為，在運(yùn)用西方醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建中藥毒性網(wǎng)絡(luò)的同時(shí)應(yīng)充分結(jié)合中醫(yī)證候的特點(diǎn)；在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，更好地開展中藥肝毒性的研究。

22以病/證模型為基礎(chǔ)詮釋中藥肝毒性

中藥毒性的有無、大小均與機(jī)體的狀態(tài)（即病/證）有關(guān)，即所謂的“有病就病受，無病則體受”。而根據(jù)中醫(yī)“有故無殞”藥物毒性理論，有毒中藥只要使用對證，其毒性自然降低。熟大黃對健康大鼠具有一定的肝毒性作用，ALT，AST呈劑量依賴的增高趨勢，肝臟病理切片顯示大鼠出現(xiàn)纖維化改變，但對于四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷具有顯著的護(hù)肝作用，在一定程度上驗(yàn)證了“有故無殞”之說和辨證用藥減毒的科學(xué)性[44]。與正常動(dòng)物比較，附子對寒證小鼠的LD50明顯升高；附子對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）大鼠及RA+寒證大鼠心臟毒性的TD50明顯升高；附子對RA+寒證大鼠（藥證相符）的心臟毒性明顯低于RA+熱證大鼠（藥證不符）。在病/證狀態(tài)下，附子的毒性呈降低趨勢，藥效呈上升趨勢，提示證候毒性藥效之間存在一定的相關(guān)性[45]。但目前絕大多數(shù)有毒中藥的安全劑量、毒性靶器官、中毒劑量等毒性信息源于生理狀態(tài)的正常動(dòng)物，并未涉及病理狀態(tài)（包括病、證）對其毒性的影響，與臨床實(shí)際應(yīng)用有明顯差異。因此，以疾病為基礎(chǔ)、結(jié)合中醫(yī)證候分類理論，能夠使中藥肝毒性評(píng)價(jià)更具針對性，也符合中醫(yī)診療的實(shí)踐過程與理論特色，為闡明量毒效關(guān)系和作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

23“組分結(jié)構(gòu)理論”為中藥量效毒關(guān)系的研究提供了一種新的思路

中藥重視“君臣佐使，七情和合”的組合形式，在辨證論治的基礎(chǔ)上，整體把握病因以及疾病的發(fā)展變化規(guī)律，利用多味中藥協(xié)調(diào)配合實(shí)現(xiàn)扶正祛邪的目的，從而使紊亂的機(jī)體系統(tǒng)調(diào)節(jié)至平衡狀態(tài)。古人曾有“中醫(yī)不傳之秘在于量”之說，這種“量”的特征恰恰就是臨床治療窗安全范圍的關(guān)鍵所在。某種成分可能在過量的情況下激活其他環(huán)節(jié)導(dǎo)致毒性，也可能在微量的情況下激活靶點(diǎn)的協(xié)同基因而增強(qiáng)藥效。

有學(xué)者提出劑量是調(diào)控毒效關(guān)系的最重要因素，尋找療效最大、毒性最小的最佳劑量是確定臨床安全窗的重點(diǎn)。但是筆者認(rèn)為中藥是一個(gè)復(fù)雜體系，僅從劑量的角度不足以詮釋中藥“量”的獨(dú)特內(nèi)涵。藥味的比例不同、單味藥物質(zhì)基礎(chǔ)組成結(jié)構(gòu)的差異，都可能產(chǎn)生無效或毒性的顯著差別。中藥物質(zhì)基礎(chǔ)“組分結(jié)構(gòu)理論”中描述到中藥是多成分構(gòu)成的，這些成分并不是簡單地堆積，活性成分按照理化及藥理性質(zhì)分為不同組分，可以有生物堿、皂苷、黃酮組分等，在生物堿組分內(nèi)又分為苦參堿、吳茱萸堿等，單體成分作為基本功能單位；這些成分在組分內(nèi)以及組分間都有一定的組成和量比關(guān)系，即結(jié)構(gòu)特征，通過多靶點(diǎn)、多層次、多途徑的整合產(chǎn)生藥效。對于毒性，也存在同樣的調(diào)控方式，只是這種調(diào)控超出了原有的平衡范圍。不同的物質(zhì)基礎(chǔ)組成在產(chǎn)生藥效作用的同時(shí)，也同樣產(chǎn)生了毒性作用。例如，關(guān)于澤瀉的腎毒性，一直存在不小的爭議，同品種但不同產(chǎn)地的澤瀉存在毒性差異[4648]，可能是成分的量比關(guān)系導(dǎo)致了毒性的差異。有學(xué)者開展了柴胡水/醇提物的毒性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其毒性較低（表現(xiàn)為ALT和AST的升高），但肝臟未見明顯的病理變化。對上市中藥小柴胡顆粒進(jìn)行毒性再評(píng)價(jià)，同樣沒有觀察到明顯的肝毒性。但其主要成分柴胡皂苷d、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2均可抑制肝細(xì)胞生長，作用強(qiáng)度為d>a>b2。在胃酸的作用下柴胡皂苷d易轉(zhuǎn)化為b2，而柴胡皂苷b2的毒性明顯低于d [49]。雖然柴胡的安全劑量遠(yuǎn)大于臨床常用量，但其潛在的肝毒性不容忽視。加強(qiáng)柴胡藥材的質(zhì)控，明確皂苷組分量效毒的關(guān)系對于臨床安全用藥尤為重要。因此，“組分結(jié)構(gòu)理論”為解釋中藥毒性差異提供了理論依據(jù)，也為進(jìn)一步揭示毒性機(jī)制提供了切實(shí)可行的思路和方法。

24結(jié)合網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)和病/證模型的中藥量效毒研究思路的探討

機(jī)體是一個(gè)復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)，中醫(yī)“證候”可能是蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)和基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)被“擾動(dòng)”后所發(fā)生的一種特異性變化狀態(tài)。而中藥的有效性或毒性與其對生物網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)的干預(yù)有關(guān)?；凇敖M分結(jié)構(gòu)”理論，中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)是一個(gè)多維多層次的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在組分間以及組分內(nèi)都有相對確定的組成和量比關(guān)系。不同的組分/成分驅(qū)動(dòng)體內(nèi)相互關(guān)聯(lián)的若干靶點(diǎn)群，當(dāng)所產(chǎn)生的靶點(diǎn)效應(yīng)被過度放大或調(diào)節(jié)失衡就有可能導(dǎo)致毒性效應(yīng)。這種毒性效應(yīng)，表現(xiàn)在靶器官靶組織靶分子損害的多個(gè)層次，呈現(xiàn)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)特征。網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)是從“點(diǎn)（生物靶分子）線（途徑）面（網(wǎng)絡(luò)）”多個(gè)水平說明中藥毒性事件鏈構(gòu)成及其因果關(guān)系，避免以往單純的化學(xué)藥品或者簡單的天然藥物“一對一”的理論模式的不足，即一種藥物引起一種毒效應(yīng)或一種靶分子改變。結(jié)合了病/證模型的網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)則是在中藥干預(yù)對證機(jī)體過程中收集生物學(xué)信息，同時(shí)結(jié)合毒性相關(guān)數(shù)據(jù)庫，整合信息之間的相互關(guān)系，以此構(gòu)建與證候標(biāo)志物、毒性標(biāo)志物關(guān)聯(lián)的中藥成分毒性靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。所構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)，通過網(wǎng)絡(luò)映射、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析、網(wǎng)絡(luò)聚類等方法從宏觀層次分析中藥毒性產(chǎn)生的機(jī)制。

研究人員逐漸認(rèn)識(shí)到網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)和病/癥模型在中藥毒性研究中的重要性，嘗試著將兩者結(jié)合運(yùn)用到肝毒性的考察中。譚勇等[50]采用“氫化可的松造模法”建立腎陽虛證大鼠模型考察白附片對正常和腎陽虛大鼠的肝毒性差異。中醫(yī)認(rèn)為制附子入腎經(jīng)、具有補(bǔ)火助陽的功效，這就可以解釋同等劑量下白附片對正常大鼠的肝毒性更突出，在腎陽虛大鼠中肝毒性顯著緩和。代謝組學(xué)的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，氧化磷酸化、氨基酸和脂質(zhì)代謝異常是白附片干預(yù)2種狀態(tài)大鼠代謝輪廓的差別所在。

基于上述的毒性評(píng)價(jià)技術(shù)和體系，本課題組也初步探索了臨床常用中藥淫羊藿的肝毒性機(jī)制。近年來，傳統(tǒng)認(rèn)為無毒的補(bǔ)益類中藥淫羊藿的毒副作用屢見報(bào)端。文獻(xiàn)報(bào)道淫羊藿總黃酮沒有明顯的長期毒性[51]，最大耐受量實(shí)驗(yàn)顯示小鼠口服淫羊藿總黃酮最大耐受量相當(dāng)于人臨床日用量的1 440倍，提示淫羊藿總黃酮急性毒性很小[52]。但也有極個(gè)別文獻(xiàn)提及到淫羊藿的肝毒性，如，給藥3 d小鼠即出現(xiàn)嘔吐、納差、活動(dòng)減少，給藥15 d處死，可見肝臟脂肪變性，該作者同時(shí)推測淫羊藿的雄激素樣作用和肝毒性密切相關(guān)[53]。此外，中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院王停教授提出“基于基原用藥部位工藝劑量療程結(jié)合數(shù)學(xué)方法對淫羊藿肝毒性的研究”，該項(xiàng)目獲得了2013年國家自然科學(xué)基金的資助（81374056）。臨床上報(bào)道有肝毒性的中藥復(fù)方中，仙牛健骨顆粒、壯骨關(guān)節(jié)丸、仙靈骨葆膠囊中均含有淫羊藿。本實(shí)驗(yàn)室基于斑馬魚模型也證實(shí)淫羊藿總黃酮高劑量組有一定的毒性。以上種種跡象提示淫羊藿可能是肝毒性的誘因?！侗静菥V目》中記載：淫羊藿，性溫不寒，能益精氣，真陽不足者宜之，陰虛而相火易動(dòng)者忌服。中醫(yī)強(qiáng)調(diào)辨證論治，以中醫(yī)證候分類理論為基礎(chǔ)，能夠使淫羊藿肝毒性評(píng)價(jià)更具針對性。課題組既往采用代謝組學(xué)技術(shù)，運(yùn)用正交偏最小二乘判別分析法研究了淫羊藿生品與炮制品對腎陽虛大鼠血漿代謝譜的影響。結(jié)果表明淫羊藿生品和炮制品干預(yù)后大鼠血漿代謝譜的軌跡均向正常組趨近，與淫羊藿生品組相比，炙淫羊藿能更好地調(diào)節(jié)腎陽虛大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)代謝紊亂并使其回歸至正常，初步揭示了炙淫羊藿補(bǔ)腎壯陽的增效機(jī)制[54]。不同病/證狀態(tài)下藥物的ADME差異性決定了有毒中藥毒性的差異性，鑒于此，課題組對比了淫羊藿總黃酮在正常大鼠和骨質(zhì)疏松模型大鼠中的代謝差異，淫羊藿總黃酮在骨質(zhì)疏松大鼠的腸道菌群和十二指腸酶中的水解速率明顯慢于正常大鼠，預(yù)示著其吸收和代謝進(jìn)程也變緩慢，為后續(xù)的毒性研究和臨床應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)和設(shè)計(jì)依據(jù)。

3結(jié)語

近年來，現(xiàn)代科技迅速發(fā)展，各種質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及核磁技術(shù)的應(yīng)用使得國內(nèi)外對中藥肝毒性的機(jī)制研究不斷深入，已逐漸由整體動(dòng)物模型研究向細(xì)胞、分子水平延伸，并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建了毒性中藥數(shù)據(jù)庫，取得了一定的研究進(jìn)展。在藥物研發(fā)的早期階段，肝細(xì)胞、亞細(xì)胞和三明治培養(yǎng)等體外模型、模式動(dòng)物斑馬魚等新的研究方法在肝毒性的高通量篩選中發(fā)揮著舉足輕重的作用。盡管體外模型不能完全等同于體內(nèi)模型，但是其高效的優(yōu)勢是體內(nèi)模型不具備的。同時(shí)，它可以減少動(dòng)物的使用量和實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，縮短實(shí)驗(yàn)周期，為從事藥物開發(fā)的研究者提供科學(xué)的依據(jù)。而系統(tǒng)生物學(xué)因其特有的整體觀優(yōu)勢，在中藥肝毒性研究領(lǐng)域也有著廣闊的應(yīng)用前景，可用于肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)的辨析、毒性規(guī)律的探究，并為毒性標(biāo)志物的篩選、毒性預(yù)測以及毒性數(shù)據(jù)庫的建立奠定了基石。因此，建立恰當(dāng)?shù)淖C候?qū)?yīng)的整體動(dòng)物模型，從量效毒關(guān)系研究入手，采用代謝組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論和技術(shù)詮釋有毒中藥對證控毒的科學(xué)內(nèi)涵，將有可能探索出中藥控毒研究的新思路與新方法。雖然網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)的發(fā)展為中醫(yī)藥肝毒性的系統(tǒng)研究開辟了嶄新的途徑，但目前存在的問題也是不容忽視的。比如網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)需要系統(tǒng)、真實(shí)、科學(xué)的數(shù)據(jù)庫作為支撐，以及不斷的動(dòng)物試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)等來驗(yàn)證和豐富。

[參考文獻(xiàn)]

[1]侯鳳琴，霍娜，劉霞，等. 慢性藥物性肝損傷33例臨床特點(diǎn)分析[J]. 中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2011，31（12）：941.

[2]趙筱萍，葛志偉，張玉峰，等. 川楝子中肝毒性成分的快速篩查研究[J]. 中國中藥雜志，2013，38（11）：1820.

[3]Lin L，Lin H，Zhang M，et al. A novel method to analyze hepatotoxic components in Polygonum multiflorum using ultraperformance liquid chromatographyquadrupole timeofflight mass spectrometry [J]. J Hazard Mater，2015，299：249.

[4]Huang P，Zhang L，Gao Y，et al. Direct reprogramming of human fibroblasts to functional and expandable hepatocytes [J]. Cell Stem Cell，2014，14（3）：370.

[5]吳宇，耿興超，汪巨峰. 四種細(xì)胞系在體外藥物性肝損傷篩選的應(yīng)用[C]. ?？冢?015年（第五屆）藥物毒理學(xué)年會(huì)，2015.

[6]Sivertsson L，Synnergren J，Jensen J，et al. Hepatic differentiation and maturation of human embryonic stem cells cultured in a perfused threedimensional bioreactor [J]. Stem Cells Dev，2013，22（4）：581.

[7]Ulvestad M，Nordell P，Asplund A，et al. Drug metabolizing enzyme and transporter protein profiles of hepatocytes derived from human embryonic and induced pluripotent stem cells [J]. Biochem Pharmacol，2013，86（5）：691.

[8]Berger D R，Ware B R，Davidson M D，et al. Enhancing the functional maturity of induced pluripotent stem cellderived human hepatocytes by controlled presentation of cellcell interactions in vitro [J]. Hepatology，2015，61（4）：1370.

[9]Sullivan G J，Hay D C，Park I H，et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells [J]. Hepatology，2010，51（1）：329.

[10]Takayama K，Kawabata K，Nagamoto Y，et al. 3D spheroid culture of hESC/hiPSCderived hepatocytelike cells for drug toxicity testing [J]. Biomaterials，2013，34（7）：1781.

[11]張怡軒，韓云波. 熒光技術(shù)在高通量藥物篩選中的應(yīng)用[J]. 中國藥學(xué)雜志，2009，44（11）：801.

[12]Fu Q，Jiang Z Z，Zhang L Y. Impairment of triptolide on liver mitochondria in isolated liver mitochondria and HL7702 cell line [J]. Chin J Integr Med，2013，19（9）：683.

[13]Wang M，Liu C X，Dong R R，et al. Safety evaluation of chinese medicine injections with a cell imagingbased multiparametric assay revealed a critical involvement of mitochondrial function in hepatotoxicity [J]. Evid Based Complement Alternat Med，2015，doi：10.1155/2015/379586.

[14]龐晶瑤，李雨萌，柏兆方，等. 基于高內(nèi)涵分析的何首烏對肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷的配伍減毒研究[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2015，17（4）：331.

[15]Mukazayire M J，Allaeys V，Buc Calderon P，et al. Evaluation of the hepatotoxic and hepatoprotective effect of Rwandese herbal drugs on in vivo （guinea pigs barbiturateinduced sleeping time） and in vitro （rat precisioncut liver slices，PCLS） models [J]. Exp Toxicol Pathol，2010，62（3）：289.

[16]Vatakuti S，Schoonen W G，Elferink M L，et al. Acute toxicity of CCl4 but not of paracetamol induces a transcriptomic signature of fibrosis in precisioncut liver slices [J]. Toxicol In Vitro，2015，29（5）：1012.

[17]回連強(qiáng)，高雙榮，劉婷，等. 基于精密肝切片技術(shù)的野百合堿體外肝毒性初步研究[J]. 中國中藥雜志，2011，36（5）：628.

[18]Szalowska E，van der Burg B，Man H Y，et al. Model steatogenic compounds （amiodarone，valproic acid，and tetracycline） alter lipid metabolism by different mechanisms in mouse liver slices [J]. PLoS ONE，2014，9（1）：e86795.

[19]Szalowska E，Stoopen G，Groot M J，et al. Treatment of mouse liver slices with cholestatic hepatotoxicants results in downregulation of Fxr and its target genes [J]. BMC Med Genomics，2013，6：39.

[20]Oorts M，Richert L，Annaert P. Druginduced cholestasis detection in cryopreserved rat hepatocytes in sandwich culture [J]. J Pharmacol Toxicol Methods，2015，73：63.

[21]Zhuang X M，Shen G L，Xiao W B，et al. Assessment of the roles of Pglycoprotein and cytochrome P450 in triptolideinduced liver toxicity in sandwichcultured rat hepatocyte model [J]. Drug Metab Dispos，2013，41（12）：2158.

[22]Shen G，Zhuang X，Xiao W，et al. Role of CYP3A in regulating hepatic clearance and hepatotoxicity of triptolide in rat liver microsomes and sandwichcultured hepatocytes [J]. Food Chem Toxicol，2014，71：90.

[23]周喆，魯燕華，孟琴. 非諾貝特對凝膠包埋培養(yǎng)的原代大鼠肝細(xì)胞的毒性[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2011，25（5）：463.

[24]Shen C，Cheng X，Li D，et al. Investigation of rifampicininduced hepatotoxicity in rat hepatocytes maintained in gel entrapment culture [J]. Cell Biol Toxicol，2009，25（3）：265.

[25]Meng Q. Threedimensional culture of hepatocytes for prediction of druginduced hepatotoxicity[J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol， 2010，6（6）：733.

[26]董春燕，馬璟. 微型中空纖維生物反應(yīng)器肝細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及其在藥物肝毒性研究中的應(yīng)用[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2009，23（2）：157.

[27]Shen C，Su G G，Meng Q. Test on hepatotoxicity of acetaminophen using gel entrapment culture of rat hepatocytes[J]. J Zhejiang Univ，2007，41（4）：700.

[28]耿興超，沈連忠，李波，等. 肝毒性生物標(biāo)志物研究進(jìn)展[J]. 中國藥學(xué)雜志，2011，46（10）：721.

[29]涂燦，蔣冰倩，趙艷玲，等. 何首烏炮制前后對大鼠肝臟的損傷比較及敏感指標(biāo)篩選[J]. 中國中藥雜志，2015，40（4）：654.

[30]陳汝家，朱俊靖，周盛梅，等. 斑馬魚模型在藥物毒性與安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J]. 毒理學(xué)雜志，2012，26（3）：224.

[31]Hill A，Mesens N，Steemans M，et al. Comparisons between in vitro whole cell imaging and in vivo zebrafishbased approaches for identifying potential human hepatotoxicants earlier in pharmaceutical development [J]. Drug Metab Rev，2012，44（1）：127.

[32]韋英杰，景莉君，詹揚(yáng)，等. 二維斑馬魚模型聯(lián)合色譜技術(shù)高效篩選中藥抗骨質(zhì)疏松活性成分的思路與方法[J]. 中國中藥雜志，2014，39（9）：1739.

[33]He J H，Guo S Y，Zhu F，et al. A zebrafish phenotypic assay for assessing druginduced hepatotoxicity [J]. J Pharmacol Toxicol Methods，2013，67（1）：25.

[34]張?jiān)疲砭S兵，王希敏，等. 采用斑馬魚模型評(píng)價(jià)對乙酰氨基酚的肝臟毒性[J]. 藥物評(píng)價(jià)研究，2013，36（5）：351.

[35]Vliegenthart A D，Starkey Lewis P，Tucker C S，et al. Retroorbital blood acquisition facilitates circulating microRNA measurement in zebrafish with paracetamol hepatotoxicity [J]. Zebrafish，2014，11（3）：219.

[36]范驍輝，趙筱萍，金燁成，等. 論建立網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)及中藥網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)研究思路[J]. 中國中藥雜志，2011，36（21）：2920.

[37]Luckert C，Hessel S，Lenze D，et al. Disturbance of gene expression in primary human hepatocytes by hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids：a whole genome transcriptome analysis [J]. Toxicol In Vitro，2015，29（7）：1669.

[38]Panigrahi G K，Yadav A，Yadav A，et al. Hepatic transcriptional analysis in rats treated with Cassia occidentalis seed：involvement of oxidative stress and impairment in xenobiotic metabolism as a putative mechanism of toxicity [J]. Toxicol Lett，2014，229（1）：273.

[39]Wei J，Zhang F，Zhang Y，et al. Proteomic investigation of signatures for geniposideinduced hepatotoxicity [J]. J Proteome Res，2014，13（12）：5724.

[40]王伽伯，肖小河，杜曉曦，等. 基于轉(zhuǎn)化毒理學(xué)的中藥肝損害客觀辨識(shí)與早期診斷[J].中國中藥雜志，2014，39（1）：5.

[41]Xing L，Wu L，Liu Y，et al. LTMap：a web server for assessing the potential liver toxicity by genomewide transcriptional expression data [J]. J Appl Toxicol，2014，34（7）：805.

[42]Watkins P B. How to diagnose and exclude druginduced liver injury [J]. Dig Dis，2015，33（4）：472.

[43]Igarashi Y，Nakatsu N，Yamashita T，et al. Open TGGATEs：a largescale toxicogenomics database [J]. Nucleic Acids Res，2015，43：D921.

[44]王艷輝，趙海平，王伽伯，等. 基于“有故無殞”思想的熟大黃對肝臟量毒/效關(guān)系研究[J]. 中國中藥雜志，2014，39（15）：2918.

[45]熊海霞，楊穎，靖衛(wèi)霞，等. 病/證狀態(tài)對附子急性毒性與藥效影響探析[J]. 世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2013，15（8）：1721.